肝脏组织来源 本申请是原申请号 01806108.7、 申请日为 2001 年 1 月 19 日、 发明名称为 “肝组织 来源” 的分案申请。发明领域
本发明通常涉及从心脏停止跳动的供体尸体的组织获得包括祖细胞或干细胞的 二倍体细胞。
发明背景
从肝脏分离和鉴定未成熟的祖细胞具有极大的临床和商业利益， 因为该细胞群体 在治疗肝脏疾病中具有效果。在美国每年有大约 300,000 例因为肝脏衰竭住院。肝移值对 某些形式的肝衰竭具有疗效， 且在美国每年进行大约 4800 例移植。肝脏移植中的一个限制 性因素是供体肝脏的可得性， 特别是受到器官移植的供体肝脏必须来自经历脑死亡但心跳 未停止的病人的限制。 尽管最近如果在死亡半小时内获得该肝脏时使用该供体的努力支持 了使用它们的可能性， 但是来自尸体 ( 心搏停止 ) 的供体肝脏尚未成功。 将细胞移植进肝脏对于大多数肝脏疾病而言是一种有吸引力的治疗选择。 细胞移 植的手术操作相对于完整器官移植所需的那些操作较小， 因此， 可用于有各种手术危险的 病人， 例如， 老年人或衰弱病人。使用人肝细胞优于来自其它哺乳动物的肝细胞， 因为潜在 的病原体 ( 如果有的话 ) 是人类来源的， 病人能更好地耐受且容易在用前筛选。
过去为获得认为是最多用的群体的肝脏祖细胞群体用于肝脏的细胞和基因治疗 已作出了尝试。 Reid 等的美国专利号 5,576,207 和 5,789,246 使用细胞表面标记和侧面散 射流式细胞术提供了肝脏中的限定亚群体。肝脏祖细胞是二倍体细胞， 它们或其后代能分 化成肝细胞。
肝脏祖细胞对于生长因子的生产也非常有用。 这与其自身生长或肝脏中其它祖细 胞 ( 例如， 造血或间充质祖细胞 ) 的生长相联系且也可包括与将肝脏祖细胞供给特定谱系 的早期步骤相关的尚未发现的生长因子。 这些新生长因子在治疗肝脏疾病或控制肝脏癌症 ( 现在认为是肝脏祖细胞的转化突变体 ) 中具有潜力。
另外， 肝脏祖细胞是基因治疗的载体， 其中遗传插入转化的或正常的肝脏祖细胞 可促进移植该肝脏祖细胞的个体的健康。
进行肝细胞移植的尝试利用了未分离的成熟肝细胞并显示了一定程度的功效。 然 而， 该成就需要注射大量细胞 (100-200 亿个 )， 因为该细胞在体内的生长潜力有限。另外， 导入大量的大型成熟肝细胞 ( 平均细胞直径 25-50μm) 伴随着注射时形成大量聚集的倾 向， 导致潜在的致命栓塞。而且， 这些细胞诱发显著的免疫学排斥反应， 迫使病人靠免疫抑 制药物来维持余生。
成熟的， 分化的肝细胞通过一些标准可与肝脏祖细胞区分开来。分化的细胞倾向 于形成团块或聚集， 如果注射进病人， 导致出现栓塞形成的危险。 分化的细胞特别耐冷藏且 具有显著的免疫原性。 而且， 由于分化细胞的增殖能力有限， 用分化细胞移植与器官移植相 比具有较小的优势 ( 如果有的话 )， 且具有包括制备程序更精细的缺点。
需要供体组织的用于移植或其它医学目的的重要器官， 例如， 心脏， 肝脏， 胰腺， 肺 和肾的矩缺是由于仍然具有功能的器官的可获得性有限。当前， 用于移植的器官从心脏仍 在跳动的脑死亡的供体取得。如果心跳停止， 血液循环就停止 ( 局部缺血 )， 它中断了组织 的氧合作用 ( 缺氧 )， 因此， 器官在极短的时间期间内受到局部缺血损伤导致出现这样一 种几乎确定的可能性， 即移植时该器官不发挥功能。一般来说， 不使用心跳停止后的器官， 在实验上， 没有使用心跳停止或心搏停止时间超过 1 个半小时后的器官。通常， 医院只有 1-2％的死亡满足脑死亡有心跳的标准。然而， 可获得大量且尚未利用的器官来源用于移 植， 其中许多来自事故的遇难者， 他们或者在受伤时死亡， 或者具有较短的伤后存活时间。 这些事故遇难者由于局部缺血损伤而未被用作器官供体。诸如肝脏， 脑和心脏的器官属于 局部缺血最敏感的组织。例如， 由于心跳停止的缺氧和局部缺血脑损伤在大约 4 分钟后导 致脑和有关神经组织的损伤。心跳停止后心脏可完整存活达 4 小时。肝脏可有功能地存 活不超过 1 小时， 且来自无心跳的供体 (NHBDs) 的移植建议优选在出现暖局部缺血的前 35 分钟内进行 [ 参见 Ong HS， Soo KC， Joseph VT， Tan SY， Jeyaraj PR 的文章 ( 作为参考文 献引用 ) 的摘要。