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1、(10)授权公告号 CN 101701256 B (45)授权公告日 2011.12.21 CN 101701256 B *CN101701256B* (21)申请号 200910238018.4 (22)申请日 2009.11.13 C12Q 1/68(2006.01) C12N 15/11(2006.01) (73)专利权人 中国检验检疫科学研究院 地址 100025 北京市朝阳区高碑店北路甲 3 号 (72)发明人 徐涛 许瑾 (74)专利代理机构 北京路浩知识产权代理有限 公司 11002 代理人 王朋飞 CN 1664110 A,2005.09.07, 全文 . (54) 发明名称 。
2、玉米的 PCR 鉴定引物及鉴定方法 (57) 摘要 本发明提供了一种玉米 PCR 鉴定用引物及 方法， 所述引物的核苷酸序列如序列表 SEQ ID No.1&2 所示。本发明还进一步提供了玉米鉴定的 PCR 检测方法， 该方法以样品总 DNA 为模板， 利用 上述引物进行 PCR 扩增， 反应结束后根据琼脂糖 电泳判定结果。 本发明引物特异性好， 检测方法快 速简单， 准确性高， 灵敏度好， 为玉米物种资源的 鉴定提供了检测方法。 (51)Int.Cl. (56)对比文件 审查员 张艳霞 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利 权利要求书 1 页 说明书 3 页 附图 1 页 。
3、CN 101701256 B1/1 页 2 1. 一种玉米鉴定用 PCR 引物， 其核苷酸序列为 ： 正向 ： 5 -GATCTCGAAAACAATGAA-3 反向 ： 5 -AAAGGAAAAGGATAGGTG-3 。 2.一种检测玉米的方法， 该方法以样品总DNA为模板， 利用权利要求1所述的引物进行 PCR 扩增， 根据 PCR 扩增产物判定样品是否为玉米。 3. 如权利要求 2 所述的方法， 其特征在于， 利用琼脂糖凝胶电泳检测 PCR 产物， 产生 230bp 的特异性扩增条带则判定阳性结果， 反应结束后根据琼脂糖凝胶电泳判定结果。 4. 如权利要求 2 或 3 所述的方法， 其特征。
4、在于， PCR 的反应程序为 ： 预变性 95 5min， 再经 95变性 30sec， 45退火 30sec， 72延伸 1min， 30 循环， 最后 72延伸 5min。 5. 含有权利要求 1 所述引物的试剂盒。 权 利 要 求 书 CN 101701256 B1/3 页 3 玉米的 PCR 鉴定引物及鉴定方法 技术领域 0001 本发明涉及生物检测技术， 具体地说涉及对玉米生物资源进行检测用引物及 PCR 方法。 背景技术 0002 玉米 Zea mays 属禾本科玉米属。全世界玉米播种面积仅次于小麦、 水稻而居第三 位。我国的玉米产量居世界第二位。在我国玉米的播种面积很大， 分布也。
5、很广， 是我国北方 和西南山区及其它旱谷地区人民的主要粮食之一。玉米具有很高营养价值和保健作用， 其 除了含有碳水化合物、 蛋白质、 脂肪、 胡萝卜素外， 还含有核黄素、 维生素等营养物质。这些 物质对预防心脏病、 癌症等疾病有很大的好处。 玉米中所含的胡萝卜素， 被人体吸收后能转 化为维生素 A， 它具有防癌作用 ； 植物纤维素能加速致癌物质和其他毒物的排出 ； 天然维生 素 E 则有促进细胞分裂、 延缓衰老、 降低血清胆固醇、 防止皮肤病变的功能， 还能减轻动脉 硬化和脑功能衰退。此外， 多吃玉米还能抑制抗癌药物对人体的副作用， 刺激大脑细胞， 增 强人的脑力和记忆力此外。我国是一个玉米属。
6、植物种质资源十分丰富的国家， 有许多优良 品种， 这些品种已成为我国许多地区生产上大量栽培的品种， 大大地促进了我国玉米相关 产业的发展。随着改革开放以来畜牧业的大发展， 人民生活水平的提高， 玉米工业的发展， 玉米已成为粮食、 饲料、 工业原料和出口商品的多用途作物。 为防止我国玉米种质资源的流 失， 对我国的社会生产力造成难以估量的损失， 应该加大对我国玉米资源的保护与研究工 作。 0003 现代生物技术的出现， 使基因资源更多的是以非活体的遗传物质形式携带出境， 使得口岸查验更加困难， 因而研究及建立有效的遗传资源出境检验鉴定方法以及相关的能 力建设就显得极为必要。 0004 目前国内外。
7、对于Zea mays的识别仅限于形态上， 利用分子标记技术进行品种鉴定 的研究很多， 但是在种的水平上未见分子检测方法的研究。 0005 本发明应用PCR方法对玉米的分子检测方法进行研究， 通过trnL序列设计特异引 物， 建立了对玉米稳定、 高效的鉴定方法、 成本低， 可根据对扩增产物的普通琼脂糖电泳判 定是否有玉米核酸存在。 发明内容 0006 本发明目的在于提供用于玉米 PCR 检测的引物及方法。 0007 本发明通过分析玉米与其近缘种等禾本科植物叶绿体 trnL 基因序列的基础上， 设计特异引物， 能够快速、 准确地对 Zea mays 进行定性检测。 0008 本发明提供的检测引物的。
8、核苷酸序列如 SEQ ID NO.1 和 2 所示。 0009 以样品总 DNA 为模板， 上述的引物进行 PCR 扩增， 根据 PCR 扩增产物判定样品是否 为玉米。即检测 PCR 产物中是否存在 230bp 的特异性扩增。具体地说， 可以利用琼脂糖凝 胶电泳进行检测， 根据是否存在 230bp 的特异性条带， 来判断样品是否为阳性。 说 明 书 CN 101701256 B2/3 页 4 0010 PCR25L 反应体系 ： 样品 DNA 1L(10-50ng)， 10PCR buffer(Mg2+ free)2.5L， 25mM MgCL2 2L， 10mM dNTPs 2L， 10MP。
