水溶性青蒿素衍生物及其制备方法.pdf

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1、(10)授权公告号 CN 101293889 B (45)授权公告日 2010.12.22 CN 101293889 B *CN101293889B* (21)申请号 200810069848.4 (22)申请日 2008.06.20 C07D 493/18(2006.01) A61K 31/352(2006.01) A61P 35/00(2006.01) A61P 37/06(2006.01) (73)专利权人 重庆大学 地址 400044 重庆市沙坪坝区沙坪坝正街 174 号 (72)发明人 胡宗利 任彦荣 陈国平 (74)专利代理机构 重庆志合专利事务所 50210 代理人 胡荣珲 (5。

2、4) 发明名称 水溶性青蒿素衍生物及其制备方法 (57) 摘要 本发明涉及一种水溶性青蒿素衍生物及其制 备方法， 有以下步骤 ： (1)制备二氢青蒿素 ； (2)全 乙酰吡喃溴代甘露糖的制备 ； (3) 水溶性青蒿素 衍生物的制备。本发明对水溶性青蒿素衍生物进 行了结构鉴定和水溶性的分析， 证明其具有良好 的水溶性， 易于制剂， 具有成药前景。本发明操作 简单， 反应条件温和， 不需要额外的脱保护步骤。 经初步细胞实验证明， 对正常细胞无毒副作用。 (51)Int.Cl. 审查员 朱洁 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利 权利要求书 1 页 说明书 8 页 附图 1 页 C。

3、N 101293889 B1/1 页 2 1. 一种水溶性青蒿素衍生物， 具有下列通式 ： 所述 R 基团为 CH3。 2. 制备权利要求 1 所述的水溶性青蒿素衍生物的方法， 其特征在于有以下步骤 ： (1) 制备二氢青蒿素 取青蒿素、 NaBH4及无水甲醇， 室温下搅拌 24h， 滤液蒸馏， 用 250mL 水溶解后， 再用乙酸 乙酯萃取， 蒸去溶剂， 干燥得二氢青蒿素 ； (2) 全乙酰吡喃溴代甘露糖的制备 取 D- 甘露糖， 加入到醋酸酐悬浮液中， 加碘， 室温下搅拌， 得到反应混合物， 反应混合 物用二氯甲烷稀释， 冰浴冷却下加入 40溴化氢的冰醋酸溶液， 室温搅拌至反应完全， 反应。

4、 混合物用二氯甲烷稀释， 洗涤， 得到的有机层用无水硫酸钠干燥， 过滤， 得到的固体用乙醚 溶解后， 加入石油醚重结晶得全乙酰吡喃溴代甘露糖晶体 ； (3) 水溶性青蒿素衍生物的制备 取二氢青蒿素， 加入四丁基硫酸氢铵， 蒸馏水， 调整溶液的pH至8-9， 搅拌回流4h后， 向 反应体系中加入全乙酰吡喃溴代甘露糖， 冷凝回流 5h 后冷却， 过滤， 滤饼用乙醚和石油醚 重结晶， 即得权利要求 1 所述水溶性青蒿素衍生物。 3.根据权利要求2所述的制备方法， 其特征在于 ： 步骤(1)中青蒿素NaBH4无水甲 醇的摩尔比为 1 0.8 1 90 100。 4. 根据权利要求 2 所述的制备方法，。

5、 其特征在于 ： 步骤 (2) 中 D- 甘露糖醋酸酐 碘 40溴化氢的冰醋酸溶液摩尔比为 1 2 2.5 0.15 0.2 1 1.2。 5. 根据权利要求 2 所述的制备方法， 其特征在于 ： 步骤 (3) 中二氢青蒿素四丁基硫 酸氢铵全乙酰吡喃溴代甘露糖的摩尔比为 1 0.1 0.2 1.3 1.5。 6. 权利要求 1 所述的水溶性青蒿素衍生物在制备治疗宫颈癌、 肝癌、 乳腺癌的药物中 的用途。 权 利 要 求 书 CN 101293889 B1/8 页 3 水溶性青蒿素衍生物及其制备方法 技术领域 0001 本发明属于化学制药工程领域， 具体涉及一种水溶性青蒿素衍生物及其制备与应 用。