Ann Acad Med Singapore 1999 年 1 月 ； 28(1) ： 25-30， 暖局部缺血延迟 后用于移植的肝脏移植物的活力 ； Hong HQ， Yin HR， Zhu SL， Lin YT， 来自选择的无心跳尸 体供体的移植肝脏的结果， Hiroshima J Med Sci， 1991 年 9 月 ； 40(3) ： 87-91]。在目前的 医学法规下， 在可抢救潜在可移植器官的时间之前的时间通常被耽搁。这是因为潜在的供 体必须首先被带到医院或停尸室。然后家属必须填写器官捐赠表格。只有在器官捐赠程序 完成后， 才许可手术小组接近尸体以获取器官。 在许多场合下由于这些程序导致时间流逝， 器官已经不可逆地受到损伤或者不再有活力。因此， 现有技术提供了大量方法和程序用于 防止供体器官局部缺血损伤。参见， 例如美国专利号 5,702,881 ； 5,660,976 ； 5,752,929 ； 5,863,296 ； 5,855,617 ； 5,843,024 ； 5,827,222 ； 5,723,282 ； 5,514,536 ； 和 4,723,939 等并 以参考文献的形式在本文中引用。 尽管大量的现有技术文献针对防止供体器官丧失功能的 方法， 但对于使用心跳停止超过不可逆时间点的尸体的情况现有技术没有记载。只有 3 篇 美国专利 (5,843,024 ； 5,702,881 ； 4,723,939) 似乎涉及无心跳的供体。 但该现有技术没有 教导使用 “不可修复的” 器官用于从其中分离祖细胞。尽管分离肝脏前体细胞的方法在本 领域是已知的 ( 参见， 例如美国专利号 5,576,207 和 5,789,246， 本文作为参考文献引用 )， 但直到本发明付诸实践时还不知道可从现有技术认为 “无用” 的器官分离前体肝脏细胞。
由本文所述的本发明的发明人开创的， 从对人肝脏祖细胞及其分离和扩增的认识 进展建立的技术通过提供对细胞移植进肝脏非常有用的新细胞群体产生对与肝脏疾病相 关的发病率和死亡率的重要影响。
因此， 对于使用来自血液循环停止或无心跳的尸体的器官作为医学目的的器官或 器官等同物来源的有效方法存在长期需要。
发明概述
本发明涉及提供具有至少一种二倍体细胞群体的组织作为二倍体细胞来源的方 法。该方法包括 (a) 从获取组织时无心跳的供体获取组织， 所获取的组织被认为具有至 少一种二倍体细胞群体 ； (b) 处理获取的组织以获得基本上富含二倍体细胞的一种细胞群 体。优选的是， 供体不是胎儿且选自新生儿， 婴儿， 儿童， 少年人或成年人。从该方法获得的 二倍体细胞包括祖细胞。在本发明的一个具体实施方案中， 处理步骤包括处理获取的组织以提供基本上的 单细胞悬液。经过将基本上的单细胞悬液分成两个或多个部分， 一般三个或多个， 优选 4 个 或多个来进一步处理该单细胞悬液。 在该分离步骤中， 将大细胞与小细胞分离， 高密度细胞 与低密度细胞分离， 或两种情况都分离。可使用本领域的普通技术人员已知的将细胞分成 小部分的任何方法。一个方便的方法是离心， 首先以较低速度， 然后逐渐加快速率。进一步 处理基本上由小细胞， 低密度细胞， 或两者组成的部分以提供基本上富含二倍体细胞的细 胞群体。 具体地说， 所需的二倍体细胞的例子包括表达甲胎蛋白的祖细胞， 特别是肝脏祖细 胞。
本发明的优选组织是在供体心跳停止后大约 6 小时内， 优选心跳停止后大约 3 小 时内， 更优选心跳停止后大约 2 小时内， 最优选心跳停止后大约 1 小时内获取的那些组织。 然而， 供体心跳停止后获取该组织的时间越早越好。因此， 在供体心跳停止后大约 45， 30 或 15 分钟内获取的组织仍然是较优选的。可获取各种组织并进行处理以获得二倍体细胞， 包 括肾上腺， 血管， 骨髓， 角膜， 视网膜， 胰岛， 胆管， 晶状体， 肺， 肾， 心脏， 肠， 卵巢， 胰腺， 前列 腺， 甲状旁腺， 松果体， 脑垂体， 皮肤， 睾丸， 膀胱， 脑， 脊髓， 脾脏， 胸腺， 甲状腺或者肝脏。
本发明还涉及一种组合物， 它含有一种基本上富含二倍体细胞的细胞群体， 特别 是用本发明的方法获得的， 表达甲胎蛋白的那些细胞。 本发明在获得供体器官和组织的领域中取得了重要突破并提供了获得祖细胞和 二倍体成年细胞的组织来源的方法。本发明是完全意想不到的， 因为所有已知的现有技术 文献都认为局部缺血损伤的器官对于任何有意义的目的都是完全无用的。 优选的方法包括 从供体获取组织， 其中该供体无心跳， 并处理该组织以提供包括祖细胞或干细胞的二倍体 细胞。
