检测人癌细胞的多肽及其应用.pdf

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1、(10)授权公告号 CN 101781357 B (45)授权公告日 2012.01.11 CN 101781357 B *CN101781357B* (21)申请号 200910077281.X (22)申请日 2009.01.21 C07K 7/06(2006.01) C07K 17/00(2006.01) G01N 33/68(2006.01) A61K 38/08(2006.01) A61K 47/48(2006.01) A61P 35/00(2006.01) (73)专利权人 中国科学院化学研究所 地址 100080 北京市海淀区中关村北一街 2 号 专利权人 北京大学 (72)发明。

2、人 赵睿 黄嫣嫣 周柔丽 (74)专利代理机构 北京纪凯知识产权代理有限 公司 11245 代理人 关畅 任凤华 WO 2007112097 A2,2007.10.04, 全文 . CN 1510138 A,2004.07.07, 全文 . Gen-Ze Shao 等 .Molecular cloning and characterization of LAPTM4B, a novel gene upregulated in hepatocellular carcinoma. Oncogene .2003, 第 22 卷 5060-5069. Xin-Rong Liu 等 .Structure。

3、 analysis and expressions of a novel tetratransmembrane protein, lysosome-associated protein transmembrane 4 B associated with hepatocellular carcinoma.World Journal of Gastroenterology .2004, 第 10 卷 ( 第 11 期 ),1555-1559. Grit Kasper 等 .The human LAPTM4b transcript is upregulated in various types. C。

4、ancer Letters .2005, 第 224 卷 93-103. (54) 发明名称 检测人癌细胞的多肽及其应用 (57) 摘要 本发明公开了一种检测人癌细胞的多肽及其 应用。 该多肽， 是如下的1)或2)或3)或4) ： 1)序 列表中的序列 1 自氨基末端至少 5 个氨基酸残基 组成 ； 2) 序列表中的序列 2 自氨基末端至少 5 个 氨基酸残基组成 ； 3) 序列表中的序列 3 自氨基末 端至少 5 个氨基酸残基组成 ； 4) 序列表中的序列 4自氨基末端至少5个氨基酸残基组成 ； 所述多肽 还含有取代基， 所述取代基为烷氧基、 烷酰基或酰 胺基。 组成所述多肽的氨基酸残基为L。

5、- 型和/ 或 D- 型。本发明的多肽弥补了抗体等生物制剂制备 繁琐、 稳定性较差、 费用昂贵、 穿透力弱等缺点， 可 用于制备肝癌及其他恶性肿瘤的诊断试剂及治疗 药物。 (51)Int.Cl. (56)对比文件 审查员 许欣嘉 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利 权利要求书 1 页 说明书 8 页 附图 4 页 CN 101781357 B1/1 页 2 1. 一种多肽， 由序列表中的序列 3 所示的氨基酸残基组成。 2. 根据权利要求 1 所述的多肽， 其特征在于 ： 组成所述多肽的氨基酸残基为 L- 型和 / 或 D- 型。 3. 一种多肽偶联物， 是由权利要求 1 。

6、或 2 所述多肽与载体偶联获得的偶联物 ； 所述载 体为药物、 毒素、 细胞因子、 放射性元素、 载体蛋白、 酶、 凝集素、 荧光基团、 量子点或高吸光 系数发色团。 4. 根据权利要求 3 所述的多肽偶联物， 其特征在于 ： 所述载体为酶或荧光基团。 5. 根据权利要求 4 所述的多肽偶联物， 其特征在于 ： 所述酶为辣根过氧化物酶。 6. 根据权利要求 4 所述的多肽偶联物， 其特征在于 ： 所述荧光基团为异硫氰酸荧光素。 7. 一种试剂盒， 其包含权利要求 1 或 2 所述的多肽。 8. 根据权利要求 7 所述的试剂盒， 其特征在于 ： 所述试剂盒用于检测人癌细胞或 LAPTM4B 蛋白。

