一种安达喜盐芽孢杆菌耐盐碱基因rdd及其鉴定方法.pdf

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1、(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201710731793.8 (22)申请日 2017.08.23 (71)申请人 东北农业大学 地址 黑龙江省哈尔滨市香坊区长江路600 号 (72)发明人 姜巨全邵丽孟琳陈金 王利丹李金城闫明雪 (74)专利代理机构 成都环泰知识产权代理事务 所(特殊普通合伙) 51242 代理人 邹翠李斌 (51)Int.Cl. C12N 15/31(2006.01) C12N 15/70(2006.01) C12N 1/21(2006.01) C07K 14/195(2006.01) C。

2、05F 11/08(2006.01) C05G 3/04(2006.01) A01H 5/00(2018.01) C12R 1/19(2006.01) (54)发明名称 一种安达喜盐芽孢杆菌耐盐碱基因rdd及其 鉴定方法 (57)摘要 本发明属于分子生物学和基因工程技术领 域， 公开了一种安达喜盐芽孢杆菌耐盐碱基因 rdd及其鉴定方法， 一安达喜盐芽孢杆菌耐盐碱 基因rdd， 含一个534bp的完整开放阅读框ORF， ORF的核苷酸序列为SEQIDNO.1； 鉴定方法包 括： 筛选技含有耐盐碱相关的基因片段， 构建含 有rdd基因的原核表达载体； 通过化转异源宿主 Escherichiacol。

3、iKNabc， 将基因rdd导入KNabc 宿主中， 对基因rdd生理功能及编码的蛋白活性 进行鉴定。 本发明所提出的rdd基因对盐碱地土 壤改良具有重要意义， 可用于构建高的效耐盐碱 工程菌、 开发微生物肥料和提高植物耐盐碱性的 转基因领域的研究。 权利要求书1页 说明书10页 附图8页 CN 107641629 A 2018.01.30 CN 107641629 A 1.一种安达喜盐芽孢杆菌耐盐碱基因rdd， 其特征在于， 所述安达喜盐芽孢杆菌耐盐碱 基因rdd， 含一个完整开放阅读框ORF， ORF的核苷酸序列为SEQ ID NO.1。 2.一种利用权利要求1所述安达喜盐芽孢杆菌耐盐碱基。

4、因rdd编码的蛋白， 核苷酸序列 为SEQ ID NO.2。 3.如权利要求2所述的蛋白， 其特征在于， 所述蛋白在荧光猝灭实验中具有Na+(Li+、 K +)/H+逆向转运蛋白活性， 且Na+(Li+、 K+)/H+逆向转运蛋白活性具有pH依赖性。 4.一种如权利要求1所述安达喜盐芽孢杆菌耐盐碱基因rdd的鉴定方法， 其特征在于， 所述安达喜盐芽孢杆菌耐盐碱基因rdd的鉴定方法包括以下步骤： (1)通过基因文库与基因功能互补相结合的筛选技术， 从安达喜盐芽孢杆菌中获得含 有耐盐碱相关的基因片段， 所述的耐盐碱相关的基因片段中含有一个长534bp的rdd基因的 完整开放阅读框ORF， ORF的。

5、核苷酸序列如SEQ ID NO.1； (2)构建含有rdd基因的原核表达载体； (3)通过化转异源宿主Escherichia coli KNabc， 将基因rdd电击转化的方法导入至 KNabc宿主中， 对基因rdd生理功能及编码的蛋白活性进行鉴定。 5.如权利要求4所述安达喜盐芽孢杆菌耐盐碱基因rdd的鉴定方法， 其特征在于， 构建 含有rdd基因的原核表达载体， 包括原核表达载体pET28b-rdd， pET22b-rdd； 所述原核表达 载体pET28b-rdd， pET22b-rdd的构建方法包括： 根据rdd基因序列， 首先利用Primer5软件设计rdd-F/rdd-R特异引物， 。