优选的是， 本发明包含提供包括祖细胞的肝脏二倍体细胞的组织来源的方法， 它 包括从供体获取肝脏组织， 其中该供体无心跳， 并处理该组织以提供二倍体细胞和 / 或肝 脏祖细胞。例如， 该细胞可用于在需要的宿主中恢复损伤的肝脏实质群体或重建肝脏。尽 管任何动物供体是同样合适的， 但优选的供体是人类。诸如猪和灵长类的动物是同样合适 的。
因此， 本发明的目的是在心跳停止后大约 24 小时或更长的时间内获得该器官或 组织。即使该时间限制不受约束， 也优选在心跳停止后大约 16 小时内获得该组织。更优选 的是在心跳停止后大约 10 小时内获得该组织。 另外更优选在心跳停止后大约 6 小时内获得 该组织。甚至更优选在心跳停止后大约 3 小时内获得该组织。另一优选的时间期限是在心 跳停止后大约 1 小时内获得该组织。尽管在该时间期限二倍体细胞和祖细胞耐局部缺血。 获取的组织或者用合适的灌流培养基灌流或者不作灌流而用于进一步处理。
尽管优选将组织冷却到大约室温， 但将组织冷却到大约 4℃同样是具有优势的。 组 织可在全部或部分局部缺血时间内冷却。即， 对器官可进行暖和冷局部缺血的组合。
在本发明范围内， 优选供体是新生儿， 婴儿， 儿童， 少年或成年人， 在本发明范围内 也包括由于推测的局部缺血而认为不合适的胎儿组织。尽管供体的年龄不是关键的， 但需 要供体在大约 0 岁至大约 77 岁之间， 更优选不超过大约 50 岁。
用于本发明的优选组织包括肾上腺， 血管， 骨髓， 角膜， 胰岛， 晶状体， 肝脏， 卵巢， 胰腺， 甲状旁腺， 松果体， 脑垂体， 皮肤， 睾丸， 胸腺， 甲状腺或者其组含。 优选的组织是肝脏。
本发明的另一实施方案是提供了导致从该组织产生基本上的单细胞悬液的处理 方法。优选的处理方法还包括压实 (debulking) 的步骤， 它大量减少了悬液中多倍体细胞 或成熟细胞的数目以提供富含表现出与至少一种细胞谱系相关的至少一种标记的二倍体 细胞和 / 或祖细胞的压实的悬液。不作为对该方法的限制， 处理步骤包括以大小或密度分 离细胞。
优选的处理还包括从悬液选择那些表达与至少一种细胞谱系相关的至少一种标 记的细胞， 其中至少一种细胞谱系包括至少一种肝脏， 造血， 或间充质细胞谱系。本发明还 有一个目的是提供具有发育成肝细胞， 胆细胞， 或其组合之能力的二倍体细胞和 / 或祖细 胞。
优选的是本发明的供体细胞单独或者以有益组合表达包括甲胎蛋白， 白蛋白， 骨 唾液蛋白， CD14， CD34， CD38， CD90， CD45， CD 117， ICAM-1， I 型胶原蛋白， II 型胶原蛋白， III 型胶原蛋白， 血型糖蛋白 A， 或骨桥蛋白的至少一种标记。
作为本发明的另一目的， 提供了一种治疗方法， 其中祖细胞用作细胞移植物， 生物 反应器， 人造器官等。优选的医学症状和需要包括克 - 纳二氏综合征， 酪氨酸血症， 肝硬化， 急性肝衰竭， 糖尿病， 和本领域已知的其它肝脏和肝脏相关性症状。一般来说， 治疗的患者 可患有至少一种肝脏疾病， 该疾病选自肝脏炎症， 病毒性肝炎， 中毒性肝细胞损伤， 肝脏纤 维变性， 肝硬化， 肝充血， 肝营养障碍， 肝细胞脂肪变性， 脂肪肝， 解毒功能障碍， 肝分泌功能 障碍， 肝接合功能障碍， 由肝疾病引起的肝门高血压合成功能障碍， 或肝衰竭昏迷， 蛋白降 解产物或氨中毒。这些机能障碍导致诸如阿拉惹综合征， 酒精肝疾病， α-1- 抗胰蛋白酶缺 陷， 自身免疫肝炎， 胆闭锁， 胆管缺乏， 骨髓衰竭， 巴德 - 希阿里综合征， Byler 疾病， 克 - 纳二 氏综合征， Caroli 疾病， 胆汁郁积瘙痒症， 胆石病， 接合高胆红素血症， 慢性移植物与宿主疾 病， 原因不明性肝疾病， 糖尿病， 杜 - 约综合征， 红细胞肝性原卟啉症， 肝外胆管癌， 家族性 高胆固醇血症， 半乳糖血症， 吉尔伯综合征， 糖原存储疾病， 血管瘤， 血色病， 肝脑病， 肝胆管 炎， 肝软化， 肝大， 肝癌， 肝胚细胞瘤， 遗传性血色病， 黄胆， 肝内胆汁郁积， 肝囊肿， 肝移植， 与 Bacillus cereus 相关的肝衰竭， 混合型冷球蛋白血症， 鸟氨酸转氨甲酰基酶缺陷， 紫癜 肝病， 迟发性皮肤血卟啉病， 原发性胆肝硬化， 顽固性腹水， 罗托综合征， 肉样瘤病， 硬化性 胆管炎， 皮脂腺病， Summerskill 综合征， 血小板减少症， 酪氨酸血症， 静脉曲张性出血， 肝脏 静脉闭合疾病， 和肝豆状核变性等的疾病， 且用本发明的方法和组合物治疗是有益的。