7、或十肽 EL2。 9. 一种试剂盒， 其包含权利要求 3 至 6 中任一所述的多肽偶联物。 10. 根据权利要求 9 所述的试剂盒， 其特征在于 ： 所述试剂盒用于检测人癌细胞或 LAPTM4B 蛋白或十肽 EL2。 权 利 要 求 书 CN 101781357 B1/8 页 3 检测人癌细胞的多肽及其应用 技术领域 0001 本发明涉及检测人癌细胞的多肽及其应用。 背景技术 0002 肝细胞癌 (Hepatocellular carcinoma， HCC) 是一种世界性的常见恶性肿瘤。发 病率高、 死亡率高、 恶性程度高、 诊断迟、 预后差、 复发率高， 是肝癌的特点。因此， 建立肝癌 的早。

8、期筛查方法， 以及寻找新的有效抗癌药物具有重要意义。 0003 目前， 肝癌血清学诊断的首选标志物为甲胎蛋白 (AFP)， 利用 AFP 抗体检测血清中 的 AFP 已沿用多年。但据权威统计， 部分具有肝硬化或慢性肝炎的患者血清中也可以检测 到 AFP ； 同时， 大约 1/3 的 HCC 患者， 其血清 AFP 却呈阴性 ( 20ng/mL)。因此， AFP 检测法 在特异性和准确性上仍存在缺陷 吴孟超， 原发性肝癌的诊断及治疗进展。中国医学科学 院学报 2008， 30 ： 363-365。此外， 抗体虽然以其特异靶向性在临床诊断中广泛应用， 但存 在着制备繁琐、 稳定性较差、 费用昂贵、。

9、 穿透力弱等缺点。 因此， 为了提高肝癌诊断的特异性 和准确性， 弥补抗体的缺陷， 迫切需要寻求针对新的肝癌标志物设计小分子探针， 以作为检 测和治疗肝癌的有效方法。 0004 自然界存在大量具有生物学活性的多肽， 在机体的生理与病理过程中发挥着重要 作用， 如分子识别、 信号转导、 细胞存活、 增殖、 分化等。由于多肽具有分子量小、 无免疫原 性、 制备简单等特点， 因此针对肝癌标志物合理设计并筛选具有特异靶向性的多肽， 继而发 展成为肝癌的诊断试剂及治疗药物， 是解决上述难题的有效途径。 0005 人肝癌相关基因 LAPTM4B(NCBI Genbank No.NM_018407， Gen。

10、e ID 55353) 是北 京大学基础医学院通过荧光差异显示技术发现的一个肝癌相关新基因， 并首先克隆了其全 长 cDNAG.Z.Shao， R.L.Zhou， Q.Y.Zhang， Y.Zhang， J.J.Liu， J.A.Rui， X.Wei and D.X.Ye， Molecular cloning and characterization of LAPTM4B， a novel gene upregulated in hepatocellular carcinoma.Oncogene， 2003， 22 ： 5060-5069 ； 中国发明专利 ： 周柔丽等 “一 个人肝癌相关基因。

11、及其编码产物与应用” ， 专利号 ZL 02158110X。LAPTM4B 基因及其编码 的 LAPTM4B 蛋白不仅在 85以上的人肝癌组织中过表达 ； 也在人肺癌、 肝外胆管癌、 胆囊 癌、 卵巢癌、 乳腺癌、 子宫癌、 宫颈癌、 膀胱癌、 前列腺癌、 结肠癌等恶性肿瘤中高表达 ； 而在 各种分化的正常上皮细胞则呈低表达。 LAPTM4B的过表达具有促进细胞恶性转化作用， 而且 还可促进细胞的迁移和侵袭， 与肿瘤细胞的转移潜能相关 X.R.Liu， R.L.Zhou， Q.Y.Zhang， Y.Zhang， Y.Y.Jin， M.Lin， J.A.Rui and D.X.Ye， Struc。

12、ture analysis andexpressions of a novel tetratransmembrane protein， lysosome-associatedprotein transmembrane 4 associated with hepatocel lular carcinoma.WorldJ.Gastroenterol.， 2004， 10 ： 1555-1559。 LAPTM4B基因在肝癌、 肝外胆管癌、 胆囊癌、 卵巢癌等组织中表达上调的幅度也 与肿瘤的分化状态和肿瘤患者的生存期呈负相关， 与病理分级 ( 恶性度 ) 呈正相关。 发明内容 说 明 书 CN 101。

