筛查牛瓜氨酸血症携带者的试剂盒.pdf

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1、(10)授权公告号 CN 101265504 B (45)授权公告日 2010.11.10 CN 101265504 B *CN101265504B* (21)申请号 200810102067.0 (22)申请日 2008.03.17 C12Q 1/68(2006.01) (73)专利权人 中国农业大学 地址 100094 北京市海淀区圆明园西路 2 号 (72)发明人 张沅 孙东晓 杨鸣洲 (74)专利代理机构 北京纪凯知识产权代理有限 公司 11245 代理人 关畅 US 2006/0009922 A1,2006.01.12, 全文 . CN 1952175 A,2007.04.25,说明。

2、书第1页第 4 段至第 2 页第 6 段 . 李建斌等 . 利用 PCR-RFLP 检测中国荷斯 坦牛遗传缺陷 - 瓜氨酸血症 . 生物技术通报 6.2006,(6),97-99. (54) 发明名称 筛查牛瓜氨酸血症携带者的试剂盒 (57) 摘要 本发明公开了一种筛查牛瓜氨酸血症携带者 的试剂盒。该试剂盒， 包括 PCR 引物对和内切酶 Eco47I ； 所述 PCR 引物对为核苷酸序列为序列表 中序列 1 的脱氧核苷酸和核苷酸序列为序列表中 序列 2 的脱氧核苷酸组成的引物对、 核苷酸序列 为序列表中序列 3 的脱氧核苷酸和核苷酸序列为 序列表中序列 4 的脱氧核苷酸组成的引物对或者 核苷。

3、酸序列为序列表中序列 5 的脱氧核苷酸和核 苷酸序列为序列表中序列 6 的脱氧核苷酸组成的 引物对。本发明的筛查牛瓜氨酸血症携带者的试 剂盒， 使用方法简便、 快速、 灵敏， 检测结果可靠、 稳定、 准确 ； 用其筛查荷斯坦奶牛瓜氨酸血症携 带者， 不需要特殊的仪器， 适合常规实验室检测的 需要。 (51)Int.Cl. (56)对比文件 审查员 潘浩 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利 权利要求书 1 页 说明书 8 页 附图 1 页 CN 101265504 B1/1 页 2 1. 一种筛查牛瓜氨酸血症携带者的试剂盒， 包括 PCR 引物对和内切酶 Eco47I ； 所。

4、述 PCR 引物对为核苷酸序列为序列表中序列 1 的脱氧核苷酸和核苷酸序列为序列表中序列 2 的脱氧核苷酸组成的引物对。 2. 根据权利要求 1 所述的试剂盒， 其特征在于 ： 所述试剂盒中还包括琼脂糖凝胶电泳 试剂或聚丙烯酰胺凝胶电泳试剂盒， 所述琼脂糖凝胶电泳试剂包括琼脂糖、 50TAE 和溴化 乙啶贮存液 ； 所 述 50TAE 为 每 升 含 有 Tris 碱 242g、 冰 乙 酸 57.1mL、 0.5mol/L pH 8.0 的 EDTA100mL 的溶液 ； 所述溴化乙啶贮存液为 0.01g/L 溴化乙啶溶液。 3. 根据权利要求 2 所述的试剂盒， 其特征在于 ： 所述试剂盒。

5、中还包括非瓜氨酸血症携 带者的基因型 RFLP 检测阳性对照和瓜氨酸血症携带者的基因型 RFLP 检测阳性对照 ； 所述 非瓜氨酸血症携带者的基因型RFLP检测阳性对照为含有87bp和195bp的DNA片段的溶液 ； 所述瓜氨酸血症携带者的基因型 RFLP 检测阳性对照为含有 87bp、 195bp 和 282bp 的 DNA 片 段的溶液。 4. 根据权利要求 3 所述的试剂盒， 其特征在于 ： 所述试剂盒中还包括 PCR 反应试剂盒， 所述 PCR 反应试剂盒包括 DNA 聚合酶， PCR 缓冲液以及 dATP， dGTP， dCTP， dTTP 的混和物。 5. 根据权利要求 1-4 中。