不局限于上述实施方案， 还包括基因治疗的方法， 它包括本领域熟知的方法， 包括 但不限于将载体导入二倍体细胞和 / 或祖细胞， 然后移植进需要的宿主中。症状和靶基因 可包含家族性高胆固醇血症中的 LDL 受体基因， 血友病中的因子 VIII 和 IX 的凝血因子基 因， 肺气肿中的 α-1- 抗胰蛋白酶基因， 苯丙酮酸尿中的苯丙氨酸羟化酶基因， 血氨过多中 的鸟氨酸转氨甲酰酶基因， 和在各种补体缺陷形式中的补体蛋白基因， 可借助于基因治疗 进行有益治疗或治愈的其它医学症状。
其它所需的实施方案包括编码甲氨酰合成酶 1， 鸟氨酸转氨甲酰酶， 精氨琥珀酸合 成酶， 精氨琥珀酸裂解酶， 精氨酸酶， 延胡索酰乙酰乙酸水解酶， 苯丙氨酸羟化酶， α-1- 抗 胰蛋白酶， 葡萄糖 -6- 磷酸酶， 低密度脂蛋白受体， 胆色素原脱氨酶， 甲氨酰合成酶 I， 鸟氨 酸转氨甲酰酶， 精氨琥珀酸合成酶， 精氨琥珀酸裂解酶， 精氨酸酶， 因子 VIII 或 IX， 胱硫醚 β- 合成酶， 支链酮酸脱羧酶， 白蛋白， 异戊酰 -CoA 脱氢酶， 丙酰 CoA 羧化酶， 甲基丙二酰CoA 变位酶， 戊二酰 CoA 脱氢酶， 胰岛素， 转铁蛋白， β- 葡萄糖苷酶， 丙酮酸羧化酶， 肝脏磷 酸化酶， 磷酸化酶激酶， 甘氨酸脱羧酶， H- 蛋白， T- 蛋白， Menkes 疾病蛋白， 或肝豆状核变性 基因产物的基因。
本发明还涉及从人肝脏分离和冷藏二倍体细胞和 / 或祖细胞的方法， 包括 (a) 处 理人肝脏组织以提供一种基本上的单细胞悬液， 该悬液包括二倍体成年细胞， 祖细胞和在 人肝脏中发现的一种或多种细胞谱系的非祖细胞 ； (b) 对该悬液进行压实的步骤， 它大量 减少了悬液中非祖细胞的数目， 以提供富含表现出与至少一种细胞谱系相关的一种或多种 标记的祖细胞的压实的悬液 ； 和 (c) 从压实的悬液选择那些其自身， 其后代或其更成熟的 形式表达与一些肝脏细胞谱系相关的一种或多种标记的细胞 ； 及 (d) 在对于冷藏最佳的条 件下悬浮该细胞。更优选的是选择表达诸如甲胎蛋白的胞质蛋白的肝脏祖细胞。本发明的 处理或压实的步骤优选包括根据与具有低浮力密度的一个或多个梯度部分相联系的其浮 力密度和大小对肝细胞悬液进行密度梯度离心以分离该细胞。
肝细胞悬液的非祖细胞包括成熟的肝脏， 造血， 和间充质细胞。 非祖细胞的负选择 包括使用诸如连接蛋白 32 的与成熟肝细胞相关的标记， 诸如血型糖蛋白 A 和 CD45 的与造 血细胞相关的标记， 诸如视网膜样蛋白 (retinoids) 或冯·维勒布兰德氏因子的与成熟间 充质细胞相关的标记。 本发明的另一方面提供了肝脏， 造血， 或间充质来源的肝脏祖细胞。通过选自 CD14， CD34， CD38， CD45， CD 117， ICAM， 血型糖蛋白 A 的抗原标记， 和 / 或诸如甲胎蛋白样免 疫反应性， 白蛋白样免疫反应性的胞质标记， 或者两者来选择这些细胞谱系， 其后代或其更 成熟的形式。甲胎蛋白来自 mRNA 的变异体形式。其中的一些是肝脏祖细胞特有的且一些 是造血祖细胞特有的。 本发明的肝脏相细胞可从胎儿， 新生儿， 婴儿， 儿童， 少年或成年人肝 脏中分离。
根据本发明的另一方面， 分离的人肝脏祖细胞， 即一种二倍体细胞的亚群以高度 富集到基本上纯的形式分离。该肝脏祖细胞含有肝脏， 造血和间充质祖细胞。肝脏祖细胞 具有发育成肝细胞， 胆细胞或其组合的能力 ； 造血祖细胞具有发育成巨噬细胞， 噬中性白细 胞， 粒细胞， 淋巴细胞， 血小板， 嗜中性白细胞， 嗜曙红细胞， 嗜碱细胞或其组合的能力。 间充 质祖细胞具有发育成内皮细胞， 基质细胞， 肝脏星形细胞 (Ito cells)， 软骨细胞， 骨细胞或 其组合的能力。本发明的方法可用于选择表达 CD34， 骨桥蛋白， 骨唾液蛋白， I， II， 或 III 型胶原蛋白或其组合的间充质祖细胞。
本发明人克服了许多上述困难来制备包括祖细胞的二倍体细胞， 理想地用于细胞 和基因治疗及用于人造生物器官。由于细胞较小， 因此使大型栓塞的形成最小化。另外， 该 细胞具有广泛的生长潜力， 意味着在患者中重建肝脏组织需要较少的细胞。最后， 祖细胞 具有最少的可诱发免疫学排斥的抗原标记， 这给需要较小或没有免疫抑制的药物提供了希 望。