6、并在基因的5 和 3 端分别引入Nde I、 XhoI两个酶切位点， 然后进行rdd基因的PCR扩增， 对Rdd基因进行亚克 隆； 将PCR扩增产物加A纯化后连接到克隆载体pEASY-T3上， 化转到Trans1-T1感受态细胞 中， 将转化产物进行蓝白斑筛选； 用限制性内切酶进行酶切鉴定pEASYRdd重组质粒； 为进一步确定序列的准确性， 对连 接到克隆载体pEASY-T3上的插入片段进行测序。 6.如权利要求5所述安达喜盐芽孢杆菌耐盐碱基因rdd的鉴定方法， 其特征在于， 所述 对Rdd基因进行亚克隆， 包括： RDD亚克隆NdeI-XhoI建到pET28bNdeI-XhoI， 然后用B。

7、glII-XhoI， 构建到pET22， 化转至 大肠杆菌KNabc中， 获得重组质粒pET22b-Rdd,对插入安达喜盐芽孢杆菌耐盐碱基因rdd片 段进行双酶切验证， 酶切结果正确的质粒进行基因测序。 7.一种利用权利要求1所述安达喜盐芽孢杆菌耐盐碱基因rdd构建的具有Na+(Li+)/H+ 逆向转运蛋白。 8.一种利用权利要求1所述安达喜盐芽孢杆菌耐盐碱基因rdd构建的耐盐碱工程菌。 9.一种利用权利要求1所述安达喜盐芽孢杆菌耐盐碱基因rdd制备的开发微生物肥料。 10.一种利用权利要求1所述安达喜盐芽孢杆菌耐盐碱基因rdd制备的耐盐碱性的转基 因植物。 权利要求书 1/1 页 2 CN 。

8、107641629 A 2 一种安达喜盐芽孢杆菌耐盐碱基因rdd及其鉴定方法 技术领域 0001 本发明属于分子生物学和基因工程技术领域， 尤其涉及一种安达喜盐芽孢杆菌耐 盐碱基因rdd及其鉴定方法。 背景技术 0002 随着全球气候变暖， 干旱半干旱区土壤盐渍化日益严重， 具体表现为盐渍 化土地 面积不断扩展， 盐渍化程度日益加剧， 重度盐渍化土地呈增长趋势， 无 利用价值碱斑面积 扩大， 严重影响土地生产力提高和国民经济发展。 目前世界 上有100多个国家存在不同类 型盐碱地10亿hm2， 约占全球可耕地面积的10。 我国盐碱地面积达9913万hm2， 主要分布在 华北、 西北和东北等干旱。

9、、 半干旱 地区。 我国东北西部松嫩平原有盐碱地面积370余万hm2， 是世界上三大苏打盐 碱地集中分布区之一。 同时， 由于工业污染、 不合理灌溉和化肥使用 不当等原 因， 次生盐碱化土壤面积也在迅速增加。 盐碱地影响植被生长， 使农作物减产 或 绝收， 间接造成生态环境恶化。 0003 目前认为实现盐碱地土壤改良需要多学科共同攻关才能得以完成。 从生物学角 度， 主要的方法则是从微生物和植物同时入手， 高效耐盐微生物与植物协同作用。 研究表明 固氮菌、 根瘤菌等微生物肥料的施用与化学肥料相比， 在促进高效耐盐碱植物改良盐碱地 土壤方面， 效果更加明显。 但很多植物无法直接获得盐碱地贫瘠的碳。

10、氮源， 且只施用化学肥 料则会造成更严重的环境灾难。 0004 可用于土壤改良的微生物肥料和植物却不具有抵抗高盐碱的能力， 这成了目前技 术的难题。 因此， 除了发掘高效耐盐碱的微生物和植物资源以外， 规模化地发掘高效耐盐碱 的新功能基因用以构建相应基因工程菌株微生物肥料和转基因植物显得尤为重要。 0005 在原核生物中， Na+依赖性的转运蛋白是Na+/H+逆向转运蛋白， 次级转运体可以促 进钠离子的排出和质子的进入， 因此在碱性条件下来调控钠离子和pH 的稳态。 由于Na+/H+ 转运蛋白同时具有Li+/H+转运蛋白活性， 它们也被称为Na+(Li+)/H+逆向转运蛋白。 其中有 些报道显。

