人碱性成纤维细胞生长因子植物表达载体的构建及转化表达方法.pdf

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1、(10)授权公告号 CN 101323859 B (45)授权公告日 2012.09.05 CN 101323859 B *CN101323859B* (21)申请号 200710111015.5 (22)申请日 2007.06.13 C12N 15/82(2006.01) C12N 15/62(2006.01) C12P 21/02(2006.01) C12N 15/29(2006.01) C12N 15/12(2006.01) (73)专利权人 吉林农大生物反应器工程有限公 司 地址 陕西省长春市新城大街 2888 号 专利权人 加拿大森母柏澳斯特遗传有限公 司 (72)发明人 李校堃 李。

2、海燕 田海山 杨晶 庞实锋 刘秀明 王艳芳 董园园 (74)专利代理机构 北京路浩知识产权代理有限 公司 11002 代理人 王朋飞 US 5948682 ,1999.09.07, 说明书第 9 栏第 54行至第11栏第6行、 第12栏第45行至第13栏 第 4 行、 第 16 栏第 13 行至 35 行、 实施例 1、 摘要 . KR 2005-0027836 A,2005.03.21, 摘要 . CN 1928096 A,2007.03.14, 全文 . (54) 发明名称 人碱性成纤维细胞生长因子植物表达载体的 构建及转化表达方法 (57) 摘要 本发明提供了一种用于表达人碱性成纤维 细。

3、胞生长因子 (Humanbasic fibroblast growth factors， 简称hbFGF)的表达载体。 本发明采用体 外基因重组方法， 将 hbFGF 基因与油体蛋白基因 融合， 构建成一种植物油体表达载体， 用根瘤农杆 菌转化了拟南芥、 红花并获得了转基因植株， 分子 生物学检测证明了外源基因的整合和表达， 经活 性检测， 获得的重组蛋白具有生物活性， 其生物活 性与人bFGF标准品活性相当。 本发明还提供一种 在植物种子中表达碱性成纤维细胞生长因子的方 法， 该方法能够经济地生产碱性成纤维细胞生长 因子， 从而为 bFGF 的药物开发提供了新途径。 (51)Int.Cl. 。

4、(56)对比文件 审查员 张丽玮 权利要求书 1 页 说明书 8 页 附图 1 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利 权利要求书 1 页 说明书 8 页 附图 1 页 1/1 页 2 1. 含有油体蛋白和人碱性成纤维细胞生长因子融合基因的植物表达载体， 其为 p1390ONE-bFGF。 2. 含有权利要求 1 所述表达载体的宿主细胞。 3. 权利要求 1 所述的表达载体在制备人碱性成纤维细胞生长因子 hbFGF 中的应用。 4. 一种在植物种子油体中表达人碱性成纤维细胞生长因子的方法， 包括步骤 ： 将权利 要求 1 所述的植物表达载体转化受体植物， 经筛选鉴定获得转基。

5、因受体植物并获得植物种 子， 从得到的植物种子中提取获得碱性成纤维细胞生长因子。 5. 如权利要求 4 所述的方法， 其特征在于， 所述植物为拟南芥或红花。 权 利 要 求 书 CN 101323859 B 2 1/8 页 3 人碱性成纤维细胞生长因子植物表达载体的构建及转化表 达方法 技术领域 0001 本发明涉及生物领域， 具体的说， 涉及植物油体表达载体及其在表达人碱性成纤 维细胞生长因子中的应用。 背景技术 0002 利用转基因植物生产医用蛋白， 近年越来越受到人们的关注， 在植物油体中表达 药用蛋白， 使目的基因插在油体蛋白基因的 N 端或 C 末端， 构建成融合蛋白基因。由于油 体。

6、蛋白镶嵌在油体表面， 构建的融合蛋白基因便可在受体植物种子的油体中特异表达， 这 样便可大大提高外源蛋白在植物组织中的表达量， 并可利用油体亲脂疏水的特性， 将种子 粉碎后， 再经液体抽提离心等步骤， 回收油相， 便可将融合蛋白或目的蛋白与细胞内的其它 组份分开， 这样便可明显简化目的蛋白的分离纯化过程， 这种植物油体表达体系有利于外 源基因的表达及产业化研究， 因此本发明采用油体表达技术在植物种子中表达 hbFGF， 为 hbFGF 的产业化研究打下了基础。 0003 人碱性成纤维细胞生长因子(human basic fibroblast growthfactor， hbFGF)是 已知 F。