本发明的另一方面提供了含有外源性核酸的肝脏祖细胞。 该外源性核酸可编码一 个或多个目的多肽， 或者可启动一个或多个目的多肽的表达。
根据本发明的另一方面， 提供了经过给遭受负效应的个体施用有效量的分离的人 二倍体肝细胞和 / 或祖细胞减轻一种或多种人类疾病或机能障碍的负效应的方法。祖细胞 可通过血管进行肠胃外给药， 或者直接施用进肝脏。直接施用可通过门静脉， 肠系膜静脉，
肝胆管， 或其组合经手术实现。另外， 肝脏祖细胞可施用进个体的异位位置， 例如脾脏。
可用本发明的方法减轻的人类病症或机能障碍包括 ： 肝胆管炎， 肝软化， 肝大， 肝 硬化， 纤维变性， 肝炎， 急性肝衰竭， 慢性肝衰竭， 或代谢先天错误， 肝癌， 或肝胚细胞瘤。肝 癌可以是癌的原发性部位或者是转移进肝脏的癌。转移瘤可来自任意数量的原发性位点， 包括肠， 前列腺， 胸部， 肾， 胰腺， 皮肤， 脑， 肺或其组合。可用该方法治疗的肝脏疾病或机能 障碍还包括与肝组织线粒体区室的损伤相关的肝脏疾病或机能障碍且可由慢性肝脏疾病， 爆发性肝衰竭， 病毒诱导的肝脏疾病， 代谢型肝脏疾病和与脓毒症或肝脏创伤相关的肝脏 机能障碍组成。
根据本发明的另一方面， 提供了一种生物反应器， 它包括 (i) 含有 (a) 从人肝脏， 其后代， 其成熟中的或分化的后代， 或其组合分离的祖细胞， (b) 细胞外基质， 和 (c) 培养 基的生物材料 ； (ii) 容纳所述生物材料的一个或多个区室或含有所述生物材料的组件 ； 和 (iii) 一个或多个连接口。 该生物反应器的生物材料可任选还包括 ： (d) 激素， 生长因子， 或 营养补充物， 或 (e) 血浆， 血清， 淋巴， 或由其产生的产品。
生物反应器适用于将所述祖细胞维持在一种有活力的， 有功能的状态， 且可维持 肝脏祖细胞大约一周或更长的时期。 具体地说， 该生物反应器适用于用作人造肝脏， 用于产 品生产， 毒理学研究， 或代谢研究， 包括涉及细胞色素 P450 的活性， 或其它类型的药物代谢 的研究。
根据本发明的另一方面， 提供了分离的人肝脏祖细胞的组合物， 或从人类肝脏获 得的富含祖细胞的悬液。 该细胞悬液在药用上可接受的载体或稀释剂中提供且施用给需要 治疗的受试者。 本发明的组合物包含表现出与在人类肝脏中发现的一种或多种细胞谱系中 的至少一种相联系的一种或多种标记的肝脏祖细胞且基本上不含成熟细胞。更具体的说， 分离的肝脏祖细胞来自一种或多种肝细胞谱系， 包括肝脏， 造血， 或间充质细胞谱系且它们 自身， 其后代， 或该祖细胞的更成熟形式表达抗原标记 CD14， CD34， CD38， CD90， 或 CD117， CD45， 血型糖蛋白 A， 和甲胎蛋白样免疫反应性， 白蛋白样免疫反应性的胞质标记， 或者两者 中的至少一种或多种。
根据本发明的另一实施方案， 提供了一种肝脏祖细胞的细胞培养物， 它包括来自 人肝脏的分离的祖细胞， 其后代， 其成熟中的或分化的后代， 或其组合。该细胞培养物还包 括细胞外基质， 该基质包括一种或多种胶原蛋白， 一种或多种粘连蛋白 ( 层粘连蛋白， 纤连 蛋白 )， 和其它组分， 例如蛋白聚糖 ( 例如硫酸乙酰肝素蛋白聚糖 ) ； 或独特的基质成分。所 述基质成分包括基质成分的片断 ； 基质模拟物， 该模拟物可以是用来自一类细胞外基质的 一种或多种因子包裹的合成的和 / 或可生物降解的材料 ( 即微球体 )。细胞培养物还包括 基础培养基和其它营养成分 ； 激素和 / 或生长因子， 含有或不含诸如血清， 血浆或淋巴的生 物学液体。 另外， 该培养基可含有一个或多个区室以容纳诸如培养皿， 瓶， 转瓶， 转移孔或其 它这类容器的生物学材料。
本发明的培养物或生物反应器可用于产生各种医学上重要的细胞分泌因子， 包 括但不限于酶， 激素， 细胞因子， 抗原， 抗体， 凝血因子， 反义 PNA， 调控蛋白， 核酶， 融合蛋白 等。该培养物适合于提供治疗性蛋白， 例如因子 VIII， 因子 IX， 因子 VII， 红细胞生成素， α-1- 抗胰蛋白酶， 降钙素， 生长激素， 胰岛素， 低密度脂蛋白， 载脂蛋白 E， IL-2 受体和其拮 抗剂， 过氧化物歧化酶， 免疫反应修饰剂， 甲状旁腺激素， 干扰素 (IFNα， β， 或 γ)， 神经生长因子， 葡糖脑苷脂酶， 集落刺激因子， 白介素 (IL)1 至 15， 粒细胞集落刺激因子 (G-CSF)， 粒细胞， 巨噬细胞集落刺激因子 (GM-CSF)， 巨噬细胞集落刺激因子 (M-CSF)， 成纤维细胞生 长因子 (FGF)， 血小板产生的生长因子 (PDGF)， 腺苷脱氨酶， 胰岛素样生长因子 (IGF-1 和 IGF-2)， 巨核细胞启动配体 MPL， 血小板生成素等。