11、示出同时具有K+/ H+逆向转运蛋白。 由于大肠杆菌的ant基因首次发现影响宿主 的Na+/H+ 逆向转运蛋白活性因此命名为nhaA， Na+(Li+)/H+逆向转运蛋白基因或具有Na+ (Li+)/H+逆向转运蛋白活性在大肠杆菌突变体缺少两个或三个逆向转运蛋白的EP432或 KNabc中越来越多被克隆和功能鉴定。 结合编码基因的数量和底物的特异性， Na+/H+逆向转 运蛋白分为两大类： 一类Na+/H+逆向转运蛋白主要用于Na+和Li+的底物由单个基因编码， 例如nhaA， nhaB， nhaC， nhaD， nheE， napA， nhaP， nhaG或nhaH， 均分为单价阳离子/质子。

12、逆向 转运蛋白1型家族(CPA-1)家族与NapA K+/H+逆向转运蛋白高度一致， 分为CPA-2 家族。 另 一类具有底物的单价阳离子/质子逆向转运蛋白对于Na+和Li+， 有时用于K+， 由含有六个或 七个基因的多顺反子操纵子编码， 命名为， 如mrp， mnh， pha2或sha， 它们分组为CPA-3家族 由于其独特的多基因结构性质。 除了上述两个主要类别之外， 还有一些非特异性Na+/H+逆 向转运蛋白也不断显示出Na+/H+逆向转运蛋白活性。 例如， 据报道， 分类为CPA-1家族的 ChaA 具有Ca2+(Na+)/H+和K+/H+逆向转运蛋白活性。 MleN， 一种新型HCT。

13、 (2-羟基-羧酸酯 说明书 1/10 页 3 CN 107641629 A 3 转运体)家族转运蛋白， 呈现出Na+/H+逆向转运蛋白活性同时具有交换细胞质乳酸盐和周 质的苹果酸盐的活性。 一个独特的四环素/H +逆向转运蛋白， TetA(L)， 属于MF(major facilitator)家族， 一个初级的 Na+泵， Nap属于NDH(NADH脱氢酶)家族被报道具有Na+/H+ 逆向转运蛋白活性。 大肠杆菌多药耐药(MDR)蛋白， MdfA属于具有广泛特异性MDR表型的 MF 家族也被表征为显示Na+(K+)/H+逆向转运蛋白活性。 推定的配对小多药抗性(PSMR)家族蛋 白PsmrA。

14、B作为YvdSR的同系物， 其特征在于主要作为新型双组分Na+/H+逆向转运蛋白。 0006 所以， 对抗盐基因的分离是当前利用基因工程方法进行抗盐作物培育的首要任 务。 0007 综上所述， 现有技术存在的问题是： 0008 目前技术缺陷在于可用于土壤改良的微生物肥料和植物不具备高效的耐盐碱的 能力， 并在规模化地发掘高效耐盐碱的新功能基因用以构建相应基因工程菌株微生物肥料 和转基因植物方面缺乏理论依据， 且在进行抗盐作物培育方面缺乏有效的鉴定方法。 发明内容 0009 针对现有技术存在的问题， 本发明提供了一种安达喜盐芽孢杆菌耐盐碱基因rdd 及其鉴定方法。 利用构建基因文库的创新技术手段。

15、， 发现一种高效的安达喜盐芽孢杆菌耐 盐碱基因rdd， 所述安达喜盐芽孢杆菌耐盐碱基因rdd， 含一个完整开放阅读框ORF， ORF的核 苷酸序列为SEQ ID NO.1， 并通过新型基因工程手段构建高效耐盐菌株， 从而培育高效土壤 改良微生物和植物。 0010 本发明的另一目的在于提供一种利用上述安达喜盐芽孢杆菌耐盐碱基因 rdd编 码的蛋白， 核苷酸序列为SEQ ID NO.2。 0011 进一步功能验证显示， 所述蛋白在荧光猝灭实验中具有Na+(Li+、 K+)/H+逆向转运 蛋白活性， 且Na+(Li+、 K+)/H+逆向转运蛋白活性具有pH依赖性。 0012 本发明的另一目的在于提供。