7、GF 家族中的成员， 碱性成纤维细胞生长因子作用广泛， 对大量来源于中胚层和神经 外胚层的细胞具有促分裂作用， 如促进血管形成、 促进创伤愈合与组织修复、 调节内分泌功 能、 神经营养、 调节胚胎发育和分化等多种生物学功能。近十多年来， 国内外的研究表明， 该因子具有促进血管生成、 创伤愈合、 韧带损伤修复、 溃疡愈合、 眼晶状体再生、 神经组织修 复、 神经突起生长以及胚胎的发育与分化等功能， 预示了巨大的临床应用前景。 0004 一般来说， bFGF 的化学特征是可与肝素紧密结合， 由于它对酸和热敏感， 等电点 呈碱性 (9.6)， 故称之为碱性成纤维细胞生长因子 (bFGF)。天然 bF。

8、GF 是一种单链蛋白质， 分子中含有 146 个氨基酸残基， 分子量约为 17kDa， FGF 存在两类受体 ： 一类是亲和力受体， 属跨膜性酪氨酸蛋白激酶类受体 ； 另一类是低亲和力受体， 即肝素样受体， bFGF 与高亲和 力受体结合时需低亲和力受体的参与， 提示低亲和力受体的结合使高亲和力受体结合更容 易、 更牢固。 0005 迄今为止， 主要是使用细菌特别是大肠杆菌作为以重组技术工业规模生产蛋白质 的宿主细胞， 但使用大肠杆菌生产生物学活性蛋白质特别是真核细胞蛋白的一个重要缺点 是， 表达产物在宿主胞浆内形成所谓 “包涵体” ， 即生物学活性的不溶性聚合体。 虽然形成包 涵体的优点是可。

9、保护被表达的蛋白质免于遭受宿主细胞中蛋白酶的降解， 并能够用离心方 法很容易地将包涵体分离出来。但为了得到有生物学活性的蛋白质产物， 必须对包体进行 变性 - 溶解 - 复性处理。这个过程一般要在反复试验的基础上完成， 而且常常不能得到令 人满足的产物回收率。 为了解决这一难题， 人们试图采用真核植物来表达药用蛋白， 使蛋白 质正确折叠和糖基化， 以此维持蛋白质的生物学活性。 发明内容 说 明 书 CN 101323859 B 3 2/8 页 4 0006 本发明的一个目的是提供在植物种子油体中表达 hbFGF 的重组表达载体， 其中所 说的表达载体包含与油体蛋白启动子可操作地连接的 hbFG。

10、F 的全长核苷酸序列， 且 hbFGF 全长核苷酸序列是按照植物偏好的密码子设计合成的。 0007 本发明将油体蛋白基因与 bFGF 基因融合后克隆到表达载体中， 所述的油体蛋白 基因优选为油菜油体蛋白基因或大豆油体蛋白基因， 所述表达载体为植物表达载体， 该植 物表达载体的启动子优选为油菜油体蛋白启动子或大豆油体蛋白启动子。 0008 将上述含有油体蛋白基因与 bFGF 基因融合基因的表达载体， 转化植物， 并整合到 植物基因组中， 培植出带有上述融合基因的转基因植物， 该植物能够产生含所述 bFGF 的 F2 代种子 ； 并且， 该种子性状能长期稳定遗传到下一代。 0009 本发明的另一个。

11、目的是提供一种在真核宿主中表达成碱性成纤维细胞生长因子 的方法， 包括将表达载体转化受体植物， 经筛选鉴定获得转基因受体植物并获得植物种子， 进一步从植物种子中提取获得碱性成纤维细胞生长因子。具体地说包括以下步骤 ： 0010 (1) 构建植物油体表达载体 ； 0011 (2) 按植物偏好的密码子合成 hbFGF 的核苷酸序列 ； 0012 (3) 将 hbFGF 的核苷酸序列连接到油体蛋白核苷酸序列的 3 端， 克隆进表达载体 中 ； 0013 (4) 用步骤 (3) 的重组表达载体用农杆菌侵染转化适当的真核宿主愈伤组织 ； 0014 (5) 筛选转基因抗性愈伤组织 ； 0015 (6) 筛。