6、。 背景技术 0002 青蒿素 (artemisinin) 是 1971 年我国科学工作者从菊科植物黄花蒿 Artemisia annua L. 中提取的新型抗疟药， 具有高效、 速效、 低毒的特点， 是中国唯一被世界卫生组织 认可的按西药研究标准研究开发的植物药， 也是第一个真正得到全球公认的中药产品。但 由于青蒿素的溶解性差、 复燃率高等缺点， 限制了其临床应用。 药物化学工作者开始对青蒿 素进行了大量的结构修饰、 构效关系的研究， 并筛选出一些疗效更优良的药物， 而真正用于 临床的主要有青蒿琥酯、 青蒿甲醚、 二氢青蒿素等。 0003 青蒿素是一种新型倍半萜内酯， 具有过氧键和内酯环， 。

7、有一个包括过氧桥在内的 1， 2， 4-三恶烷结构单元， 在自然界中是非常罕见的， 它的分子中包括7个手性中心。 纯净青 蒿素为无色针状结晶， 熔点为 156-157， 易溶于氯仿、 丙酮、 乙酸乙酯和苯， 可溶于乙醇、 乙 醚， 微溶于冷石油醚， 在油中的溶解度很小， 几乎不溶于水。薄层层析为单一色斑。因其具 有特殊的过氧基团， 对热不稳定， 易受湿、 热和还原性物质的影响而分解。 0004 因此研究工作者在构效关系的指导下， 结合实验结果， 在保留过氧桥这个活性中 心的前提下， 主要对青蒿素的 12 位碳原子进行不同类别反应的修饰， 将亲脂性、 亲水性基 团引入青蒿素结构中， 以增加其油溶。

8、性、 水溶性 ； 或者将具有生理活性的大分子， 如甾体等 引入青蒿素结构中， 以增强其稳定性等等。 上个世纪七、 八十年代， 我国的科研工作者， 尤其 是5.23协作组的成员(1967年5月23日， 毛泽东下令在全国范围内开展青蒿素抗疟疾的研 究工作， 国务院专 门成立 “5.23” 办公室， 所有参与此研究工作的人员属于 5.23 协作组 )， 对青蒿素的合成及其结构修饰做了大量的工作。 后来这个课题也引起了国外研究工作者的 关注， 截止目前已经有成百上千种的青蒿素衍生物合成， 但是成功应用于临床的并不多。 0005 虽然有几个青蒿素的衍生物已经应用于临床， 被认为是低毒安全的药物。但在动 。

9、物实验中， 发现大剂量长期使用青蒿素及其衍生物时， 可出现两方面的毒理作用 ： 损害中枢 神经系统、 引起心电图的变化。 而且这些药物复燃率仍然高， 半衰期短、 口服生物利用度低。 青蒿琥酯在水中不稳定， 必须用前溶解于碳酸氢钠制成钠盐， 使用不方便。 因此对青蒿素的 结构改造工作仍有待进一步研究， 以寻找溶解性更好、 毒理作用更小的衍生物， 将对青蒿素 的临床应用和综合利用有着重要的意义。 0006 众所周知， 糖本身具有良好的溶解性能以及药理功能， 近年来在药物的修饰中成 为研究的热点领域。 人们可以利用糖毒性小、 结构新颖多样、 靶向性好等特点对一些具有生 物活性的基团或先导化合物进行结。

10、构修饰， 希望通过相互的协同作用提高药物疗效、 降低 毒副作用、 提高亲合性、 增加生物利用度， 以寻找和开发新药。 0007 以糖及其衍生物为基团对有生物活性的物质进行化学修饰的研究始于上世纪 80 年代。 如将一些水不溶解物质经与糖结合转变成糖苷， 水溶解性增高， 糖苷的这种性质对除 说 明 书 CN 101293889 B2/8 页 4 去动物体内许多具有毒性的苯酚化合物很重要， 这些苯酚化合物转变成糖苷后， 能被水溶 解， 并与尿一并排出体外。许多糖苷药品就是利用这个性质， 增强溶解性， 降低毒性。 发明内容 0008 本发明的目的， 是提供一种水溶性青蒿素衍生物及其制备方法。本发明用。