6、任意一项所述的试剂盒， 其特征在于 ： 所述牛为荷斯坦牛。 权 利 要 求 书 CN 101265504 B1/8 页 3 筛查牛瓜氨酸血症携带者的试剂盒 技术领域 0001 本发明涉及一种筛查牛瓜氨酸血症携带者的试剂盒。 背景技术 0002 荷斯坦奶牛是当前世界各国广泛使用的奶牛品种， 经高度的选育与良好的饲养管 理， 生产性能不断提高， 在人类生活中发挥着越来越重要的作用。近年来， 由于选种选配的 不断进行， 使奶牛间的近交不断增加， 目前世界上大多数荷斯坦牛都可以追溯到北美几头 特别优秀的种公牛。在我国， 由于大量进口种牛、 胚胎和冷冻精液， 增加了遗传缺陷快速传 播的风险， 因此需要逐。

7、步建立完善的检测及防控体系。 0003 遗传缺陷指的是由于生殖细胞或受精卵中的遗传物质发生了结构或功能上的改 变， 从而使发育成的个体出现解剖结构上的异常或生理机能上的损害。遗传缺陷可分为基 因突变和染色体畸变两种。而基因突变有异常染色体隐性基因突变居多。目前发现的奶牛 遗传缺陷大多属于这类突变。 由于隐性遗传缺陷， 即杂合型个体虽带有一个异常等位基因， 但外表看不出来， 因此需要借助分子手段进行检测。如两个亲本都是杂合型个体 (Aa)( 这 里以 a 表示致病基因， A 表示正常基因 )， 那它们的后代就有 1/4 的可能出现二个隐性致病 基因 (aa) 纯合的情况， 这样的个体通常是致死的。

8、， 即使是非致死的遗传缺陷， 也会大大影 响生产性能。杂合型公牛 (Aa) 虽然只带有一个 a， 但其却是 a 基因携带者。这种 Aa 杂合型 公牛常会有健壮外观， 女儿牛表现优良， 导致 a 基因在子代、 孙代、 曾孙代逐渐传递， 经过 多代的人工授精， a 基因携带者在群体中所占比例就大大提高， 从而导致带有二个隐性致病 基因 (aa) 的个体涌现， 给奶牛业带来损失。 0004 瓜氨酸血症 (Citrullinemia， CN) 是荷斯坦奶牛的一种常染色体单基因控制的隐 性遗传疾病， 最早由澳大利亚科学家 Harper 报道。随后在新西兰、 英国、 美国等国家的荷 斯坦奶牛中也相继发现。。

9、其主要症状为血液中瓜氨酸含量升高， 尿素循环受阻引起高氨血 症， 从而导致犊牛在出生一周内死亡。澳大利亚科学家通过对 CN 患病犊牛系谱分析发现， 几乎所有患病犊牛都可以追溯到一个共同祖先 -LinmackKriss King， 且该种公牛冻精大量 使用， 产生很多携带者后代。1989 年， 澳大利亚某种公牛站中携带者占 13。CN 的分子遗 传学基础是由位于奶牛第 11 号染色体 (BTA11) 上的第 5 外显子第 86 和 175 个氨基酸发 生单碱基突变 (C T) 所致， 该基因编码精氨酸合成酶 (Argininosuccinate Synthetase Deficiency， AS。

10、S)。ASS 参与肝脏的尿素循环， 以瓜氨酸和天门冬氨酸为底物合成精氨酸代 琥珀酸。第 86 号氨基酸的点突变形成终止密码子， 从而使 ASS 功能丧失。目前美国、 澳大 利亚、 德国等奶业发达国家已经建立了比较完善的检测及防控体系。由于第 86 号氨基酸的 点突变造成了酶切位点的丧失， 因此可以采用 PCR-RFLP 的方法进行分子检测。其基本过程 是 ： PCR扩增靶DNA ； 用内切酶Eco47I对PCR产物进行酶切。 通过琼脂糖电泳分析结 果。在内切酶足量的前提下， 若发现 DNA 条带由两条变成三条， 即有一条 DNA 链未被切开， 就可以判定该 DNA 片段中有碱基突变。 说 明 。