12、选抗性植物转化苗 ； 0016 (7) 将得到的植物种子经粉碎、 用提取液萃取， 离心可除去 90以上的杂质， 经洗 涤纯化回收所需的碱性成纤维细胞生长因子活性多肽。 0017 本发明涉及以重组DNA技术生产bFGF的方法， 特别是涉及以真核植物作为宿主生 产 bFGF 的方法。更具体的说， 本发明涉及用于在真核植物种子油体蛋白中融合表达 bFGF 蛋白。本发明进一步涉及按本发明的方法制备的 bFGF 在治疗由于血管病变、 心肌梗塞或脑 出血引起的局部缺血性疾病、 促进组织修复、 伤口愈合中及其在个人护理品中的应用。 0018 可按照本领域已知的技术进行基因的分离和合成、 克隆和表达载体的构建。

13、、 DNA 序 列分析及鉴定、 宿主细胞转化和培养， 以及表达产物的分离和纯化等操作 ( 参见 Sambrook ct al.， Molecular Cloning ： ALaboratory Mannual， Cold Spring Harbor laboratory Press， Cola SpringHarbor， NY， 1989)。 0019 可以将按本发明方法制备的 bFGF 与选自人血清白蛋白、 多聚甘氨酸、 金属阳离子 ( 如 Zn2+、 Mn+和 Mg2+) 及低分子量肽的活性蛋白质保护剂， 选自聚乙二醇、 谷胱甘肽的稳定 剂混合， 并加入本领域技术人员熟知的药物载体或赋形剂。

14、， 制成适于经胃肠道途径， 特别是 经胃肠道外途径给药的药物组合物。可以按照制药领域的常规方法， 将这样的药物组合物 制成适于经血管内、 肌肉内、 或腹腔内给药的溶液剂、 经口服给药的片剂或粉末剂， 或制成 适合于外用的栓剂、 软膏、 霜剂、 乳化剂等剂型。 0020 上述的药物组合物可用于促进因烧伤或其他机械床上造成的软组织、 肌腱、 人带、 软骨或骨组织伤口的修复或愈合。所说的软骨组织包括皮肤、 肌肉、 血管、 内脏器官及角膜 组织等处古和软骨组织外的所有组织。上述的药物组合物亦可用于治疗血管组织损伤， 如 促进血管生长(血管生成)和血管修复(促进受损部位的血管内皮细胞增殖)。 本发明的药。

15、 说 明 书 CN 101323859 B 4 3/8 页 5 物组合物还可用于促进中枢和外周神经组织修复， 包括刺激阿尔海默氏病 ( 早老性痴呆 ) 病理过程中受损的海马神经元的生长。作为该药物组合物的活性成分， bFGF 可刺激因各种 原因受到损伤的神经组织， 使之通过成神经细胞的有丝分裂再生新的神经元， 恢复受损部 位的神经细胞群体， 并促进轴突的延伸。 0021 本发明通过本发明按照植物密码子的偏爱性和成了 hFGF 基因， 并与植物油体蛋 白基因融合， 进一步构建表达载体， 不仅克服了原核生物不能使蛋白质正确折叠和糖基化 的问题， 而且利用油体蛋白还能使 hFGF 便于纯化， 提高了。

16、其纯化产率， 通过该表达载体获 得的 hFGF 活性与野生型相比略高。此外， 通过本发明的方法 hFGF 的表达量可占种子总蛋 白的1， 比目前其它植物表达载体的表达量(一般为植物总可溶蛋白的0.0010.01) 提高 1000 至 10000 倍， 满足了生产需求。 附图说明 0022 图 1 表达载体 pCAMBIA1390 的图谱 ； 0023 图 2hbFGF 目的蛋白的 Western 检测图。 具体实施方式 0024 以下实施例用于说明本发明， 但不用来限制本发明的范围。 0025 实施例 1 ： bFGF 基因的制备及序列测定 0026 以hbFGF基因为蓝图， 首先按照植物偏好。

17、的密码子将hbFGF碱基序列重新改造， 并 按照密码子的简并性消除在本实验中所用到的酶切位点， 利用在线软件 Primerfinder 及 DNASTAR 设计引物， 为了合成含植物偏好的 bFGF 全长基因， 共设计合成了十二条引物， 每条 引物长度约为 57 59bp ： P1F-P6F 为正向引物， P7R-P12R 为反向引物， 其中 P6F 和 P7R 为 互补的嵌合引物 ( 有 19 个互补碱基 ) ； 在引物 P1F 和 P12R 中分别引入了 BamHI 和凝血酶 切位点及 SpeI、 EcoRI 酶切位点和保护碱基， 以便克隆进中间克隆载体及植物表达载体中， 引物序列如下 ：。