13、781357 B2/8 页 4 0006 本发明的目的是提供一种检测人癌细胞的多肽及其应用。 0007 本发明所提供的多肽， 是如下的 1) 或 2) 或 3) 或 4) ： 0008 1) 序列表中的序列 1 自氨基末端至少 5 个氨基酸残基组成 ； 0009 2) 序列表中的序列 2 自氨基末端至少 5 个氨基酸残基组成 ； 0010 3) 序列表中的序列 3 自氨基末端至少 5 个氨基酸残基组成 ； 0011 4) 序列表中的序列 4 自氨基末端至少 5 个氨基酸残基组成 ； 0012 其中， 所述多肽具体可是如下的 5) 或 6) 或 7) 或 8) ： 0013 5) 序列表中的序列。

14、 1 所示的氨基酸残基组成 ； 0014 6) 序列表中的序列 2 所示的氨基酸残基组成 ； 0015 7) 序列表中的序列 3 所示的氨基酸残基组成 ； 0016 8) 序列表中的序列 4 所示的氨基酸残基组成 ； 0017 所述多肽还含有取代基， 所述取代基为烷氧基、 烷酰基或酰胺基。 0018 所述多肽的氨基酸残基可以是 L- 型， 也可以是 D- 型， 或 L-、 D- 型混合型。 0019 本发明的另一个目的是提供一种多肽偶联物。 0020 本发明所提供的多肽偶联物是由所述多肽与载体偶联获得的偶联物 ； 所述载体为 药物、 毒素、 细胞因子、 放射性元素、 载体蛋白、 酶、 凝集素、。

15、 荧光基团、 量子点或高吸光系数 发色团。 0021 所述载体可以根据具体的目的选择， 如载体为药物或细胞因子等， 可将药物或者 细胞因子靶向癌细胞。也可用放射性元素、 载体蛋白、 酶、 凝集素、 荧光基团、 量子点或高吸 光系数发色团作为载体， 如用辣根过氧化物酶或异硫氰酸荧光素为载体获得的偶联物可以 作为检测探针， 检测癌细胞。 0022 本发明的再一个目的是提供一种试剂盒。 0023 本发明所提供的试剂盒， 其包含所述的多肽偶联物或所述的多肽。 0024 所述试剂盒可用于检测人癌细胞或 LAPTM4B 蛋白或人肝癌等癌标志物十肽 EL2。 如含有所述多肽辣根过氧化物酶偶联物的试剂盒可以用。

16、酶联免疫吸附法 (ELISA) 检测 LAPTM4B 蛋白或十肽 EL2。如含有所述多肽异硫氰酸荧光素偶联物的试剂盒可用激光扫描 共聚焦显微镜检测人癌细胞。 所述人癌细胞可为人肝癌、 人肺癌、 肝外胆管癌、 胆囊癌、 卵巢 癌、 乳腺癌、 子宫癌、 宫颈癌、 膀胱癌、 前列腺癌或结肠癌等癌细胞。 0025 本发明的多肽与人肝癌等癌标志物十肽 EL2 结合能力强， 并具有良好的特异性。 上述多肽及多肽偶联物能特异性地结合于人肝癌等癌细胞表面以及释放到体液， 包括血 液、 胸水、 腹水、 尿液等之中的 LAPTM4B 蛋白， 进而达到检测人肝癌等癌细胞及其排出物的 目的。本发明的多肽及多肽偶联物除。

17、了能特异性地结合于人肝癌等癌细胞表面的 LAPTM4B 蛋白外， 还能够进入人肝癌等癌细胞， 特异性地结合于细胞内部的 LAPTM4B 蛋白， 可作为人 肝癌等癌的诊断试剂， 弥补了抗体等生物制剂制备繁琐、 稳定性较差、 费用昂贵、 穿透力弱 等缺点。 附图说明 0026 图 1 为键合人肝癌等癌标志物十肽 EL2 的 PGMA 微球表面结构示意图。 0027 图 2 为不同条件下， 反义肽在亲和筛选系统中的保留因子 k。 说 明 书 CN 101781357 B3/8 页 5 0028 图 3 为反义肽 AP2H 与人肝癌等癌标志物十肽 EL2 解离常数的测定。 0029 图 4 为酶联免疫。

