水解大豆蛋白产生外啡肽的方法.pdf

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1、(10)授权公告号 CN 101691596 B (45)授权公告日 2012.02.29 CN 101691596 B *CN101691596B* (21)申请号 200910073055.4 (22)申请日 2009.10.15 C12P 21/06(2006.01) (73)专利权人 哈尔滨商业大学 地址 150076 黑龙江省哈尔滨市道里区通达 街138号哈尔滨商业大学36#食品工程 学院 209 室 (72)发明人 石彦国 孙冰玉 胡春林 (74)专利代理机构 哈尔滨市哈科专利事务所有 限责任公司 23101 代理人 吴振刚 WO 2008148891 A2,2008.12.11,。

2、 CN 1579387 A,2005.02.16, CN 1344138 A,2002.04.10, 孙冰玉 等 . 小鼠输精管模型法检测大豆酶 解液外啡肽的研究 .中国食品科学技术学会第 五届年会暨第四届东西方食品业高层论坛论文摘 要集 .2007,48. (54) 发明名称 水解大豆蛋白产生外啡肽的方法 (57) 摘要 水解大豆蛋白产生外啡肽的方法， 它涉及了 水解蛋白产生特定肽类的方法。本发明解决了采 用现有的方法水解大豆蛋白忽略了阿片肽所具有 的生理功能和安全隐患的问题。本发明四种方法 分别采用胰蛋白酶 / 碱性酶、 胰蛋白酶 / 中性酶、 胰碱性酶/中性酶及酸性蛋白酶/胃蛋白蛋酶， 。

3、在 相应的条件下进行。本发明四种水解方法确定了 同步水解大豆蛋白产生外啡肽的条件及产生量， 同步水解产生外啡肽方法的确定为大豆蛋白的后 加工的安全性、 大豆肽食品的发展奠定了基础。 (51)Int.Cl. (56)对比文件 审查员 唐宁 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利 权利要求书 1 页 说明书 3 页 附图 3 页 CN 101691596 B1/1 页 2 1. 水解大豆蛋白产生外啡肽的方法， 其特征在于水解大豆蛋白产生外啡肽的方法按 照如下方法进行 ： 采用胰蛋白酶 / 碱性酶， 在 pH 值为 8.0、 温度为 55、 酶与底物浓度比为 1 3 的条件下酶解 5。

4、h。 权 利 要 求 书 CN 101691596 B1/3 页 3 水解大豆蛋白产生外啡肽的方法 技术领域 0001 本发明涉及水解蛋白产生特定肽类的方法。 背景技术 0002 近年来对食物来源的生物活性肽研究发展很快， 由于大豆资源丰富， 是一种比较 廉价、 易得的蛋白原料， 因此对大豆肽的研究、 开发和生产更是异常活跃。随着大豆深加工 产品开发的不断深入， 大豆肽作为一种新的大豆制品受到了广泛关注， 以大豆多肽为原料 的功能食品也不断被开发出来， 成为食品研究领域的一个热点。但从总体来看， 对于大豆 肽研究开发多偏重于其功能特性及应用方面的研究， 而对大豆肽的食品安全问题却研究较 少， 。

5、几乎空白。 0003 外啡肽具有较为广泛的源， 甚至是肉类和波菜的蛋白片段当中也存在具有阿片配 体活性的肽类。外啡肽隐藏在如乳蛋白、 小麦谷蛋白、 大米白蛋白、 玉米蛋白、 大麦醇溶蛋 白、 - 大豆蛋白、 牛血清蛋白和血红蛋白等食物蛋白分子序列的片段中， 可通过适当的酶 解作用释放出来。而目前水解方法仅针对肽链长度要求而设计的， 并没有对肽链末端的氨 基酸残基而制定， 因此制得的肽类产品只强调其具有大豆的营养价值及易被人体吸收， 而 其是否有阿片肽， 有哪种阿片肽， 是否还具有其他生理功能及安全性隐患。 发明内容 0004 本发明是为了解决采用现有的方法水解大豆蛋白忽略了阿片肽所具有的生理功。