9、rimers 1L/1L， 5U/L Taq DNA polymerase 0.1L， ddH2O 15.4L。 0011 反应条件 ： 预变性 95 5min， 再经 95变性 30sec， 45退火 30sec， 72延伸 1min， 30 循环， 最后 72延伸 5min。 0012 可以将本发明引物以及相关试剂组装成试剂盒， 以方便使用。 0013 本发明建立了适合口岸应用的简便的检测方法， 即直接从进、 出境的禾本科类材 料上检测玉米， 操作快捷、 结果准确， 避免了用传统的形态分类学和细胞学方法所产生的耗 费时间和易疏漏的缺陷， 顺应了当今口岸检测工作的特点。 附图说明 0014 。
10、图 1 是 PCR 法对玉米的特异性检测结果 ； 0015 其中， M 为 DL2,000 DNA 分子量标准 ； 1 玉米， 2 小伞， 3 粗山羊草， 4 黑麦， 5 栽培一 粒， 6 肯农 18， 7 日本晴， 8 中国春， CK 水对照。 具体实施方式 0016 下面实施例用于对本发明的进一步说明， 但不用来限制本发明的范围。 0017 实施例 1 引物的设计 0018 根据玉米 trnL 序列， 利用软件和 Primer 3 设计引物及， 经过多轮筛选， 意外发现 以下引物的特异性显著优于其它引物， 该引物序列为 ： 0019 正向 ： 5 -GATCTCGAAAACAATGAA-3。
11、 0020 反向 ： 5 -AAAGGAAAAGGATAGGTG-3 。 0021 实施例 2 总 DNA 的提取 0022 (1) 取 0.2 0.3g 植物组织， 用硅胶保存， 剪碎后置研钵中加液氮研成粉末状， 移 至已灭菌的 1.5mL 离心管， 一般加到离心管的 1/3 体积。 0023 (2) 在离心管中加入已在 65预热 500L CTAB 提取液 (20g/LCTAB， 1.4M NaCl， 0.1M Tris-HCl， 20mM EDTA， pH 8.0) 混匀， 置于 65水浴锅保温 30 分钟。 0024 (3) 将样品从水浴锅中取出， 加入与提取液等体积的氯仿 / 异戊醇。
12、 (24 1)， 上下 颠倒离心管充分混匀， 12000 转 / 分钟离心 15 分钟。 0025 (4) 吸取上清液置于另一已灭菌的 1.5mL 离心管。 0026 (5) 再加入等体积的氯仿 / 异戊醇 (24 1)， 重复步骤 (3)， (4)。 0027 (6)加入等体积或两倍体积的无水乙醇(已在-20预冷)， 轻轻颠倒离心管混匀， 置于 -20冰箱， 放置 30 分钟。 0028 (7)10000 转 / 分钟离心 10 分钟， 倒去上清液， 保留沉淀 . 此时的沉淀物主要为 DNA。 0029 (8) 加入 400L70乙醇， 10000 转 / 分钟离心 5 分钟， 收集沉淀。置。
13、于 37或 50烘箱烘干。(9) 加入 100L TE( 或者灭菌水 ) 溶解 DNA， 再加 2L RNA 酶 (10mg/ml)， 37保温 30 分钟。 0030 (10)1.0琼脂糖电泳检测 DNA 浓度及质量。 说 明 书 CN 101701256 B3/3 页 5 0031 实施例 3PCR 扩增方法的建立 0032 1、 PCR 反应体系 0033 以 总 DNA 为 模 板，进 行 PCR 反 应， 25L 反 应 体 系 中 有 样 品 ： 样 品 DNA 1L(10-50ng)， 10PCR buffer(Mg2+ free)2.5L， 25mMMgCL2 2L， 10mM。
14、 dNTPs 2L， 10M Primers 1L/1L， 5U/L TaqDNA polymerase 0.1L， ddH2O 15.4L。 0034 2、 PCR 反应条件 0035 将样品管放入 ABI 7900 PCR 仪后， 设置如下条件进行反应 ： 预变性 95 5min， 再 经 95变性 30sec， 45退火 30sec， 72延伸 1min， 30 循环， 最后 72延伸 5min。反应结 束后扩增产物经过琼脂糖凝胶电泳判定结果。 0036 实施例 4 玉米 PCR 方法的特异性确定 0037 以玉米与其近缘种等 8 个植物总 DNA 为模板， 以水为阴性对照， 通过 PC。
15、R 反应结束 后琼脂糖凝胶电泳 230bp 的特异性扩增条带判定阳性结果。 0038 试验结果 ： 0039 只有玉米的 PCR 扩增产物出现阳性扩增， 而其它近缘材料和阴性对照均没有扩增 信号， 结果见图 1。 0040 序列表 0041 中国检验检疫科学研究院 0042 玉米的 PCR 鉴定引物及鉴定方法 0043 KHP09113381.6 0044 2 0045 PatentIn version 3.5 0046 1 0047 18 0048 DNA 0049 人工序列 0050 1 0051 GATCTCGAAA ACAATGAA 18 0052 2 0053 18 0054 DNA 0055 人工序列 0056 2 0057 AAAGGAAAAG GATAGGTG 18 说 明 书 CN 101701256 B1/1 页 6 图 1 说 明 书 附 图 。