11、书 CN 101265504 B2/8 页 4 发明内容 0005 本发明的目的是提供一种筛查牛瓜氨酸血症携带者的试剂盒。 0006 本发明所提供的筛查牛瓜氨酸血症携带者的试剂盒， 包括 PCR 引物和内切酶 Eco47I ； 所述 PCR 引物为核苷酸序列分别为序列表中序列 1 和序列表中序列 2 的脱氧核苷 酸组成的引物对、 核苷酸序列分别为序列表中序列 3 和序列表中序列 4 的脱氧核苷酸组成 的引物对或者核苷酸序列分别为序列表中序列5和序列表中序列6的脱氧核苷酸组成的引 物对。 0007 以荷斯坦奶牛的基因组 DNA 为模板， 用所述核苷酸序列分别为序列表中序列 1 和 序列表中序列 。

12、2 的脱氧核苷酸组成的引物对扩增得到自 ASS 基因外显子的第 256 位的 5 端的第 59-340 位核苷酸序列 ( 即自 GenBank Accession Number NW001492999 的 5端第 461211位至461492位脱氧核糖核苷酸) ； 用所述核苷酸序列分别为序列表中序列3和序列 表中序列4的脱氧核苷酸组成的引物对扩增得到自ASS因外显子5的第256位的5端的第 175-350 位核苷酸序列 ( 即自 GenBank Accession NumberNW001492999 的 5端第 461327 位至 461502 位脱氧核糖核苷酸 ) ； 用所述核苷酸序列分别为。

13、序列表中序列 5 和序列表中序 列 6 的脱氧核苷酸组成的引物对扩增得到 ASS 基因外显子 5 的第 256 位脱氧核糖核苷酸的 5端第166-340位核苷酸序列(即自GenBankAccession Number NW001492999的5端第 461318 位至 461492 位脱氧核糖核苷酸 )。 0008 所述 PCR 引物优选为核苷酸序列分别为序列表中序列 1 和序列表中序列 2 的脱氧 核苷酸组成的引物对。 0009 所述试剂盒中还包括琼脂糖凝胶电泳试剂， 所述琼脂糖凝胶电泳试剂包括琼脂 糖、 50TAE 和溴化乙啶贮存液 ； 0010 所 述 50TAE 为 每 L 含 有 T。

14、ris 碱 242g、 冰 乙 酸 57.1mL、 0.5mol/LEDTA(pH 8.0)100mL 的溶液 ； 所述溴化乙啶贮存液为 0.01g/L 溴化乙啶溶液。 0011 所述试剂盒中还包括非瓜氨酸血症携带者的基因型 RFLP 检测阳性对照和瓜氨酸 血症携带者的基因型 RFLP 检测阳性对照 ； 所述非瓜氨酸血症携带者的基因型 RFLP 检测阳 性对照为含有 87bp 和 195bp 的 DNA 片段的溶液 ； 所述瓜氨酸血症携带者的基因型 RFLP 检 测阳性对照为含有 87bp、 195bp 和 282bp 的 DNA 片段的溶液。 0012 所述试剂盒中还包括 PCR 反应试剂盒。

15、。所述 PCR 反应试剂盒可为市售任意 PCR 反 应试剂盒， 其中， 包括 DNA 聚合酶， PCR 缓冲液， dATP， dGTP， dCTP， dTTP 等 PCR 扩增试剂。 0013 用本发明的试剂盒筛查荷斯坦奶牛瓜氨酸血症携带者时， 可以待测荷斯坦奶牛的 基因组DNA为模板， 利用扩增ASS基因外显子5的第256位的单碱基突变的5端第59-340 位核苷酸的PCR引物(如核苷酸序列分别为序列表中的序列1和序列2的一对PCR引物)进 行 PCR 扩增， 然后按照下述方法进行 RFLP 分析 ： 用内切酶 Eco47I 对 PCR 产物进行酶切 ； 酶 切时间为2-3h ； 酶切体系为。