6、 能和安全隐患的问题， 而提供水解大豆蛋白产生外啡肽的方法。 0005 本发明第一种水解大豆蛋白产生外啡肽的方法按照如下方法进行 ： 采用胰蛋白酶 / 碱性酶 (Alcalase)， 在 pH 值为 8.0、 温度为 55、 酶与底物浓度比为 1 3 的条件下酶解 5h。 0006 本发明第二种水解大豆蛋白产生外啡肽的方法按照如下方法进行 ： 采用胰蛋白酶 / 中性酶 (Neutras)， 在 pH 值为 7.5、 温度为 55、 酶与底物浓度比为 2 1 的条件下酶解 5h。 0007 本发明第三种水解大豆蛋白产生外啡肽的方法按照如下方法进行 ： 采用胰碱性酶 / 中性酶(Alcalase/。

7、Neutras)， 在pH值为7.5、 温度为55、 酶与底物浓度比为31的条件下 酶解 5h。 0008 本发明第四种水解大豆蛋白产生外啡肽的方法按照如下方法进行 ： 酸性蛋白酶 / 胃蛋白蛋酶， 在 pH 值为 2.5、 温度为 37、 酶与底物浓度比为 2 1 的条件下酶解 5h。 0009 本发明四种方法均具有以下优点 ： 1、 本发明首次提出了大豆蛋白在酶同步水解后 产生大豆外啡肽的概念， 确定了同步水解产生外啡肽的条件及产生量 ； 2、 同步水解产生外 啡肽方法的确定为大豆蛋白的后加工的安全性、 大豆肽食品的发展奠定了基础 ； 3、 本发明 的水解方法专门针对产品存在目标外啡肽- 。

8、酪啡肽而设计的， 使蛋白肽产品具有更 强的生理功能， - 酪啡肽具有阿片样活性， 能够明显提高外周胰岛素和胃泌素的分泌， 对 胰高血糖素的分泌也有促进作用 ； - 酪啡肽能与在胃肠道和中枢神经中存在与摄食相关 的前体结合后经神经传导作用于摄食中枢， 从而影响摄食行为 ； 可以调节消化道运动。 说 明 书 CN 101691596 B2/3 页 4 附图说明 0010 图 1 为具体实施方式一水解产物的液相色谱图， 0011 图 2 为具体实施方式二水解产物的液相色谱图， 0012 图 3 为具体实施方式三水解产物的液相色谱图， 0013 图 4 为具体实施方式四水解产物的液相色谱图， 0014。

9、 图 5 为小鼠输精管模型装置。 0015 其中， 图 5 中 1 表示张力换能器， 2 表示导电线， 3 表示刺激器， 4 表示螺丝夹， 5 表 示铂电极， 6 表示热水入口， 7 表示麦氏浴槽， 8 表示导气管， 9 表示热水出口， 10 表示肠或输 精管， 表示通氧气或空气的方向 具体实施方式 0016 本发明技术方案不局限于以下所列举具体实施方式， 还包括各具体实施方式间的 任意组合。 0017 具体实施方式一 ： 本实施方式水解大豆蛋白产生外啡肽的方法按照如下方法进 行 ： 采用胰蛋白酶 / 碱性酶， 在 pH 值为 8.0、 温度为 55、 酶与底物浓度比为 1 3 的条件 下酶解。

10、 5h。 0018 本实施方式中胰蛋白酶的最佳用量为 8000U/g， 碱性酶的最佳用量为 6000U/g。 0019 本实施方式水解大豆蛋白产生外啡肽的方法水解大豆蛋白产生外啡肽为拮抗剂， 平均肽链长度 7.85。 0020 本实施方式的水解产物的液相色谱图如图 1 所示， 从图 1 中可以看出本实施方式 的水解大豆蛋白产生外啡肽为拮抗剂。 0021 具体实施方式二 ： 本实施方式水解大豆蛋白产生外啡肽的方法按照如下方法进 行 ： 采用胰蛋白酶 / 中性酶， 在 pH 值为 7.5、 温度为 55、 酶与底物浓度比为 2 1 的条件 下酶解 5h。 0022 本实施方式中胰蛋白酶的最佳用量为。