11、糖对青 蒿素进行修饰， 得到的水溶性青蒿素衍生物可以提高青蒿素的衍生物水溶性和降低毒副作 用， 并且易于制剂， 具有成药前景。 本发明操作简单， 反应条件温和， 不需要额外的脱保护步 骤。经初步细胞实验证明， 对正常细胞无毒 副作用。 0009 本发明水溶性青蒿素衍生物具有下列通式 ： 0010 0011 其中 R CH3。所述水溶性青蒿素衍生物的化学名称为 (3R， 5aS， 6R， 8aS， 9R， 12S， 12aR)-八氢-3， 6， 9-三甲基-3， 12-桥氧-12H-吡喃并4， 3-j-1， 2-苯并二塞平-10-O-甘 露糖基 (D- 甘露糖 - 青蒿素 )， 分子式 C21H。

12、34O10， 分子量为 446.51。 0012 本发明对糖基进行保护 ( 制备全乙酰吡喃溴代甘露糖 )， 完成了对青蒿素的羰基 的还原， 制备了二氢青蒿素， 再与全乙酰吡喃溴代甘露糖发生醚合成反应， 得到水溶性青蒿 素衍生物， 其总收率为 20.5。 0013 本发明的水溶性青蒿素衍生物制备方法包括两个主体部分， 一部分为通过糖基的 全乙酰保护使其带一个 -Br， 另一部分是将上述还原产物二氢青蒿素与单糖在相转移催化 剂催化下醚化得到新的糖基化青蒿素产物。 0014 本发明还对水溶性青蒿素衍生物进行了结构鉴定和水溶性的分析， 证明其具有良 好的水溶性。 0015 本发明采用化学方法对青蒿素进。

13、行糖基化修饰。 在利用化学方法对药物进行糖基 修饰过程中， 控制反应的区域选择性和立体选择性是两个基本而关键的问题。而保护和去 保护是提高区域选择性和立体选择性的重要方法。在糖苷的合成中， 为了将糖环上定位地 引入形成糖苷键， 首先必须对糖环的各个羟基用不同性质的保护基团进行保护， 然后再逐 次选择性地脱去保护基团并分别先后 定位地引入糖基。 0016 选择合适的糖基保护方法 ： 最为有效的糖基方法主要有乙酰基保护和糖与丙酮在 催化剂 ( 如高氯酸、 硫酸、 盐酸、 对甲苯磺酸和氯化锌等 ) 作用下即可得到异丙叉缩酮。本 发明采用了乙酰基保护法， 并且通过红外图谱初步检测发现在水解作用下， 保。

14、护基团即可 说 明 书 CN 101293889 B3/8 页 5 水解掉， 不需要额外的脱保护步骤， 操作简便， 其具体操作如下 ： 0017 乙酰基保护法 ： 取 2.00 克的 D- 葡萄糖加入到装有 10mL 醋酸酐的悬浮液的三颈 瓶中， 加入135mg碘， 室温磁力搅拌反应至反应体系呈棕色透明(表明全乙酰化反应完成约 5 30min)， 然后将反应混合物用 50mL 干燥的二氯甲烷稀释， 冰浴冷却下加入 40溴化氢 的冰醋酸溶液 14mL。加毕室温搅拌反应至 TCL 检测反应完毕 ( 约需 1 6h)。反应混合物 用150mL二氯甲烷稀释， 依次用冰水(60mL2)、 饱和碳酸氢钠溶。