18、吸附法鉴定反义肽 AP2H 与人肝癌等癌标志物十肽 EL2 的特异性 结合。 0030 图 5 为 AP2H 与人肝癌细胞系 BEL-7402 的特异性结合。 0031 图 6 为 AP2H 在人肝癌细胞系 BEL-7402 亚细胞结构的分布。 0032 图 7 为 AP2H 与人肝癌细胞系 HepG2 的特异性结合。 具体实施方式 0033 LAPTM4B 全长 ORF 编码一个 35kD 的 4 次跨膜的蛋白质， 其具有两个胞外区， 可以 与生长因子受体和整合素受体相结合， 接受细胞外的信号并启动相关的信号转导。 LAPTM4B 蛋白第3、 第4穿膜区之间的第二胞外区含有与人类其他蛋白质无。

19、同源性的十肽序列EL2(N 端 232-241aa)。EL2 十肽亲水性好， 无糖基化和磷酸化位点。将 EL2 与钥孔虫戚血蓝蛋白 (KLH) 载体偶联作为免疫原制备的高效价的多克隆抗体对细胞和组织中的 LAPTM4B 蛋白进 行鉴定， 证明其既可与细胞、 组织中原位的 LAPTM4B 蛋白相结合， 也可与经 SDS 电泳变性的 LAPTM4B蛋白相结合。 因此， 上述LAPTM4B蛋白第二胞外区中的十肽EL2可作为检测人肝癌 等癌的标志物。 0034 在生物学上， 遗传密码具有简并性， 也就是说， 在大多数情况下一个氨基酸可以具 有两个或者更多的密码子， 这就意味着正义肽链上的某一个氨基酸残。

20、基有可能与一组不同 的反义氨基酸残基相配对。因此， 一条给定的正义肽可能对应多条反义肽， 并具有不同的 相互作用， 这一现象称之为反义肽的简并性 R.Zhao， X.Yu， H.Liu， L.L.Zhai， S.X.Xiong， T.S.Su， G.Q.Liu， Study on the Degeneracy ofAntisense Peptides using Affinity Chromatography， J Chromatogr.A， 2001， 913 ： 421-428。 0035 基于此， 本发明的发明人针对人肝癌等癌细胞 LAPTM4B 蛋白第二胞外区中十肽 EL2， 特别是其。

21、中的缬氨酸残基， 设计了该十肽的四条简并反义肽， 分别命名为 AP2D， AP2Y， AP2H 和 AP2N， 其序列如表 1 所示。 0036 表 1. 人肝癌等癌标志物十肽 EL2 序列和反义肽序列 0037 说 明 书 CN 101781357 B4/8 页 6 0038 采用化学合成的方法制备本发明涉及的多肽， 即固相肽合成方法 (Boc 方法或 Fmoc 方法 )E.Atherton， R.C.Sheppard，“Solid Phase Peptide Synthesis ： APractical Approach” ， IRL Press， Oxford， England， 198。

22、9。具体方法为将被保护的氨基酸逐个偶联 到固相树脂上， 然后在强酸下将肽链从树脂上裂解， 同时去除侧链保护基团。 0039 以下结合具体实施例， 进一步阐述本发明。 应理解， 这些实施例仅用于说明本发明 而不用于限制本发明的范围。 0040 下述实施例中如无特殊说明所用方法均为常规方法， 所用试剂均可从商业途径获 得。 0041 实施例 1、 与人癌细胞特异性结合的多肽 0042 1) 亲和筛选系统的构建 0043 用甲基丙烯酸环氧丙脂和甲基丙烯酸乙二醇双酯共聚制备无孔、 粒径单分散的 聚甲基丙烯酸环氧丙酯 (PGMA) 微球 (10 微米 )， 方法参考如下文献 ： R.Zhao， C.L.。

23、Fang， X.Yu， Y.Liu， J.Luo， D.H.Shangguan， S.X.Xiong， G.Q.Liu， Screeningof inhibitors for influenza A virus using high performance affinitychromatography and combinatorial peptide libraries， J.Chromatogr.A， 2005， 1064 ： 59-66。 0044 以上述 PGMA 微球作为固相基质制备高效亲和色谱填料。 0045 用 0.2mol/L H2SO4处理上述 PGMA 微球 6 小时， 使。