11、 8000U/g， 中性酶的最佳用量为 6000U/g。 0023 本实施方式水解大豆蛋白产生外啡肽的方法水解大豆蛋白， 产生外啡肽为激动 剂， 目标外啡肽百分含量 0.007275， 平均肽链长度 7.85。 0024 本实施方式的水解产物的液相色谱图如图 2 所示， 从图 2 中可以看出本实施方式 的水解大豆蛋白产生外啡肽为激动剂。 0025 具体实施方式三 ： 本实施方式水解大豆蛋白产生外啡肽的方法按照如下方法进 行 ： 采用胰碱性酶 / 中性酶 (Alcalase/Neutras)， 在 pH 值为 7.5、 温度为 55、 酶与底物浓 度比为 3 1 的条件下酶解 5h。 0026 。

12、本实施方式中碱性酶的最佳用量为 6000U/g， 中性酶的最佳用量为 6000U/g。 0027 本实施方式水解大豆蛋白产生外啡肽的方法水解大豆蛋白， 产生外啡肽为激动 剂， 目标外啡肽百分含量 0.01228， 平均肽链长度 6.68。 0028 本实施方式的水解产物的液相色谱图如图 3 所示， 从图 3 中可以看出本实施方式 的水解大豆蛋白产生外啡肽为激动剂。 0029 具体实施方式四 ： 本实施方式水解大豆蛋白产生外啡肽的方法按照如下方法进 说 明 书 CN 101691596 B3/3 页 5 行 ： 酸性蛋白酶 / 胃蛋白蛋酶， 在 pH 值为 2.5、 温度为 37、 酶与底物浓度。

13、比为 2 1 的条 件下酶解 5h。 0030 本实施方式中酸性蛋白酶的最佳用量为 8000U/g， 胃蛋白蛋酶的最佳用量为 4000U/g。 0031 本实施方式水解大豆蛋白产生外啡肽的方法水解大豆蛋白， 产生外啡肽为激动 剂， 目标外啡肽百分含量 0.083065， 平均肽链长度 5.91。 0032 本实施方式的水解产物的液相色谱图如图 4 所示， 从图 4 中可以看出本实施方式 的水解大豆蛋白产生外啡肽为激动剂。 0033 将具体实施方式一至四的水解产物采用小鼠输精管模型进行验证， 验证装置如图 5 所示， 验证所用药剂及浓度为 ： 纳络酮的浓度为 5mg/ml， 样品的浓度为 200。

14、mg/mL ； 反应器 ( 放置输精管的玻璃容器 ) 体积为 20ml， 改变加入的样品体积， 即为改变加入的样品的量。 小鼠输精管试验结果及处理如表 1 所示， 表 1 中 n 5， xs， 1 号样品为具体实施方式一 的水解产物， 2 号样品为具体实施方式二的水解产物， 3 号样品为具体实施方式三的水解产 物， 4 号样品为具体实施方式四的水解产物， 收缩活动通过等张换能器用记录仪记录， 以记 录仪电讯号 ( 电压 mV 灵敏度 /mV/cm 收缩高度 /cm) 的变化记录收缩反应， 结果以均数 标准差 (xs) 表示， 选用受试药物 4 5 个不同的浓度， 测定其抑制电刺激标本收缩的 百。

15、分率和样品半数抑制剂量 IC50 值。在样品浓度确定下， 改变样品加入体积即相当改变样 品的加入量。如果加入样品后小鼠输精管既没有表现有收缩也没有舒张迹象， 说明这类样 品既没有阿片活性， 也没有拮抗活性， 表明这类样品不产生外啡肽。 0034 表 1 小鼠输精管试验结果及处理表 0035 0036 * ： P 0.05 ； * ： P 0.01 0037 从表 1 中的数据可以看出， 具体实施方式一的水解产生外啡肽为拮抗剂， 具体实 施方式二至四水解产生外啡肽为激动剂。 说 明 书 CN 101691596 B1/3 页 6 图 1 图 2 说 明 书 附 图 CN 101691596 B2/3 页 7 图 3 图 4 说 明 书 附 图 CN 101691596 B3/3 页 8 图 5 说 明 书 附 图 。