15、液(50mL2)、 稀硫代硫酸 钠溶液 (0.4mol/L， 50mL2) 洗涤。有机层用无水硫酸钠干燥， 过滤， 滤液减压蒸馏浓缩得 白色固体。用乙醚溶解后， 向其中加入石油醚重结晶得白色针状晶体。 0018 在糖基保护之后， 将糖如何引入到青蒿素分子中也是合成的一个关键步骤。乙酰 糖与青蒿素反应是在碱催化下的水 - 有机两相反应， 其中最为重要是相转移催化剂的选 择， 本文以乙酰葡萄糖为例考察了不同的相转移催化剂， 结果如下表 ： 0019 相转移催化剂对反应的影响 0020 0021 - ： 无目标产物生成 ； + ： 少量目标产物生成 ； + ： 大量目标产物生成 0022 不同的相转。

16、移催化剂催化反应经 TLC 分析生成目标产物的量存在较大差异。其中 四丁基硫酸氢铵为相转移催化剂效果最为理想， 因此选用四丁基硫酸氢铵作相转移催化剂 催化乙酰糖与二氢青蒿素的醚化反应。 0023 本发明通过对青蒿素糖基化产物结构的鉴定， 以确认糖基确实引入到青蒿素分 子， 并且通过糖基修饰青蒿素可以提高其母体的水溶性。 0024 本发明所述的水溶性青蒿素衍生物可以与药物载体一起组成药物制剂进行使用， 经检测本发明所述青蒿素衍生物的水溶性， 结果表明， 所述青蒿素衍生物具有良好的水溶 性。 对正常细胞的生长抑制作用很小， 毒副作用很小， 可以用于制备治疗宫颈癌、 肝癌、 乳腺 癌和治疗人体免疫功。

17、能亢进引起的疾病的药物。 0025 本发明的优点是 ： 0026 一方面， 青蒿素与糖同样有着突出的生物活性， 都在生命过程中扮演非常重要的 角色， 在有些方面表现出相似或相近的性质， 如糖及其衍生物能与细胞膜表面上的糖蛋白 或糖脂类受体分子结合， 而青蒿素则与位于细胞核上的青蒿素受体结合 ； 二者同在抗肿瘤、 抗菌方面有良好的效果等。可以预期， 青蒿素与糖的结合能很好的发挥二者的协同作用。 说 明 书 CN 101293889 B4/8 页 6 0027 第二方面， 青蒿素与糖在其他性质方面也可以有效互补， 如糖有良好的水溶性， 而 青蒿素水溶性差， 二者的结合可以赋予青蒿素或糖及其衍生物以。

18、新的物理和化学特性， 从 而改变分子极性、 溶解性及吸收代谢以提高药物分子的活性， 降低毒副作用等。 青蒿素也可 激活糖的生物活性， 增强糖的生物和药用价值。 0028 第三方面， 在细胞表面的大量受体分子几乎都是糖蛋白或糖脂类， 因而青蒿素与 糖的结合必然具有很强的靶向性， 可以选择性的靶向给药， 解决青蒿素药物治疗选择性差 的棘手问题， 减少对身体其他组织的损伤， 增加药物的生物利用度， 提高疗效， 减低毒副作 用， 还可缓慢释放药物作用基团， 起到控制或缓释作用。 0029 本发明所述水溶性青蒿素衍生物的合成， 合成思路新颖， 产物结构特殊， 为青蒿素 衍生物的合成以及其他活性药物的糖基。

19、化修饰提供了新的思路。 0030 附图说明 0031 图 1 为青蒿素还原的示意图 Artemisinin reduction reaction ； 0032 图 2 为 水 溶 性 青 蒿 素 衍 生 物 的 合 成 示 意 图 Synthetic route of D-mannose-artemisinin。 0033 具体实施方式 0034 材料 ： 0035 D- 甘露糖购于国药集团化学试剂， 化学纯 0036 NaBH4及无水甲醇、 乙酸乙酯购于国药集团化学试剂厂， 均为化学纯 0037 青蒿素标准品购于中国药品生物制品检定所 0038 醋酸酐、 碘、 二氯甲烷(99.0)、 四丁基。