18、 0027 p1F ： CGGGATCCATTGAGGGAAGACCAGCTTTGCCAGAGGATGGAGGATC 0028 p2F ： GCCAGAGGATGGAGGATCTGGAGCTTTCCCACCAGGACATTTCAAGGACCCAAAGAG 0029 p3F ： TTTCAAGGACCCAAAGAGATTGTACTGCAAGAACGGAGGATTCTTCTTGAGAATCCATC 0030 p4F ： TTCTTCTTGAGAATCCATCCAGATGGAAGAGTTGATGGAGTTAGAGAGAAGTCTGATCC 0031 p5F ： AGAGAGAAGTCTGATCCAC。

19、ATATTAAGTTGCAATTGCAAGCTGAGGAGAGAGGAGTTGT 0032 p6F ： AGGAGAGAGGAGTTGTTTCTATTAAGGGAGTTTGCGCTAACAGATACTTGGCTATGAAG 0033 p7R ： CATCAGTAACGCACTTAGAAGCCAACAATCTTCCATCCTCCTTCATAGCCAAGTATCTG 0034 p8R ： GTTGTAGTTGTTAGACTCCAATCTCTCGAAGAAGAAGCACTCATCAGTAACGCACTTAG 0035 p9R ： AAAGCAACGTACCAAGAAGTGTACTTTCTTGATCT。

20、GTAAGTGTTGTAGTTGTTAGACTC 0036 p10R ： TCCAGTCTTAGATCCCAACTTGTATTGTCCAGTTCTCTTCAAAGCAACGTACCAAGAAG 0037 p11R ： TAGCAGACATTGGCAAGAACAAAATAGCCTTTTGTCCTGGTCCAGTCTTAGATCCCAAC 0038 p12R ： CGGAATTCACTAGTTTAAGACTTAGCAGACATTGGCAAG 0039 bFGF 全长基因合成 0040 第一轮 PCR 扩增， 如下建立 100l 的反应体系 ： 说 明 书 CN 101323859 B 5 4/8 。

21、页 6 0041 0042 0043 反应参数 ： 0044 94 5min 0045 55 5min 0046 72 5min 0047 4 0048 经 2琼脂糖凝胶电泳检测无非特异性条带后， 用 DNA 胶回收试剂盒纯化回收， 回 收产物命名为 B6/7。 0049 第二轮 PCR 扩增， 如上采用 100l 反应体系 ： 0050 0051 反应参数如下 ： 0052 说 明 书 CN 101323859 B 6 5/8 页 7 0053 0054 如上用DNA胶回收试剂盒纯化回收， 回收产物命名为B5/8。 其后， 以B5/8为模板， 以 P4F 及 P9R 作引物， 经 PCR 扩。

22、增得 PCR 产物 B4/9 ； 再以 B4/9 为模板， 以 P3F 及 P10R 作引 物， 扩增得 PCR 产物 B3/10 ； 如此进行， 直至合成改造后的 bFGF 全长基因。 0055 将 PCR 产物 bFGF 经 BamHI 及 EcoRI 双酶切后连接到 pUC19 上， 得到 pUCbFGF。重 组质粒 pUCbFGF 的 DNA 序列测序结果表明， 本发明设计合成的 bFGF 核苷酸序列正确。获得 了 441bp 的 hbFGF 基因， 其序列如序列表 SEQ ID No.1 所示。 0056 实施例 2 ： 重组油体表达载体的构建 0057 以白菜型油菜的总 DNA 为。

23、模板， 以 oleosin 基因的启动子的序列设计引物， 引物 1 含有 HindIII 酶切位点， 引物 2 引入 PstI 酶切位点， 经 PCR 扩增获得了约 900bp 的 oleosin 基因的启动子 (PCR 反应条件为 ： 94， 5 分钟 ； 94 30 秒， 58 30 秒， 72 1 分钟 ； 25 个循 环结束后 72延伸 5 分钟 )， PCR 产物用 HindIII 和 PstI 双酶切后， 将其连接到 pUC19 上， 得到 pUCON， 其测序结果表明克隆产物为油菜油体蛋白基因的启动子。 0058 以大豆 24kD 油体蛋白基因序列设计引物 ： 0059 引物 1。