24、其表面的环氧基开环 ； 然后将开 环后的 PGMA 微球与 2.4mol/L NaOH 水溶液混合， 并加入环氧氯丙烷， 在 50条件下， 使其 与环氧氯丙烷反应 4 小时 ； 反应结束后， G4 漏斗抽滤， 并用大量三蒸水洗涤 PGMA 微球至中 性， 再用乙醇洗涤三次， 真空干燥 4.5 小时， 制得表面富含环氧基的 PGMA 微球。用 Keen s 法测定 R.T.Keen， Determination of oxetanes.Anal.Chem.1957， 29 ： 1041-1044PGMA 微 球表面环氧基含量， 测定结果表明上述 PGMA 微球表面环氧基含量为 0.43mmol/。

25、g 干燥 PGMA 微球。 0046 将 20.0mg 十肽 EL2 溶解于 2mL Na2CO3水溶液 (0.2mol/L)， 与 1.55g 表面富含环 氧基的 PGMA 微球混合， 37振摇反应 72 小时后， G4 漏斗抽滤过滤， 三蒸水洗涤 PGMA 微球 三次， 抽干， 收集上述滤液和洗涤液。采用液相色谱外标定量法， 测定键合反应前后反应液 中 EL2 的含量 (C18反相色谱柱 ； 流动相为 ： A ： 0.1 ( 体积百分含量 ) 三氟乙酸的水溶液、 B ： 0.1(体积百分含量)三氟乙酸的乙腈溶液， 流速为1.0mL/min ； 淋洗梯度为 ： 0-30min， 95 ( 体。

26、积百分含量 )A+5 ( 体积百分含量 )B 至 50 ( 体积百分含量 )A+50 ( 体积 百分含量 )B)。以此， 计算 EL2 在 PGMA 微球上的键合量。计算结果表明， EL2 的键合量为 6.0mol/g 干燥 PGMA 微球。最后， 将键合十肽 EL2 的微球与 10mL 乙醇胺HCl 水溶液 (1.0mol/L， pH 9.0)混合反应8小时， 以封闭残余的环氧基， 制得以EL2为配基的亲和填料， 其结构如图1所示。 将上述固定有十肽EL2的PGMA微球装入不锈钢色谱柱中(70mm4.0mm i.d.)， 即得到亲和柱。采用相同的制备方法但不加入十肽 EL2 进行反应， 即可。

27、得到空白柱。 将亲和柱连接于高效液相色谱仪， 构建成亲和筛选系统。 0047 2) 与十肽 EL2 特异性结合的多肽的筛选 0048 利用上述构建的亲和筛选系统， 筛选与人肝癌等癌标志物十肽 EL2 特异性结合 的多肽。流动相为 10mmol/L 磷酸盐缓冲液 +100mmol/L NaCl(pH 5.5 或 pH 7.4)， 流速为 0.1mL/min， 紫外检测器的检测波长为220nm。 通过进样阀分别注入AP2D， AP2Y， AP2H和AP2N 说 明 书 CN 101781357 B5/8 页 7 四种不同反义肽水溶液 ( 多肽浓度均为 0.16mg/mL ； 进样量 5L)， 记录。

28、亲和色谱图。 0049 色谱图结果表明， AP2D， AP2Y， AP2H 和 AP2N 四种反义肽在亲和柱上具有不同程度 的结合， 而在空白柱中不存在结合。通过进样阀注入牛血清白蛋白 (BSA)， 其在亲和筛选系 统不保留， 上述实验结果表明 AP2D， AP2Y， AP2H 和 AP2N 四种反义肽与 EL2 具有特异性的结 合能力。 0050 四种反义肽在亲和柱上的保留因子 k 的比较结果如图 2 所示， AP2H 在亲和柱上具 有最强的保留， 即 AP2H 与 EL2 的亲和作用力最强 ； 并且， 当流动相 pH 值为 5.5 时， AP2H 与 EL2 的结合更为显著。因为体内肿瘤组。

29、织的微环境也呈现弱酸性， 所以 AP2H 在弱酸性条件 下更强地结合 EL2 的性质使其成为更有效、 更具特异性的检测探针。 0051 3) 与十肽 EL2 特异性结合的多肽的特异性检验 0052 设计了与反义肽 AP2H 具有相同氨基酸组成， 但氨基酸排列顺序不同的对照多肽 R OP(HOOC-I-G-H-S-I-H-V-I-H-G-NH2)。用 1) 构建的亲和筛选系统进行检测。结果表明， 虽 然 ROP 和 AP2H 具有相同的氨基酸组成以及相同的等电点， 但是与 AP2H 相比， ROP 在亲和筛 选系统保留很弱 ( 图 2)， 说明 AP2H 与 EL2 的相互作用具有序列专一性。 。