16、一种安达喜盐芽孢杆菌耐盐碱基因rdd的鉴定方法包 括以下步骤： 0013 (1)通过基因文库与基因功能互补相结合的筛选技术， 从安达喜盐芽孢杆菌中获 得含有耐盐碱相关的基因片段， 所述的耐盐碱相关的基因片段中含有一个长534bp的rdd基 因的完整开放阅读框ORF， ORF的核苷酸序列如SEQ ID NO.1； 0014 (2)构建含有rdd基因的原核表达载体； 0015 (3)通过化转异源宿主Escherichia coli KNabc， 将基因rdd电转化的方法导入至 KNabc宿主中， 对基因rdd生理功能及编码的蛋白活性进行鉴定。 0016 进一步， 构建含有rdd基因的原核表达载体，。

17、 包括原核表达载体pET28b-rdd， pET22b-rdd； 所述原核表达载体pET28b-rdd， pET22b-rdd的构建方法包括： 0017 根据rdd基因序列， 首先利用Primer5软件设计rdd-F/rdd-R特异引物， 并在基因的 5 和3 端分别引入Nde I、 XhoI两个酶切位点， 然后进行rdd基因的 PCR扩增， 对Rdd基因进 行亚克隆； 0018 将PCR扩增产物加A纯化后连接到克隆载体pEASY-T3上， 化转到Trans1-T1 感受态 细胞中， 将转化产物进行蓝白斑筛选； 0019 用限制性内切酶进行酶切鉴定pEASYRdd重组质粒； 为进一步确定序列的。

18、准确性， 说明书 2/10 页 4 CN 107641629 A 4 对连接到克隆载体pEASY-T3上的插入片段进行测序。 0020 进一步， 所述对Rdd基因进行亚克隆， 包括： 0021 RDD亚克隆NdeI-XhoI建到pET28bNdeI-XhoI， 然后用BglII-XhoI， 构建到pET22， 化 转至大肠杆菌KNabc中， 获得重组质粒pET22b-Rdd,对插入安达喜盐芽孢杆菌耐盐碱基因 rdd片段进行双酶切验证， 酶切结果正确的质粒进行基因测序。 0022 本发明的另一目的在于提供一种利用上述安达喜盐芽孢杆菌耐盐碱基因 rdd构 建的具有Na+(Li+)/H+逆向转运蛋白。

19、。 0023 本发明的另一目的在于提供一种利用上述安达喜盐芽孢杆菌耐盐碱基因rdd构建 的耐盐碱工程菌。 0024 本发明的另一目的在于提供一种利用上述安达喜盐芽孢杆菌耐盐碱基因rdd制备 的开发微生物肥料。 0025 本发明的另一目的在于提供一种利用上述安达喜盐芽孢杆菌耐盐碱基因 rdd制 备的耐盐碱性的转基因植物。 0026 本发明的优点及积极效果为： 0027 本发明基于基因文库筛选法并结合钠离子耐受性功能互补法， 从安达喜盐芽孢杆 菌的基因组中随机筛选有关Na+输出的相关基因， 并通过测序分析及生理生化实验来进一 步确定有价值的基因， 通过对其离子转运功能的鉴定和自身蛋白的定位和分析，。

20、 初步验证 该基因的离子转运机制， 从而获得一个新型的Na+/H+ 逆向转运蛋白。 本发明的Ha_RDD是新 型的首次被挖掘和鉴定的新型Na+/H+ 逆向转运蛋白， 高效地构建耐盐碱菌株， 成功率高达 百分之百， 且该方法节约 60的技术成本。 0028 本发明与传统技术相比， 首次公开安达喜盐芽孢杆菌耐盐碱基因鉴定及其用途， 从此菌中获取并具有序列表中SEQID NO.1所示的核苷酸序列， 并能够获得含有该基因的重 组载体和宿主细胞， 本发明所提出的rdd基因对盐碱地土壤改良具有重要意义， 获得了高效 耐盐碱工程菌、 开发微生物肥料和提高植物耐盐碱性的转基因领域的技术效果。 0029 本发明。