24、 序列为 ： 5 -aactgcagtcaaccatgaccacagtgccaccac 0060 引物 2 序列为 ： 5 -cgggatcctgcggttgcggttgttgctgtcactg 0061 引物 1 含有 PstI 酶切位点， 引物 2 引入 BamHI 酶切位点， 以大豆种子基因组 DNA 为模板， 经 PCR 扩增获得完整的大豆 24kDa 油体蛋白基因编码区序列 678bp(PCR 反应条件 为 ： 94， 5 分钟 ； 94 30 秒， 58 30 秒， 72 1 分钟 ； 25 个循环结束后 72延伸 2 分钟 )， PCR 产物用 PstI 和 BamHI 双酶切后。

25、， 将其连接到 pUC19 上， 得到 pUCOE， 其测序结果表明克 隆产物为大豆油体蛋白基因。 0062 将 pUCON 质粒用 HindIII 和 PstI 双酶切后， 将酶切片段油菜油体蛋白启动子连 接到商业载体 pCAMBIA1390( 国际农业分子生物学应用中心 Centre for the Application of Molecular Biology toInternational Agriculture， Australia) 中， 重组质粒命名为 p1390ON， 经酶切鉴定正确后进行后续工作。将 pUCOE 质粒经 PstI 和 BamHI 双酶切后， 将酶 切片段大豆。

26、油体蛋白基因与 p1390ON 连接， 重组质粒命名为 p1390ONE， 此即油体表达载体。 0063 实施例 3 ： 含 hbFGF 基因的重组油体表达载体的构建 0064 将 pUCbFGF 质粒用 BamHI 和 SpeI 双酶切后， 将得到的 hbFGF 酶切片段与重组油体 说 明 书 CN 101323859 B 7 6/8 页 8 表达载体 p1390ONE 连接， 得到重组植物油体表达载体 p1390ONE-bFGF。 0065 实施例 4 ： 农杆菌介导的拟南芥、 红花等遗传转化 0066 p1390ONE-bFGF 质粒 DNA 转入农杆菌 0067 取 1g p1390O。

27、NE-bFGF 质粒 DNA 加入到 100 微升 LBA4404 感受态细胞中， 轻轻混 匀， 冰浴放置 5 分钟 ； 然后置液氮中冷冻 5 分钟后迅速转至 37水浴中温育 5 分钟。加入 1 毫升 LB 液体培养基， 在 28摇床上 180rpm 振荡培养 4 小时。取适量菌液涂布到含链霉 素 50mg/L 和卡那霉素 50mg/L 的 LB 固体培养基上， 置 28培养 24 48 小时， 经抗性筛选、 PCR 及酶切鉴定获得带有 p1390ONE-bFGF 质粒 DNA 的农杆菌单菌落。 0068 含 p1390ONE-bFGF 质粒的农杆菌的活化 0069 从平板上挑取含 p1390。

28、ONE-bFGF 质粒的农杆菌单菌落， 接种到 5 毫升 LB 液体培养 基中 ( 含卡那霉素 50mg/L， 链霉素 50mg/L)， 振荡培养过夜， 取 100 微升菌液接种到 50 毫升 LB液体培养基(含卡那霉素50mg/L， 链霉素50mg/L)中， 28， 180rpm振荡培养至OD600为 1， 1500rpm 离心 10 分钟， 菌体用浸染培养基重悬， 使 OD600 为 0.5。 0070 拟南芥或红花等植物的遗传转化 0071 将拟南芥或红花等子叶或下胚轴在重悬的农杆菌菌液中浸泡 15 分钟， 放到含适 当激素配比的MS固体培养基上共培养3天， 之后转到含有潮霉素15mg/。

29、L+头孢霉素250mg/ L 的 MS 固体培养基上进行抗性愈伤组织的筛选及进行芽分化选择培养， 约 8 周左右有抗性 芽出现， 待抗性芽伸长至 2 5 厘米时转至生根培养基上， 一般 15 30 天左右即可生根。 0072 实施例 4 ： 转基因拟南芥、 红化等植物的 PCR 检测 0073 提取转基因拟南芥或红花等植物基因组 DNA， 以基因组 DNA 为模板， 分别以 bFGF 基因的一对引物扩增目的基因 bFGF、 以大豆油体蛋白基因的一对引物扩增大豆油体蛋白基 因、 以大豆油体蛋白基因 5 端引物和 bFGF 基因的 3 端引物扩增融合蛋白基因。扩增 bFGF 基因的 PCR 反应条。