16、10ul， 其中PCR产物8.5ul， 酶切缓冲液1ul， 内切酶0.5ul(10U/ ul)， 酶切产物通过 3琼脂糖电泳来区分 CN 携带者 ( 瓜氨酸血症携带者 ) 和非 CN 携带者 ( 非瓜氨酸血症携带者 )。利用核苷酸序列分别为序列表中的序列 1 和序列 2 的一对 PCR 引物进行 PCR-RFLP 分析， 在琼脂糖凝胶电泳图谱中， 如待测荷斯坦奶牛得到三条带 (87bp、 195bp、 282bp)， 则该待测荷斯坦奶牛为 CN 携带者 ( 瓜氨酸血症携带者 ) ； 如待测荷斯坦 奶牛得到两条带 (87bp、 195bp)， 则该待测荷斯坦奶牛为非 CN 携带者 ( 非瓜氨酸血。

17、症携带 说 明 书 CN 101265504 B3/8 页 5 者 )。 0014 本发明的筛查荷斯坦奶牛瓜氨酸血症携带者的试剂盒， 使用方法简便、 快速、 灵 敏， 检测结果可靠、 稳定、 准确 ； 用其筛查荷斯坦奶牛瓜氨酸血症携带者， 不需要特殊的仪 器， 适合常规实验室检测的需要。 附图说明 0015 图 1 为部分荷斯坦牛 ASS 基因 PCR 产物凝胶电泳图 0016 图 2 为部分个体 PCR-RFLP 结果 0017 图 3 为非瓜氨酸血症携带者的 ASS 基因序列图 ( 箭头处为突变位点 ) 0018 图 4 为瓜氨酸血症携带者的 ASS 基因序列图 ( 箭头处为突变位点 ) 。

18、具体实施方式 0019 下述实施例中的实验方法， 如无特别说明， 均为常规方法。 0020 实施例 1、 筛查荷斯坦奶牛瓜氨酸血症携带者的试剂盒的制备及其效果验证 0021 一、 筛查牛瓜氨酸血症携带者的试剂盒的制备 0022 本发明的筛查牛瓜氨酸血症携带者的试剂盒， 包括 PCR 反应试剂， 琼脂糖凝胶电 泳试剂和酶切试剂。它们的具体组成如下 ： 0023 1、 PCR 反应试剂 ： 0024 PCR 引 物 ：根 据 GenBank 数 据 库 中 奶 牛 ASS 的 基 因 序 列 (GenBank AccessionNumber 为 NW001492999)， 在其外显子 5 的第 2。

19、56 位 ( 即 GenBank Accession NumberNW001492999 的自 5端第 461408 位 ) 的点突变两侧设计引物， 其中， 正向引物的序 列为 ： TTTTCAAGACCACCCTGTT( 序列表中序列 1， 该引物由上海生工生物公司合成 )， 反向引 物的序列为 ： CATACTTGGCTCCTTCTCG( 序列表中序列 2， 该引物由上海生工生物公司合成 ) ； 正、 反向引物浓度均为 25umol/L。该引物可以奶牛基因组为模板扩增得到 282bp PCR 产物 ( 自 GenBank Accession Number NW001492999 的 5端第。

20、 461211 位至 461492 位脱氧核糖 核苷酸 )。GenBank Accession NumberNW001492999 的自 5端第 461408 位碱基为 C， 基因 型为纯合， 即为非 CN 携带者 ( 非瓜氨酸血症携带者 ) 的基因型， 将其命名为 AA 基因型， 该 基因型的 PCR 产物用内切酶 Eco47I 酶切应得到两条带 (87bp、 195bp) ； GenBank Accession NumberNW001492999的自5端第461408位碱基为同时含有C和T， 为杂合基因型， 即CN携 带者 ( 瓜氨酸血症携带者 ) 的基因型， 将其命名为 AB 基因型， 。