21、从分子生物学和基因工程技术出发， 构建高效耐盐碱的基因工程菌株以及 转基因植物， 由此获得用于土壤改良的耐盐碱微生物和植物。 由于细菌与植物在耐盐碱方 面有很大的相似性， 它们在高渗条件下， 均在细胞内积累相似的化合物。 因此， 高效耐盐碱 细菌资源库的构建及关键新功能基因的发掘， 不仅可以解决构建耐盐碱细菌基因工程菌株 的问题， 而且优良的高效耐盐碱细菌基因可以为构建高效耐盐碱转基因植物提供重要基因 资源储备， 这就是本发明的核心价值所在。 附图说明 0030 图1是本发明实施例提供的安达喜盐芽孢杆菌耐盐碱基因rdd的鉴定方法流程图。 0031 图中： A.蛋白的跨膜区预测； B.蛋白的疏水。

22、性分析。 0032 0033 图2是本发明实施例提供的Ha_rdd基因原核表达载体pET-22b-rdd的构建流程图； 0034 图3是本发明实施例提供的构建Ha_rdd基因表达载体的电泳检测图； 0035 图中： A.Ha_rdd基因PCR产物电泳结果(第1-6泳道为rdd PCR产物)； B. pEASY-T3- rdd； C.pEASY-rdd鉴定结果(1、 2:pEASY-rdd digested by EcoRI,3、 4： pEASY-T3digested 说明书 3/10 页 5 CN 107641629 A 5 by EcoRI as control)； D.pEasy-T3-。

23、rdd digested by NdeI-XhoI； E.1-4:pET-28b-RDD， 5:pET-28b对照； F.1:pET-28b-RDD digested by XhoI and NdeI 2:pET-28b酶切对照； G.1:pET-22b对照2、 3、 4、 5： pET-22b-RDD； H.pET-22b-rdd酶切鉴定(1:pET-22b酶切对照2、 3、 4、 5： pET-22b-RDD digested by BglII-XhoI)。 0036 图4是本发明实施例提供的Ha_rdd基因生理功能的鉴定图； 0037 图5是本发明实施例提供的Ha_rdd系统发育进化树图。

24、； 0038 图中： 安达喜盐芽孢杆菌RDD蛋白， 表示RDD家族其他同源蛋白成员， 表示已 知的具有钠/氢逆向转运活性的蛋白， 表示已知的钠/氢逆向转运蛋白； 0039 图6是本发明实施例提供的Ha_RDD蛋白的同源性比对图； 0040 图中： 表示跨膜区 0041 图7是本发明实施例提供的Ha_RDD蛋白活性的鉴定图； 0042 图中： A.Na+/H+逆向转运活性， B.Li+/H+逆向转运活性， C.K+/H+逆向转运活性； 0043 图8是本发明实施例提供的Ha_RDD蛋白活性的pH轮廓图； 0044 图9是本发明实施例提供的Ha_RDD对Na+、 Li+、 K+的亲和能力图； 00。

25、45 图10是本发明实施例提供的Ha_RDD的K+/H+活性的鉴定图； 0046 图11是本发明实施例提供的Ha_RDD蛋白细胞定位图； 0047 图中： M为预染蛋白分子量标准marker， 1、 3、 5泳道为表达有RDD蛋白的相应样品， 2、 4、 6泳道为阴性对照相应样品。 具体实施方式 0048 为了使本发明的目的、 技术方案及优点更加清楚明白， 以下结合实施例， 对本发明 进行进一步详细说明。 应当理解， 此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明， 并不用于 限定本发明。 0049 本发明基于基因文库筛选法并结合钠离子耐受性功能互补法， 从安达喜盐芽孢杆 菌的基因组中随机筛选有关N。

26、a+输出的相关基因， 并通过测序分析及生理生化实验来进一 步确定有价值的基因， 通过对其离子转运功能的鉴定和自身蛋白的定位和分析， 初步验证 该基因的离子转运机制， 从而获得一个新型的Na+/H+ 逆向转运蛋白。 本发明的Ha_RDD是新 型的首次被挖掘和鉴定的新型Na+/H+ 逆向转运蛋白。 0050 下面结合附图对本发明的应用原理作详细描述。 0051 本发明实施例提供的安达喜盐芽孢杆菌耐盐碱基因rdd， 所述的基因rdd含一个 537bp的完整开放阅读框ORF， ORF的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。 0052 本发明实施例提供的安达喜盐芽孢杆菌rdd基因编码的蛋白， 核苷酸序。