30、件为 ： 94 5 分钟 ； 94 35 秒， 58 35 秒， 72 35 秒， 25 个循环 ； 72 延伸 2 分钟。扩增大豆油体蛋白基因的 PCR 反应条件为 ： 94 5 分钟 ； 94 35 秒， 58 35 秒， 72 1 分钟， 25 个循环 ； 72 延伸 5 分钟。扩增融合蛋白基因的 PCR 反应条件为 ： 94 5 分钟 ； 94 35 秒， 58 35 秒， 72 1 分钟， 25 个循环 ； 72 延伸 5 分钟。分别扩增出预期的 475bp的bFGF基因(含酶切位点和凝血酶切位点)、 678bp的大豆油体蛋白基因及约1150bp 的融合蛋白基因。 0074 实施例 。

31、5 ： 拟南芥和红花籽中 bFGF 目的蛋白的 Western 检测 0075 提取拟南芥籽中和红花籽中的油体蛋白， 经凝血酶切割后过肝素亲和层析柱， 分 离纯化得到 bFGF 纯品， 经 SDS 聚丙烯酰胺凝胶电泳后， 经转膜后用山羊抗兔 bFGF 的多克隆 抗体进行Western分析， 结果表明， 在转基因拟南芥和红花的种子中有bFGF蛋白的表达， 表 达产物大小约为 17kD， 与预期的大小一致， 其表达量占种子总蛋白的 1， 比目前其它植物 表达载体的表达量 ( 一般为植物总可溶蛋白的 0.001 0.01 ) 提高 1000 至 10000 倍， 满 足了生产需求， Western 。

32、结果见附图 2。 0076 实施例 6 ： 油体蛋白与 bFGF 融合蛋白的分离纯化及生物活性测定 0077 1. 拟南芥和红花籽中油体蛋白 bFGF 融合蛋白的提取 0078 (1) 分别取适量拟南芥种子和红花种子， 加 2.5 倍体积的缓冲液 A(0.15M Tricine-KOH pH7.5， 10mMKCI， 1mMMgCl2， 1mMEDTA， 0.6M 蔗糖 ) 研磨， 5000g、 4离心 15 分 说 明 书 CN 101323859 B 8 7/8 页 9 钟。 0079 (2) 上清用含 0.65M 蔗糖的缓冲液 A 重悬。 0080 (3) 液面上覆以等体积的含 O.12。

33、M 蔗糖的缓冲液 A。 0081 (4)15000g、 4离心 25 分钟， 重复两次， 取上清。 0082 至此将油体与种子中的其它成份分开。 0083 (5) 上清中加 2 倍体积的乙醚， 15000g 离心 8 分钟， 上部的乙醚层中多为中性脂 类， 磷脂留在下面的水相中， 取中间的蛋白层。 0084 (6) 以适量含 0.1M 蔗糖的缓冲液 A 重悬蛋白， 加三倍体积的氯仿 / 甲醇 (2:1) 混 合物， 抽提 3 次。 0085 (7) 取中间蛋白层， 用乙醚抽提一次， -70超低温冰箱中冻干保存。 0086 2. 油体蛋白与 bFGF 蛋白的分离 0087 (1) 将油体蛋白 b。

34、FGF 融合蛋白溶于无菌水中， 加入 0.2U 凝血酶， 37酶切过夜。 0088 (4) 将酶切反应液上 Harpin-Sepharose CL-6B 亲和层析柱， 用平衡缓冲液 (10mmol/L PBS， PH7.0， 0.2mol/L NaCl) 洗至基线， 用含 0.6mol/L NaCl 洗除杂蛋白， 再 用含 1.2mol/L NaCl 的 PBS 缓冲液进行洗脱， 收集活性峰， 经 SDS-PAGE、 考马氏亮蓝染色， BandScan 软件分析得到 bFGF 纯品， 纯度达 98。 0089 用 MTT 法测定纯化后 bFGF 蛋白和野生型 bFGF 对 Balb/c3T3 。

35、细胞的促分裂活性。 结果表明， 油体表达 bFGF 纯品的 ED50 为 4.05ng/ml， 野生型 bFGF 的 ED50 为 4.15ng/ml ； 油 体表达得到的 bFGF 蛋白纯品与野生型活性相当， 比野生型活性稍有提高。 0090 序列表 0091 吉林农业大学森母柏澳斯特遗传有限公司 0092 人碱性成纤维细胞生长因子植物表达载体及其应用 0093 0094 1 0095 PatentIn version3.3 0096 1 0097 441 0098 DNA 0099 人工序列 0100 1 0101 说 明 书 CN 101323859 B 9 8/8 页 10 说 明 书 CN 101323859 B 10 1/1 页 11 图 1 图 2 说 明 书 附 图 CN 101323859 B 11 。