30、0053 4) 反义肽 AP2H 与十肽 EL2 结合能力的定量分析 0054 利用 1) 构建的亲和筛选系统， 测定反义肽 AP2H 与十肽 EL2 的解离常数。反 义肽 AP2H 用磷酸缓冲盐溶液 (PBS， pH 5.5) 溶解， 配制成浓度分别为 5.6910-6mol/L， 1.1410-5mol/L， 1.7110-5mol/L 和 2.2810-5mol/L 的溶液。以上述溶液分别为流动相 通过亲和筛选系统， 流速为 0.5mL/min， 紫外检测器的检测波长为 220nm。 0055 结果如图 3 所示， 在前沿色谱图中 ( 图 3A)， 随着反义肽 AP2H 溶液进样到亲和 。

31、筛选系统， 紫外吸收信号最终达到平台即饱和吸附状态。根据前沿色谱理论 Y.Shai， M.Flashner， I.M.Chaiken， Anti-sense peptide recognition of sensepeptides ： direct quantitative characterization with the ribonucleaseS-peptide system using analytical high-performance affinity chromatography.Biochemistry， 1987， 26 ： 669-675， 从前沿色谱图可以得到 1/(V。

32、-V0) 的值 ( 其中 V 为亲和柱半饱和时所需多肽溶液 的体积 ； V0为死体积， 此处以 NaNO3溶液测定死体积 )。以反义肽 AP2H 溶液的浓度 P0对 1/(V-V0) 拟合直线 ( 图 3B)， 然后根据公式 (1) 以及所拟合直线的斜率和截距的比例， 计算 得到反义肽 AP2H 与 EL2 的解离常数 Kd为 5.5110-6mol/L， 表明反义肽 AP2H 与十肽 EL2 具 有强结合能力。 0056 公式 (1) ： 0057 5) 酶联免疫吸附法鉴定反义肽 AP2H 与十肽 EL2 的特异性结合 0058 以人肝癌等癌标志物十肽 EL2 与钥孔虫戚血蓝蛋白 (KLH)。

33、( 购自 Sigma-Aldrich 公司， 产品编号 ： H7017) 偶联后包被酶标板 ( 包被液中 EL2 的浓度为 1g/mL)， 每孔 100L， 4过夜。 弃去包被液， 3BSA封闭酶标板， 每孔300L ； 37封闭2小时后， 弃液， 洗涤酶标板 3 次。用改良的过碘酸钠氧化法 李成文，现代免疫化学技术 ， 上海科学技术 出版社， 1992年， 109-120制备AP2H-HRP(AP2H-辣根过氧化物酶)偶联物。 将AP-HRP偶联 物溶于磷酸缓冲盐溶液(PBS， pH 5.5或pH 7.4)， 配制成不同浓度。 将不同浓度的AP2H-HRP 溶液分别加入酶标板， 每孔 100。

34、L， 37孵育 2 小时。甩掉 AP2H-HRP 溶液， 洗涤 5 次， 加入 说 明 书 CN 101781357 B6/8 页 8 底物显色液， 每孔 100L， 室温避光静置 10 分钟， 加入 2mol/L H2SO4终止液， 每孔 50L。 显色结果用酶标仪测定波长 492nm 处吸光值。以 BSA 包被酶标板， 其余步骤不变作为对照 实验。 0059 实验结果表明， 反义肽AP2H与人肝癌等癌标志物十肽EL2的结合呈饱和吸附模式 ( 图 4) ； 即使 EL2 偶联于载体蛋白 KLH 上， 反义肽 AP2H 仍能特异性对其进行识别， 说明反义 肽 AP2H 可以通过识别人肝癌等癌标。