作为本发明的另一实施方案， 提供了一种用于治疗和预防肝脏疾病的药物组合 物。该组合物包含有效量的尸体肝脏祖细胞和药用载体。目的肝脏疾病包括中毒性， 代谢 性， 遗传性， 和 / 或传染源性或变性性质的急性或慢性肝脏疾病， 或由于使用药物或对肝脏 的物质损伤引起的肝脏损伤。 其中优选的症状和疾病是肝脏炎症， 病毒性肝炎， 中毒性肝细 胞损伤， 肝脏纤维变性， 肝硬化， 肝充血， 肝营养障碍， 肝细胞脂肪变性， 脂肪肝， 解毒功能障 碍， 肝分泌功能障碍， 肝接合功能障碍， 由肝疾病引起的肝门高血压合成功能障碍， 或肝衰 竭昏迷， 和蛋白降解产物或氨中毒。更具体的说， 这些包括但不限于阿拉惹综合征， 酒精肝 疾病， α-1- 抗胰蛋白酶缺陷， 自身免疫肝炎， 胆管缺乏， 骨髓衰竭， 巴德 - 希阿里综合征， 胆 闭锁， Byler 疾病， 克 - 纳二氏综合征， Caroli 疾病， 胆汁郁积瘙痒症， 胆石病， 接合高胆红素 血症， 慢性移植物与宿主疾病， 原因不明性肝疾病， 糖尿病， 杜 - 约综合征， 红细胞肝性原卟 啉症， 肝外胆管癌， 家族性高胆固醇血症， 半乳糖血症， 吉尔伯综合征， 糖原存储疾病， 血管 瘤， 血色病， 肝脑病， 肝胆管炎， 肝软化， 肝大， 肝癌， 肝胚细胞瘤， 遗传性血色病， 黄胆， 肝内 胆汁郁积， 肝囊肿， 肝移植， 与 Bacillus cereus 相关的肝衰竭， 混合型冷球蛋白血症， 鸟氨 酸转氨甲酰基酶缺陷， 紫癜肝病， 迟发性皮肤血卟啉病， 原发性胆肝硬化， 顽固性腹水， 罗托 综合征， 肉样瘤病， 硬化性胆管炎， 皮脂腺病， Summerskill 综合征， 血小板减少症， 酪氨酸血 症， 静脉曲张性出血， 肝脏静脉闭合疾病， 和肝豆状核变性及其组合。
参照下面的详细说明完成其它的主题对本领域的技术人员而言是已知的。
附图的简要描述
图 1a 和 1b 显示了暖局部缺血对具有小核和大核的分离细胞的比率的影响。
图 2a 和 2b 显示了对造血细胞中截短的甲胎蛋白 (AFP) 的 PCR 分析。
图 3 显示了在 -170℃的贮存时间与复苏的胎儿肝细胞活力之间的关系。
图 4a 和 4b 显示了以荧光激活的细胞分选 (FACS) 分析的胎儿肝细胞悬液的典型 单变量直方图。
图 5 显示了在未分离的肝细胞悬液中表达表面标记 CD14， CD34， CD38， CD45 和血 型糖蛋白 A(GA) 的细胞的百分数。
图 6 显示了在原始细胞悬液中表达甲胎蛋白和其它抗原标记的细胞百分数。
图 7a， 7b 和 7c 显示了在排除红血细胞之前和之后的甲胎蛋白表达。
图 8a， 8b， 8c， 8d， 8e 和 8f 显示了胎儿肝细胞悬液中 CD14， CD38 和 AFP 共表达的 FACS 分析。
图 9 显示了 AFP- 阳性细胞的 CD14 和 CD38 富集。
图 10a， 10b， 10c 和 10d 显示了人肝脏祖细胞的荧光显微镜检。
图 11a， 11b， 11c 和 11d 显示了用表达 AFP 选择的代表性细胞。
图 12a， 12b 和 12c 显示了在该视野中有两个 AFP 阳性细胞。
图 13a 和 13b 显示了用钙黄绿素 (A) 标记的细胞以显示所有细胞类型。
本发明的详细描述在下面的描述中， 使用了许多术语广泛描述了本发明。为了提供对说明书和权利 要求书的清楚和一致的理解， 提供了下列定义。
甲胎蛋白样免疫反应性 ： 由甲胎蛋白引起的任何免疫反应。 甲胎蛋白由 mRNA 的变 异体形式产生， 其中一些变异体是肝脏祖细胞所特有的且有些是造血祖细胞所特有的。
定向祖细胞 ： 具有单一命运的未成熟细胞， 例如肝细胞定向祖细胞 ( 产生肝细胞 ) 或胆定向祖细胞 ( 产生胆管 )。定向过程在分子水平上尚不清楚。而且， 认为当细胞命运从 其祖先命运变窄时仅以经验发生该定向过程。
肝细胞 ： 肝脏细胞的亚群体， 包括肝细胞和胆细胞。
肝脏细胞 ： 本文使用的术语 “肝脏细胞” 是指正常肝脏中存在的所有类型的细胞， 不论其起源或命运。