20、硫酸氢铵购于国药集团化学试剂厂， 均 为化学纯 0039 溴化氢冰醋酸溶液 (40， 工业级 )， 购自潍坊汇博进出口有限公司 0040 201D-II 型旋转蒸发仪 郑州长城科工贸有限公司 0041 2XZ-1 型旋片式真空泵 浙江黄岩求精真空泵厂 0042 X-4 数字显微熔点测定仪 北京福凯仪器有限公司 0043 2F-2 型三用紫外线分析仪 上海安亭电子仪器厂 0044 SHB-III A 循环水式多用真空泵 郑州长城科工贸有限公司 0045 DF-101T 型集热式恒温加热磁力搅拌器 江苏金坛市虹盛实验仪器厂 0046 注 ： H1NMR 由 Varian INOVA-400 型核磁。

21、共振仪测定 (CDCl3作溶剂， TMS 作内标， 化 学位移 以 ppm 为单位 ) ； MS 由 Finnigan-MAT 4510 型质谱仪测定 (EI) ； IR 由美国热电 Varon 傅立叶红外光谱仪测定 (KBr 压片法 ) 0047 IMDM 培养基 美国 Gibco 公司 0048 无水乙醇 成都华西生物制品厂， 分析纯 0049 台盼蓝 上海化学试剂厂， 分析纯 0050 胰酶 Sigma 公司产品 0051 蛋白酶 K Sigma 公司产品 0052 新生小牛血清 Sigma 公司产品 0053 小鼠成纤维 (3T3) 细胞， 猴肾 (vero) 细胞均购自众磊 ( 北京。

22、 ) 生物科技发展有限 公司驻沪办。 说 明 书 CN 101293889 B5/8 页 7 0054 净化工作台 蚌埠产水平式双人超净工作台 0055 水平式离心机 北京医用离心机厂 (LD4-2A) 0056 AEL-40SM 电子天平 日本岛津 0057 CO2培养箱 日本平泽公司生产 CPD-172 型 0058 Whatman 3mm 滤纸 USA 0059 倒置相差显微镜 日本 Olymmpus 0060 4冷室 日本 SANYO(MLC) 0061 -80冰箱 日本 SANYO 0062 自动纯净水蒸馏器 上海亚容生化仪器厂 0063 Hamilton 微量注射器 辽宁中山医疗器。

23、械厂 0064 96 孔培养板 Denmark 0065 25cm2培养瓶 Denmark 0066 75cm2培养瓶 Denmark 0067 各种国产玻璃器材 ： 如吸管、 试管、 离心管、 培养瓶、 培养皿、 配液瓶等等， 均需经过 高温灭菌处理。 0068 实施例 1 ： 青蒿素的还原 0069 在 25mL 三颈瓶中加入 2.81g(0.01mol) 青蒿素、 0.454g(0.012mol)NaBH4及 10mL 无水甲醇室温下搅拌 24h。滤液减压蒸馏回收甲醇。残液用 250mL 水溶解， 然后用 50mL 乙 酸乙酯萃取三次， 有机层用少量水洗涤， 水洗液及水层合并。再用乙酸乙。

24、酯萃取， 合并有机 层。蒸去溶剂， 干燥得产品 - 二氢青蒿素 ( 见图 1) ； 0070 实施例 2. 全乙酰吡喃溴代甘露糖的制备 0071 取 2.00 克 D- 甘露糖加入到装有 10mL 醋酸酐的悬浮液的三颈瓶中 ( 其中醋酸 酐保护糖分子上的羟基， 使其变成稳定的酯 )， 加入 135mg 碘， 室温磁力搅拌反应至反应体 系呈棕色透明 ( 表明全乙酰化反应完成约 5-30min)， 然后将反应混合物用 50mL 干燥的二 氯甲烷稀释， 冰浴冷却下加入 40溴化氢的冰醋酸溶液 14mL( 加入溴化氢， 使糖分子带 一个 -Br)。加毕室温搅拌反应至 TCL 检测反应完毕 ( 约需 1。