27、列如SEQ ID NO.2所示。 0053 所述安达喜盐芽孢杆菌rdd基因编码的蛋白在荧光猝灭实验中该蛋白展现出明显 的Na+(Li+、 K+)/H+逆向转运蛋白活性， 且以上活性具有pH依赖性。 0054 所述的安达喜盐芽孢杆菌rdd编码的蛋白属于未知功能的RDD蛋白家族 (This family of proteins contain three highly conserved amino acids: one arginine (R)and two aspartates(D),hence the name of RDD family)， 在NCBI蛋白数据库中其功 能尚未被注释。 RD。

28、D为安达喜盐芽孢杆菌rdd基因的原核表达蛋白。 说明书 4/10 页 6 CN 107641629 A 6 0055 本发明实施例提供的安达喜盐芽孢杆菌耐盐碱基因rdd的鉴定方法， 包括以下步 骤： 0056 (1)通过基因文库与基因功能互补相结合的筛选技术， 从安达喜盐芽孢杆菌中获 得含有耐盐碱相关的基因片段， 所述的耐盐碱相关的基因片段中含有一个长534bp的rdd基 因的完整开放阅读框ORF， ORF的核苷酸序列如SEQ ID NO.1 所示； 0057 (2)构建含有rdd基因的原核表达载体； 0058 (3)通过化转异源宿主Escherichia coli KNabc， 将rdd基因。

29、导入KNabc 宿主中， 对其生理功能及蛋白活性进行鉴定。 0059 下面结合具体实施例对本发明的应用原理作进一步描述。 0060 实施例1.在线生物软件分析Ha_RDD蛋白的跨膜区及疏水性， 如图1所示； 0061 本发明利用在线预测网站http:/www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM-2.0/ 和 http:/web.expasy.org/protscale/对rdd基因编码的蛋白序列进行生物信息学分析， 发 现该基因编码的蛋白RDD具有三个跨膜区， 且蛋白呈现出高疏水性。 0062 实施例2.Ha_rdd基因原核表达载体pET28b-rdd， pET22b-rdd的。

30、构建流程， 如图2所 示； 0063 根据rdd基因序列， 首先利用Primer5软件设计rdd-F/rdd-R特异引物(如表1所 示)， SEQID NO.3： rdd-F： CATATGGATACAGTAGAACCCAC； 0064 SEQID NO.4： rdd-R： CTCGAGTTAATCTACAGAAGATTCAA。 0065 并在基因的5 和3 端分别引入Nde I、 XhoI两个酶切位点， 然后进行rdd 基因的扩 增(如表2所示)， 对Rdd基因进行亚克隆。 0066 表1 rdd基因表达载体构建引物序列 0067 0068 表2 PCR扩增反应 0069 0070 将PCR。

31、产物加A纯化后连接到克隆载体pEASY-T3上， 化转到Trans1-T1感受态细胞 中， 将转化产物进行蓝白斑筛选。 结果如图3可知， PCR产物:Rdd(547bp)大小与DNA Marker 比对， 应符合PCR产物的实际长度。 为了进一步鉴定pEASYRdd 重组质粒是否正确， 用限制 说明书 5/10 页 7 CN 107641629 A 7 性内切酶进行酶切验证。 如图3可知， 双酶切产生的片段大小与PCR产物大小基本一致， 为进 一步确定序列的准确性， 对插入片段进行测序， 测序结果与原始序列一致。 以上结果表明 Rdd基因成功插入pEASY T3载体中。 0071 RDD亚克隆。

32、(NdeI-XhoI)建到pET28b(卡那抗性)(NdeI-XhoI)， 然后用 BglII- XhoI， 构建到pET22b(氨苄抗性)化转至大肠杆菌(E.coli)KNabc中， 获得重组质粒pET22b- Rdd,对插入片段进行双酶切验证， 酶切结果正确的质粒进行基因测序， 测序结果与原始序 列一致。 表明重组质粒pET22b-Rdd构建成功 (图3)。 0072 实施例3Ha_rdd基因生理功能的鉴定： 0073 为了鉴定Ha_rdd基因的生理功能， 本发明以KNabc/pUC18为负对照， 将原始克隆 KNabc/pUC-SL38的菌液按1接种量转接到含有不同盐浓度(0-0.2M 。