21、该基因型的 PCR 产物用内切 酶 Eco47I 酶切应得到三条带 (87bp、 195bp、 282bp)。 0025 Taq DNA 聚合酶 (2.5U/uL)、 10PCR 缓冲液 ( 含 Mg2+)、 dNTPs(42.5mM) 均购自 天根生化科技 ( 北京 ) 有限公司， 它们的商品目录号分别为 ET101-02、 CD111-02。 0026 2、 琼脂糖凝胶电泳试剂 ： 0027 琼脂糖 ： 西班牙分装， 北京普博欣生物技术有限公司 0028 50TAE ： Tris 碱 242g、 冰乙酸 57.1mL、 0.5mol/L EDTA(pH 8.0)100mL， 加水充 分溶解。

22、， 定容至 1L ； 0029 溴化乙啶贮存液 ： 1g 溶于 100mL 蒸馏水中。 0030 3、 酶切试剂 说 明 书 CN 101265504 B4/8 页 6 0031 内切酶 Eco47I(10U/ul)( 含酶切缓冲液 )， 购自深圳中晶生物技术有限公司。 0032 4、 非瓜氨酸血症携带者的基因型 RFLP 检测阳性对照和瓜氨酸血症携带者的基因 型 RFLP 检测阳性对照 0033 为了方便筛查对比， 用含有 87bp 和 195bp 的 DNA 片段的溶液作为非瓜氨酸血症携 带者的基因型 RFLP 检测阳性对照 ； 用含有 87bp、 195bp 和 282bp 的 DNA 。

23、片段的溶液作为瓜 氨酸血症携带者的基因型 RFLP 检测阳性对照。 0034 将测序确认的非瓜氨酸血症携带者的基因型用步骤1所述的PCR反应试剂进行扩 增， 然后用内切酶 Eco47I 酶切 PCR 反应产物得到的溶液， 为含有 87bp 和 195bp 的 DNA 片段 的溶液， 可作为非瓜氨酸血症携带者的基因型 RFLP 检测阳性对照 ； 将测序确认的瓜氨酸血 症携带者的基因型用步骤 1 所述的 PCR 反应试剂进行扩增， 然后用内切酶 Eco47I 酶切 PCR 反应产物得到的溶液， 为含有 87bp、 195bp 和 282bp 的 DNA 片段的溶液， 可作为瓜氨酸血症 携带者的基因。

24、型 RFLP 检测阳性对照。 0035 二、 利用步骤一制备的试剂盒筛查部分进口澳大利亚荷斯坦奶牛瓜氨酸携带者 0036 1、 澳大利亚荷斯坦奶牛母牛凝固血液 0037 澳大利亚荷斯坦奶牛样品来自北京三元绿荷奶牛养殖中心金银岛牛场。共采集 199 头澳大利亚荷斯坦奶牛母牛血液。 0038 2、 凝固血液中基因组 DNA 的提取 0039 采用天根生化科技 ( 北京 ) 有限公司的 DP318 试剂盒提取澳大利亚荷斯坦奶牛母 牛血液基因组 DNA， 即得到澳大利亚荷斯坦奶牛母牛基因组基因。 0040 3、 引物和 PCR 扩增 0041 以步骤 2 提取得到的澳大利亚荷斯坦奶牛母牛基因组基因为模。

25、板， 用步骤一的步 骤 1 的 PCR 试剂进行扩增。 0042 PCR 扩增反应总体系为 20L， 其中凝血的基因组 100ng， 两条引物的终浓度均为 0.5pmol/L， 四种 dNTP 的浓度均为 0.25mmol/L， Taq DNA 聚合酶 1U， 10PCR 缓冲液 ( 含 Mg2+)2.0mL。扩增条件为先 94预变性 5min ； 然后 94 30s， 56 30s， 72 30s， 共 35 个循 环 ； 最后 72延伸 7min。将 PCR 扩增产物进行 2的琼脂糖凝胶电泳。 0043 对 199 头进口澳大利亚荷斯坦奶牛 ASS 基因的 PCR 扩增均得到一条清晰的 2。