干细胞 ： 本文所用的术语 “干细胞” 是指可产生具有一种以上命运的子代细胞的未 成熟细胞。一些子代细胞与亲代相同且一些 “定型” 为一种特定的命运。全能干细胞具有 自我更新 ( 自我维持 ) 能力， 而定向干细胞的自我更新能力有问题。干细胞在再生性增殖 过程期间更新。
肝祖细胞 ： 这些细胞产生肝细胞和胆细胞。肝祖细胞包括三种亚群体 ： “肝干细 胞” ， “定向肝细胞的祖细胞” ， 和 “定向胆祖细胞” ， 后两种细胞是未成熟细胞， 它们是肝干细 胞的后代且具有单一命运， 即或者肝细胞或者胆细胞， 而不是两者。
肝干细胞 ： 肝祖细胞的一种亚群体。 肝脏祖细胞 ： 一种来自肝脏的细胞群体， 包括肝祖细胞， 造血祖细胞和问充质祖细胞。 卵形细胞 ： 具有卵形核的小细胞 ( ＜ 15 微米 )， 在动物接触致癌损伤时增殖。据 认为这些细胞来源于肝脏祖细胞且部分或完全转化。
“肝脏” 是位于腹部最前部位的大型器官， 安置在腹腔和胸腔之间的肌肉隔膜上。 肝脏是生命所必需的且完成 100 种以上的重要功能， 例如解毒毒物和药物， 代谢脂肪， 存储 糖类， 生产胆汁， 血浆蛋白和其它物质， 并辅助凝血。 肝脏疾病通常难以检测， 直到形成严重 疾病， 因为存在过多的肝脏组织， 且肝脏能部分自我再生。 肝脏疾病的征兆随损害的程度和 位置而变化。各种血液化验对发现肝脏损伤的程度和性质是必须的。
本文使用的术语 “生长因子” 是指调节发育事件所需的或者调节编码可参与细胞 通信和发育协调的其它分泌蛋白的基因表达所需的那些因子， 且包括但不限于肝细胞生长 因子 (HGF)， 胰岛素样生长因子 -I 和 II(IGF-I 和 II)， 表皮生长因子 (EGF)， a 型和 b 型转 化生长因子 (TGF-α 和 TGF-β)， 种经生长因子 (NGF)， 成纤维细胞生长因子 (FGF)， 血小板 衍生生长因子 (PDGF)， 肉瘤生长因子 (SGF)， 粒细胞巨噬细胞集落刺激生长因子 (GM-CSF)， 血管内皮生长因子 (VEGF)， 催乳激素和生长激素释放因子 (GHRF) 和各种造血生长因子， 例 如白介素 (IL)IL-1， IL-2， IL-3， IL-4， IL-5， IL-6， IL-7， IL-8， IL-10， IL-11， 等， 红细胞分 化因子 (EDF) 或促卵泡激素释放蛋白 (FRP)， 抑制素， 干细胞增殖因子 (SCPF) 及这些蛋白质 的活性片断， 亚基， 衍生物和其组合等本领域已知的许多其它因子。一般来说， 下文所用的 生长因子是指选自细胞因子， 淋巴因子， 自介素， 集落刺激因子， 激素， 趋化因子， 抗趋化因 子， 凝血因子， 溶栓蛋白， 补体蛋白， 酶， 免疫球蛋白和抗原的分泌蛋白。
血细胞生成 ： 产生具有淋巴细胞 (B 和 T)， 血小板， 巨噬细胞， 嗜中性白细胞和粒细
胞的细胞命运的血细胞。
间充质形成 ： 产生具有内皮细胞， 脂肪细胞， 基质细胞， 软骨细胞， 甚至骨细胞的细 胞命运的间充质衍生物 ( 仅在疾病装态下在肝脏中出现后两种 )。
细胞治疗 ： 本文所用的术语 “细胞治疗” 是指体内或离开体内转移限定的细胞群体 用作自身或同种异体材料并移植到患者特定靶细胞或其附近。 细胞可在任何合适的的培养 基， 载体或稀释剂， 或者包括微载体， 珠， 微粒体， 微球体， 囊泡等的任何类型的药物传递系 统中移植。
基因治疗 ： 本文所用的术语 “基因治疗” 是指将确定的遗传材料体内或离开体内转 移到需要它的患者的特定靶细胞， 从而改变基因型， 且在大多数情况下， 改变那些靶细胞的 表型达到预防或改变特定疾病状态的最终目的。按照这一定义规定， 隐含的前提是设计这 些治疗性遗传操作最终预防， 治疗或改变明显的或隐蔽的病理学状态。 在大多数情况下， 基 因治疗操作的最终治疗目的是改变特定靶细胞群体的表型。
CD ： “分化簇” 或 “共有决定簇” 在本文中用于指被单克隆抗体识别的细胞表面分 子。一些 CDs 的表达对于特定谱系或成熟途径的细胞是特异性的， 其它 CD 的表达根据激活 的状态， 位置， 或相同细胞的分化而变化。 倍性 ； 细胞内的染色体数。
二倍体 ： 每个细胞两组染色体。
四倍体 ： 每个细胞 4 组染色体。
八倍体 ： 每个细胞 8 组染色体。
多倍体 ： 每个细胞有两组以上的染色体。