35、志物十肽 EL2 特异性地结合人癌细胞 LAPTM4B 蛋白， 可 以发展成为一种新型的人肝癌等癌症的快速诊断试剂。 0060 实施例 2、 人肝癌快速诊断试剂 0061 1) 反义肽 AP2H- 异硫氰酸荧光素 (FITC) 偶联物 0062 用碳酸盐缓冲液 (0.09mol/L NaHCO3， 0.01mol/L Na2CO3， 0.126mol/L NaCl ； pH 9.0)溶解反义肽AP2H， 得到反义肽AP2H溶液， 其浓度为2mg/mL ； 异硫氰酸荧光素(FITC)溶 于二甲基亚砜 (DMSO)， 其浓度为 12.5mg/mL。将上述反义肽 AP2H 溶液与 FITC 溶液以体。

36、积 比 2 1 混合， 室温避光反应 ； 2 小时后， 反应产物用高效液相色谱进行纯化。 0063 采用 C8反相色谱柱 (250nm10mm i.d.) 分离纯化反应产物中的 AP2H-FITC 偶 联物。流动相为 ； A ： 0.1 ( 体积百分含量 ) 三氟乙酸的水溶液、 B ： 0.1 ( 体积百分含 量 ) 三氟乙酸的乙腈溶液， 流速为 2.8mL/min ； 淋洗梯度为 ： 0-20-30-35min， 10 ( 体积百 分含量 )B-40 ( 体积百分含量 )B-80 ( 体积百分含量 )B-80 ( 体积百分含量 )B 时， AP2H-FITC 色谱峰的保留时间为 23.00m。

37、in。收集该色谱峰进行冷冻干燥， 得到黄色固体。 基质辅助激光解析质谱对所得黄色固体进行鉴定， 质谱图中质荷比 (m/z)1459.6 的峰即 AP2H-FITC 分子的加 H+峰， 证明该黄色固体即 AP2H-FITC 偶联物。多肽 ROP 按照上述方法 与 FITC 偶联， 获得 ROP-FITC 偶联物作为对照。 0064 2)AP2H 与人肝癌细胞系 BEL-7402 的特异性结合 0065 人肝癌细胞系 BEL-7402 细胞 刘歆荣等， 人肝癌相关新基因编码产物 LAPTM4B 的 鉴定及其生物学特性， 北京大学学报， 2003， 35 ： 340-347( 中国科学院化学研究所北。

38、京大 学 ) 培养于含 100mL/L 胎牛血清的 RPMI 1640(GIBco BRL) 培养基中， 以 1105/mL 的细胞 浓度植入圆形玻底培养皿 ( 35mm)， 37， 5 CO2细胞培养箱中培养 24 小时后， 弃去培 养液， 加入用磷酸缓冲盐溶液 (PBS) 溶解的 AP2H-FITC(6.8510-5mol/L， 冰浴预冷 ) ； 对照 组加入相同摩尔浓度的用磷酸缓冲盐溶液 (PBS) 溶解的 ROP-FITC( 冰浴预冷 ) ； 冰浴避光 孵育 1 小时后， 分别弃去 AP2H-FITC 和 ROP-FITC 溶液， 并用 PBS 洗涤 6 次。用激光扫描共 聚焦显微镜 。

39、(Olympus FV1000-IX81， 日本 ) 检测细胞中的荧光分布。 0066 结果如图 5 所示， 加入 AP2H-FITC 的 BEL-7402 细胞观测到绿色荧光， 而对照组的 BEL-7402细胞则没有观测到绿色荧光信号， 说明AP2H-FITC偶联物与肝癌细胞BEL-7402的 识别是序列专一性的。 0067 3)AP2H 在人肝癌细胞系 BEL-7402 亚细胞结构的定位 0068 为了观察AP2H在人肝癌细胞的亚细胞结构的定位， 用AP2H-FITC与Hoechst33342 对 BEL-7402 细胞进行了双染实验。Hoechst 33342 是一种显示细胞核的蓝色荧光。

40、染料。 1105/mL 浓度的 BEL-7402 细胞植入圆形玻底培养皿中并在细胞培养箱中培养 24 小时 ； 弃去培养液后， 加入含有 1mol/L Hoechst 33342 的 AP2H-FITC 溶液 (AP2H-FITC 浓度为 6.8510-5mol/L， 冰浴预冷)， 冰浴避光孵育1小时后， 弃去含Hoechst 33342的AP2H-FITC 说 明 书 CN 101781357 B7/8 页 9 溶液 ； 用 PBS 洗涤细胞 6 次后检测细胞中的荧光分布。 0069 结果表明， AP2H-FITC 结合在 BEL-7402 细胞的细胞膜和细胞质， 在细胞质中呈 团块状分布 。