26、82bp 的DNA片段， 部分澳大利亚荷斯坦奶牛个体的PCR扩增产物琼脂糖凝胶电泳结果如图1。 图 1 中， 泳道 M 为 DNA 分子量标准 (100bp ladder Marker) ； 泳道 1-9 为部分澳大利亚荷斯坦 奶牛的 PCR 产物。 0044 4、 RFLP 检测 0045 取 8.5L PCR 扩增产物与 1L 酶切缓冲液和 0.5ul 内切酶 Eco47I 混合均匀， 37变性2-3h， 3凝胶电泳检测。 电泳同时对步骤一的步骤4的非瓜氨酸血症非携带者的 基因型 RFLP 检测阳性对照和瓜氨酸血症非携带者的基因型 RFLP 检测阳性对照进行电泳， 作为判别对照。 0046。

27、 对进口的 199 头荷斯坦奶牛的 PCR-RFLP 结果共发现两种带型， 对应两种基因型， 得到两条带(87bp、 195bp)的基因型， 为AA基因型， 与非瓜氨酸血症非携带者的基因型RFLP 检测阳性对照带型一致， 即为非瓜氨酸血症非携带者 ； 得到三条带 (87bp、 195bp、 282bp) 的 基因型， 为 AB 基因型， 与瓜氨酸血症非携带者的基因型 RFLP 检测阳性对照带型一致， 即为 说 明 书 CN 101265504 B5/8 页 7 瓜氨酸血症非携带者 ； 部分个体的酶切电泳结果如图 2。图 2 中， 泳道 M ： DNA 分子量标准 (100bp ladder M。

28、arker) ； 泳道 1-8 ： 部分 AA 基因型 ( 瓜氨酸血症非携带者 )PCR 结果， 泳道 9 为部分 AB 基因型 ( 瓜氨酸血症携带者 )PCR 结果。PCR-RFLP 结果表明， 在进口的 199 头 澳大利亚荷斯坦奶牛中， 有 5 头的基因型为 AB， 其余的基因型为 AA。 0047 5、 序列分析 0048 将该 199 头荷斯坦奶牛的 282bp PCR 产物进行序列分析。测序采用 PCR 产物直接 测序方法， 由上海英骏生物技术有限公司完成。结果表明这些 282bp PCR 产物序列均是自 GenBank Accession Number NW001492999 的。

29、 5端第 461211 位至 461492 位脱氧核糖核苷 酸 ； 表明所有AA基因型个体(194头)的ASS的外显子5的第256位(即GenBankAccession Number NW001492999 的自 5 端第 461408 位 ) 碱基为 C， 基因型为纯合， 即非 CN 携带者 ( 非 瓜氨酸血症携带者， 序列分析结果如图 3 所示 ) ； 所有 AB 基因型个体 (5 头 ) 的 ASS 的外显 子 5 的第 256 位 ( 即 GenBank Accession Number NW001492999 的自 5 端第 461408 位 ) 位 碱基同时含有 C 和 T， 为杂。

30、合基因型， 即 CN 携带者 ( 瓜氨酸血症携带者， 序列分析结果如图 4 所示 )。图 3 和图 4 中， 箭头所示为点突变碱基， AA 型个体为 C 碱基， AB 型个体为杂合 C/ T。 0049 该测序结果与 PCR-RFLP 结果一致， 说明 PCR-RFLP 结果准确。该 199 头进口澳大 利亚荷斯坦母牛中， 共有 5 头 CN 携带者 ( 基因型为 AB， 瓜氨酸血症携带者 )， 194 头非 CN 携 带者 ( 基因型为 AA)。 0050 对所有母牛个体重复进行 PCR-RFLP 分析， 两次实验结果完全一致， 证明本研究所 建立的 CN 检测方法稳定， 结果可靠。 0051 序列表 0052 说 明 书 CN 101265504 B6/8 页 8 0053 说 明 书 CN 101265504 B7/8 页 9 0054 说 明 书 CN 101265504 B8/8 页 10 说 明 书 CN 101265504 B1/1 页 11 图 1 图 2 图 3 图 4 说 明 书 附 图 。