25、-6h)。反应混合物用 150mL 二氯甲烷稀释， 依次用冰水 (60mL2)、 饱和碳酸氢钠溶液 (50mL2)、 稀硫代硫酸钠溶液 (0.4mol/L， 50mL2) 洗涤。有机层用无水硫酸钠干燥， 过滤， 滤液减压蒸馏浓缩得白色固 体。用乙醚溶解后， 向其中加入石油醚重结晶， 得白色针状晶体 - 全乙酰吡喃溴代甘露糖晶 体。 0072 实施例 3.D- 甘露糖 - 青蒿素的制备 ： 0073 参见图 2。向装有磁力搅拌器的 100mL 三颈瓶内加入实施例 1 得到的青蒿素还原 产物二氢青蒿素 1.354g， 四丁基硫酸氢铵 0.2g( 四丁基硫酸氢铵是相转移催化剂 )， 蒸馏 水 50m。

26、L， 加入氢氧化钾 0.134g， 调整溶液的 pH 为 8-9。搅拌回流 4h 后， 向反应体系中加入 1.62g 实施例 2 所述全乙酰吡喃溴代甘露糖， 冷凝回流 5h 后冷却， 过滤， 滤饼用乙醚和石油 醚重结晶， 即得本发明所述水溶性青蒿素衍生物 -D- 甘露糖 - 青蒿素。 0074 实施例 4 ： D- 甘露糖 - 青蒿素的结构表征 ： 0075 本实施例采用核磁共振、 质谱和红外光谱对 D- 甘露糖 - 青蒿素的结构进行鉴定 ： 0076 核磁共振 ： 1H NMR(CDCl3， 300MHz) ： 1.800.82(m， 20H， CH3， CH orCH2)， 2.19(m，。

27、 说 明 书 CN 101293889 B6/8 页 8 1H， CH)， 2.51(s， 4H， OH)， 3.33 3.25(m， 4H， CH or CH2)， 4.90 4.40(m， 1H， CH)， 6.25 6.37(m， 2H， CH) ； 0077 质谱 ： LC-MS(APCI ： CHCl3)m/z( ) ： 445.49(M-1+， 100) ； 0078 红外光谱 ： IR(KBr cm-1)3379(O-H stretching)， 2946， 2924(CH3， CH or CH2 sp3C-H stretching)， 1092， 1026， 1014(C-O 。

28、stretching)。 0079 以上分析数据表明， 合成产物的结构与所设计产物的结构吻合。 0080 实施例 5.D- 甘露糖 - 青蒿素的水溶性 ： 0081 精确称取 25干燥至恒重的青蒿素标准品 10mg 置 100mL 容量瓶中， 用 95乙醇 稀释至刻度。分别吸取 0， 2， 4， 6， 8， 10mL 于 50mL 容量瓶中， 以 95乙醇补充至 10mL， 补加 0.2NaOH溶液至刻度， 置(501)水浴中微温30min， 冷水冷却至室温。 另取乙醇10mL， 用同一种方法加碱处理后， 作为空白。分别在 292nm 处测吸光值， 得到标准曲线的线性回归 方程 ： 0082 。

29、C 1.05138A+0.0105983(mg/50mL)， 相关系数为 0.999。 0083 将足够量的青蒿素及 D- 甘露糖 - 青蒿素溶于相应 pH 的缓冲水溶液中， 25恒温 下， 超声分散约 40min， 离心沉降除去溶液中的不溶物， 取上层清液， 即为 25下的饱和溶 液。饱和溶液经适当稀释后， 在 292nm 处测其吸光度值， 代入上述的方程计算得出饱和溶液 的浓度， 结果见表 2.1。 0084 D- 甘露糖 - 青蒿素在不同 pH 缓冲水溶液中的溶解度 (mgmL-1) 0085 0086 结果表明 ： 用不同的糖对青蒿素修饰之后， 水溶性得到了提高。 经糖修饰后青蒿素 的。