41、； AP2H-FITC 不与 BEL-7402 细胞的细胞核结合， 但在细胞核周围呈局部聚 集状态 ( 图 6)。这个结果与免疫组化法对 LAPTM4B 蛋白的定位结果一致 G.Z.Shao， R.L.Zhou， Q.Y.Zhang， Y.Zhang， J.J.Liu， J.A.Rui， X.Weiand D.X.Ye， Molecular cloning and characterization of LAPTM4B， a novel geneupregulated in hepatocellular carcinoma.Oncogene， 2003， 22 ： 5060-5069， 说明 。

42、AP2H-FITC 与肝癌细胞的结合位点即 LAPTM4B 蛋白。 0070 4)AP2H 与人肝癌细胞系 HepG2 的特异性结合 0071 人肝癌细胞系 HepG2( 购自 American Type Culture Collection， ATCC) 经过 RNAi(shRNA) 质粒及其空载质粒转染， 筛选出稳定的低 LAPTM4B 蛋白表达的 HepG2-RNAi 细 胞和高表达 LAPTM4B 蛋白的 HepG2-mock 细胞 魏渲辉， 一个肿瘤相关新基因 LAPTM4B 编 码蛋白质的结构与功能的进一步研究， 博士学位论文， 北京大学， 2005 ； 熊富霞， LAPTM4B-。

43、35 蛋白在肝癌生长与转移中的作用及其分子机制的研究， 博士学位论文， 北京大学， 2008( 中 国科学院化学研究所北京大学 )。 0072 上述两种细胞分别培养于含100mL/L胎牛血清的RPMI 1640培养基中。 以1105/ mL 的细胞浓度分别植入圆形玻底培养皿， 37， 5 CO2细胞培养箱中培养 24 小时后， 弃去 培养液， 分别加入用 PBS 溶解的 AP2H-FITC(6.8510-5mol/L， 冰浴预冷 )， 冰浴避光孵育 1 小时后， 分别弃去 AP2H-FITC 溶液， 并用 PBS 洗涤 6 次。用激光扫描共聚焦显微镜检测细胞 中的荧光分布。 0073 结果如图。

44、 7 所示， 加入 AP2H-FITC 的 HepG2-mock 细胞观测到明显的绿色荧光 ； 加 入 AP2H-FITC 的 HepG2-RNAi 细胞观测到的绿色荧光强度显著减弱， 证明 AP2H 是通过特异 性结合 LAPTM4B 蛋白而检测肝癌细胞的， AP2H 可用于组织化学和细胞化学鉴定组织或细胞 中 LAPTM4B 蛋白的表达水平， 具有诊断肿瘤和评价其恶性度的应用价值。 0074 序列表 0075 中国科学院化学研究所 北京大学 0076 检测人癌细胞的多肽及其应用 0077 CGGNARW92051 0078 4 0079 1 0080 10 0081 PRT 0082 人工。

45、序列 0083 0084 0085 1 0086 Ile Asp Gly His His Ile Ile Ser Val Gly 0087 1 5 10 0088 2 说 明 书 CN 101781357 B8/8 页 10 0089 10 0090 PRT 0091 人工序列 0092 0093 0094 2 0095 Ile Tyr Gly His His Ile Ile Ser Val Gly 0096 1 5 10 0097 3 0098 10 0099 PRT 0100 人工序列 0101 0102 0103 3 0104 Ile His Gly His His Ile Ile Ser Val Gly 0105 1 5 10 0106 4 0107 10 0108 PRT 0109 人工序列 0110 0111 0112 4 0113 Ile Asn Gly His His Ile Ile Ser Val Gly 0114 1 5 10 说 明 书 CN 101781357 B1/4 页 11 图 1 图 2 说 明 书 附 图 CN 101781357 B2/4 页 12 图 3 图 4 说 明 书 附 图 CN 101781357 B3/4 页 13 图 5 图 6 说 明 书 附 图 CN 101781357 B4/4 页 14 图 7 说 明 书 附 图 。