33、NaCl 或50mM LiCl) 的新鲜LBK培养基中培养24h。 结果如图4A-D所示： 在0.2M NaCl 或5mM LiCl的胁迫下， 与负 对照相比， 亚克隆KNabc/pET22-rdd和原始克隆KNabc/pUC-SL38均能使盐敏感突变株KNabc 恢复生长， 并且他们的生长趋势基本一致。 在碱性环境中(如图4E-F)， 原始克隆KNabc/pUC- SL38在加入50mMNaCl pH 8时能使盐敏感突变株KNabc恢复生长， 而在不加NaCl的pH 8.5的 环境中， 恢复生长。 这就说明rdd基因具有明显的耐盐碱能力。 0074 实施例4rdd基因表达蛋白的生物信息学分析。

34、 0075 一、 Ha_rdd基因编码蛋白理化性质： 0076 采用ExPASy Protparam对rdd基因编码蛋白进行基本的理化性质的预测和分析。 结果表明： 耐盐碱基因rdd编码178个氨基酸， 相对分子量为20.42306kD， 等电点9.26， 为碱 性蛋白； 组成的原子是C(948)H(1493)N(243)O(248) S(5)， 一共2937个原子， 理论半衰期 30h， 不稳定参数25.08， 是稳定蛋白， 氨基酸中带正电荷氨基酸(Arg、 Lys)18个， 带负电荷氨 基酸(Asp、 Glu)15 个。 ASP蛋白的氨基酸组成(表3)， 结果显示其中包含的中性疏水性氨基 。

35、酸、 亲水性氨基酸、 酸性氨基酸、 碱性氨基酸分别为58.9、 36.5、 8.4、 13.5。 说明耐 盐碱基因rdd编码蛋白具有一定疏水能力且稳定的碱性蛋白。 0077 表3 Ha_rdd基因编码蛋白氨基酸组成 说明书 6/10 页 8 CN 107641629 A 8 0078 0079 二、 Ha_RDD系统发育进化树 0080 利用Neighbor-Joining算法， 对RDD家族蛋白、 已知的钠/氢逆向转运蛋白或具有 钠/氢逆向转运活性的蛋白进行系统进化距离分析。 结果表明(图5)： RDD 与同家族的其他 蛋白聚集在一簇阙值(bootstrap values)为96的分支上， 。

36、此分支与已知的钠/氢逆向转 运蛋白或具有钠/氢逆向转运活性的蛋白系统进化距离很远。 所以， 本发明认为RDD应该是 一类新型的钠/氢逆向转运蛋白。 0081 三、 Ha_RDD与同系物的同源性比对 0082 本发明选择了BLAST数据库中与它同源性40-60最近的24个同源蛋白进行多 序列比对(图6)， 结果发现： Ha_RDD与这些同系物R35、 D42、 R124、 R129、 D154、 D158氨基酸高 说明书 7/10 页 9 CN 107641629 A 9 度保守。 0083 实施例5Ha_RDD蛋白功能的鉴定 0084 一、 Ha_RDD蛋白活性的鉴定 0085 本发明将含有p。

37、ET-RDD和pET22b的KNabc细胞， 用法式细胞破碎机制备成反转膜， 以吖啶橙作为荧光指示剂， 检测其Na+(Li+， K+)/H+逆向转运蛋白活性 (图7)。 结果发现： 在 荧光猝灭的最低平衡点加入单一的单价阳离子溶液， 反转膜KNabc/pET-RDD的荧光值升高 (图7-A&B&C左侧)， 而负对照KNabc/pET22b 在加入单价阳离子溶液后荧光值没有变化(图 7-A&B&C右侧)。 所以， 我们认为 Ha_RDD是具有转运Na+(Li+、 K+)/H+逆向转运蛋白活性的。 0086 二、 Ha_RDD蛋白活性的pH轮廓 0087 钠/氢逆向转运蛋白对pH是具有一定的依赖性。