30、水溶解性在碱性范围比酸性范围好， 在 pH 为 4 的酸性环境中难溶， 随着 pH 的升高水溶性 提高， 在 pH 为 9.18 的水溶性均高于 pH6.86。青蒿素被糖修饰后， 由于糖基的引入， 多羟基 的亲水特性可使得整个分子溶解性能显著提高。由于糖带有多羟基， 有弱酸性， 随着 pH 升 高溶解度有所提高。 0087 实施例 6 ： D- 甘露糖 - 青蒿素对正常细胞的抑制作用 0088 (1) 配制药物工作浓度根据参考文献， 药物浓度可采用等比间隔， 选用 10、 20、 40、 80、 160、 320mol/L 作为实验浓度。将上述合成的 D- 甘露糖 - 青蒿素的原液用 IMDM。

31、 培养 液稀释成浓度分别为 10、 20、 40、 80、 160、 320mol/L 的工作液。 0089 (2) 接种细胞取对数生长期小鼠成纤维 3T3 细胞、 猴肾 vero 细胞分别用 0.25胰 蛋白酶消化单层培养细胞， 用10IMDM完全培养基配成单个细胞悬液。 进行细胞计数后， 按照 5104个 / 孔的密度接种于 96 孔培养板中， 每孔体积 200L。将培养板移入 CO2培 养箱中， 在 37 5 CO2饱和湿度的条件下培养 24 小时。 0090 (3) 加药待上述细胞完全贴壁生长后， 将培养液吸弃， 换上含有不同浓度的 D- 甘 说 明 书 CN 101293889 B7。

32、/8 页 9 露糖 - 青蒿素的培养基 (10、 20、 40、 80、 160、 320mol/L) 和青蒿素培养基 (40mol/L)， 继 续培养 8， 12， 24， 48， 72 小时， 各浓度分别设计 4 个复孔。 0091 (4) 呈色在培养结束前 4 小时， 每孔加入 MTT 溶液 20L。继续孵育 4 小时， 终止 培养。 小心吸弃孔内培养上清液后， 每孔加入150L DMSO， 振荡均匀， 使结晶物充分溶解。 0092 (5) 比色选择 490nm 波长， 在自动酶标仪上检测各孔吸光度值 (OD 值 )， 记录结果。 ( 实验重复三次 ) 0093 (6) 按下式计算各种浓。

33、度药物对细胞的增殖抑制活性 0094 相对抑制率(对照孔平均OD值-加药孔平均OD值)/对照孔平均OD值100 0095 (7)统计分析用SPSS 10.0 for windows统计软件处理。 检测数据以均数标准 差 (xs) 表示， 并采用方差分析及 t 检验， P 0.05 表示无显著性差异， P 0.05 表示有 显著性差异。 0096 D- 甘露糖 - 青蒿素作用于 3T3 细胞 48h 的抑制率测定 (， xs) 0097 0098 P 0.05 0099 D- 甘露糖 - 青蒿素作用于 vero 细胞 48h 的抑制率的测定 (， xs) 0100 0101 P 0.05 010。

34、2 考察了青蒿素及 D- 甘露糖 - 青蒿素对正常细胞 3T3 和 vero 的增殖抑制影响。阳 说 明 书 CN 101293889 B8/8 页 10 性对照青蒿素 (40mol/L) 对正常细胞的生长无明显抑制作用， 毒副作用较小， 从结果的 统计分析得出， D- 甘露糖 - 青蒿素与青蒿素相比， 无显著性差异 (P 0.05)。 0103 结论 ： 0104 目前青蒿素的化学修饰还停留在简单小分子取代的水平上， 还没有涉及到一些大 分子对青蒿素化合物的修饰。近年来对中药单体化合物的糖基化研究较为活跃， 也展示出 比较突出的功能活性。因此， 本发明对青蒿素进行糖基化修饰， 会有更加广阔的前景。随 着人们对多糖类物质的研究越来越深入， 多糖与青蒿素结合可能会达到事半功倍的效果。 同时， 与其他已知的和将来新发现的活性物质结合， 以期望产生共效、 促效作用， 从而获得 “me-too” 和 “me-better” 的优化产物。 说 明 书 CN 101293889 B1/1 页 11 图 1 图 2 说 明 书 附 图 。