38、的， 即它的转运活性会随环境中pH 的变化而改变。 因此， 本发明在不同pH(6.5-9.5)的反应体系中， 检测Ha_RDD的蛋白活性。 结 果发现： 在pH 7.0-9.0的范围内， Ha_RDD对Na+、 Li+、 K+的转运活性会随pH的变化而改变(其 趋势见图8)， 而且当反应体系中的pH 为9.0时， RDD的离子转运活性最高， 并且对三种不同 离子的转运活性也存在一定的差距。 0088 三、 Ha_RDD对Na+、 Li+、 K+的亲和能力 0089 由于Ha_RDD对Na+、 Li+、 K+三种离子转运能力是有差别的， 即对底物偏好性不同。 当 K0.5值越小时， 就表示对某一。

39、底物的转运偏好性越好。 所以， 本发明通过OriginPro 8.6数据 分析软件计算K0.5值(图9)。 发现， 当转运活性达到最大反应活性的一半时， Na+、 Li+、 K+的K0.5 值分别是1.290.14mM、 1.890.20mM、 1.370.21mM， 换而言之， Ha_RDD对Na+的偏好性最 好， 对三种离子的偏好由强到弱依次： Na+K+Li+。 0090 实施例六Ha_RDD蛋白KCl活性的鉴定 0091 本发明利用pUC18和pUC-NhaD作为负对照， pUC-UmP-AB作为正对照来鉴定 Ha_RDD 蛋白的KCl活性。 当OD0.1时接种， 按1的接种量分别接到。

40、不含KCl 和正常的0M LBK不同 pH培养基中， pUC-UmP-AB和pUC-SL38在不含KCl培养基 pH8.0时微弱生长， 在0M LBK pH8.0 时生长良好， 而负对照生长受到抑制(图 10A&B)， 本发明发现图10C pUC-SL38能在1.0M 1.2MKCl里恢复生长， 而其他均受到抑制， 因此本发明证明了Ha_RDD蛋白具有K+活性。 0092 实施例七Ha_RDD蛋白的细胞定位 0093 本发明利用超离法将KNabc/pET22-rdd细胞的胞浆蛋白与膜蛋白分离开， 再通过 蛋白印迹杂交(Western Blot， 简称WB)的技术手段， 分别对提取的细胞全蛋白(。

41、超声破碎上 清液)、 胞浆蛋白(超离上清液)和膜蛋白(超离沉淀) 进行检测。 理论上， WB实验只能在制备 的细胞全蛋白(超声破碎上清液)和膜蛋白(超离沉淀)样品中检测出目的条带(即Ha_RDD所 携有的标签抗体信号)， 而胞浆蛋白样品(超离上清液)则检测不出目的条带。 0094 发现(图10)： 第一， 与负对照相比(B-2、 4、 6)， Ha_RDD蛋白只在细胞的全蛋白和膜 蛋白样品中被检测出条带(B-1、 5)， 而胞浆蛋白样品中没有(B-3)， 综上所述， Ha_RDD的确是 位于在内膜上的膜蛋白， 这与之前对它的分析是相互印证的。 0095 以上所述仅为本发明的较佳实施例而已， 并。

42、不用以限制本发明， 凡在本发明的精 神和原则之内所作的任何修改、 等同替换和改进等， 均应包含在本发明的保护范围之内。 说明书 8/10 页 10 CN 107641629 A 10 0096 说明书 9/10 页 11 CN 107641629 A 11 0097 说明书 10/10 页 12 CN 107641629 A 12 图1 说明书附图 1/8 页 13 CN 107641629 A 13 图2 说明书附图 2/8 页 14 CN 107641629 A 14 图3 说明书附图 3/8 页 15 CN 107641629 A 15 图4 说明书附图 4/8 页 16 CN 107641629 A 16 图5 说明书附图 5/8 页 17 CN 107641629 A 17 图6 图7 说明书附图 6/8 页 18 CN 107641629 A 18 图8 图9 说明书附图 7/8 页 19 CN 107641629 A 19 图10 图11 说明书附图 8/8 页 20 CN 107641629 A 20 。