正常胎儿或新生儿肝脏的细胞是二倍体。到青年时期， 肝脏是二倍体和多倍体细 胞的混合物。 在啮齿类中， 肝脏大约 90％是多倍体且仅有大约 10％是二倍体细胞。 在人类， 青年人的肝脏由大约 50％的二倍体和 50％的多倍体细胞组成。
不限于肝脏， 本发明公开并要求保护来自各种尸体组织的其它祖细胞。下文所用 的术语 “尸体组织” 不包括来自经过手术方法以诸如成熟前终止妊娠的方式获得的死亡胎 儿的组织。以自然或协助分娩生产的人类认为是新生儿或婴儿而不是胎儿。因此， 人类的 年龄在分娩或生产时开始为 “0” ， 而不是从受孕的开始。 因此在分娩时死亡的新生儿认为是 尸体而不是胎儿。 刚获得的胎儿组织已被用作一些祖细胞的来源且因此它们被排除在本发 明的权利要求的范围之外。然而， 由于推测的局部缺血效应而被认为不适合于进一步的医 疗用途的胎儿组织仍然适合于本发明的目的。
当在本说明书中使用术语 “一” 时， 是指 “至少一个” 或 “一个或多个” ， 除非另有说 明。
图 2a 和 2b 显示了在造血细胞中截短的 AFP 的 PCR 分析。使用引物组合 hAFP1， hAFP2， hAFP3， 和 hAFP4 进行 RT-PCR。泳道 1-3 相应于 Hep3B- 细胞 ； 泳道 10-12 相应于 STO 细胞 ； 泳道 13-15 没有 RNA 或 cDNA。注意， 在泳道 2， 5， 和 8 中有一条共有带， 即截短的 AFP 同种型。在泳道 1 和 4 中明显有一条肝脏细胞特有的截短的 AFP 同种型。在泳道 3 和 6 中 观察到完整的 AFP 种类。
图 3 显示了在 -170℃下贮存时间与复苏的胎儿肝脏细胞活力之间的关系。 数据表 示为在处理时与复苏时测量的活力的改变百分数。 这些数据表示冷藏方法不明显影响细胞
的活力。贮存时间延长到 550 天时活力无明显改变。
图 4a 和 4b 显示了以荧光激活细胞分选法 (FACS) 分析的胎儿肝脏细胞悬液的典 型单变量直方图。制备细胞悬液用于免疫荧光分析， 使用与红色染料， Cy5 偶连的抗体分析 甲胎蛋白 (AFP)， 使用偶连到蓝色染料 (AMCA) 上的抗体分析白蛋白。筛选了 3 万个细胞的 红色 (AFP) 和蓝色 ( 白蛋白 ) 荧光。结果显示了清楚的各蛋白质阳性的细胞组。进一步分 析表明大约 80％的各蛋白质的阳性群体是相同的细胞 ( 即， 共表达两种蛋白质 )。
图 5 显示了在未分离的肝脏细胞悬液中表达表面标记 CD14， CD34， CD38， CD45 和 血型糖蛋白 A(GA) 的细胞的百分数。注意 GA 数据在右轴上绘图以保护刻度。
图 6 显示了在原始细胞悬液中表达甲胎蛋白和其它抗原标记的细胞百分数。平均 值 ±SFM 表示甲胎蛋白 (AFP) 和特异性细胞表面标记 (CD 14， 34， 38， 45 和血型糖蛋白 A) 阳性的细胞百分数。
图 7a， 7b 和 7c 显示了去掉红血细胞之前和之后的甲胎蛋白表达。图 7a 显示了使 用 Percoll 分离法选择性去掉红细胞或者没有去掉红细胞的胎儿肝脏细胞悬液中的甲胎 蛋白的表达且图 7b 显示了白蛋白的表达。图 7c 显示了表达甲胎蛋白和白蛋白两者的细胞 比例， 表示为 AFP 或白蛋白阳性细胞百分数。显示了使用 Percoll 分离法去掉红细胞的细 胞的数据。
图 8a， 8b， 8c， 8d， 8e 和 8f 显示了胎儿肝脏细胞悬液 CD14， CD38 和 AFP 共表达的 FACS 分析。双变量散点图 (8a) 显示了 TriColor 染色的 CD14( 纵坐标 ) 与 FITC 染色的 CD38( 横坐标 ) 的分布。根据 CD14 和 CD38 信号产生通道以选择特异性细胞分组。然后用 于显示各亚组中 AFP 染色的强度 ( 图 8b， 8c， 8d 和 8e)。AFP 结果表明通过选择 CD38 或者 CD14 阳性的细胞产生了 AFP 的高水平富集。全部细胞悬液 (30,000 个细胞 ) 产生的 AFP 信 号在图 8f 中显示。
图 9 显示了 AFP- 阳性细胞的 CD14 和 CD38 富集。通过选择具有阳性表面标记的 细胞的标记 CD38 和 CD14 可显著增大从胎儿肝脏制备的细胞悬液中 AFP- 阳性细胞的比例。 两种标记的组合产生的含有 AFP 的细胞的富集比用单一标记获得的富集明显更好。
图 10a， 10b， 10c 和 10d 显示了人肝祖细胞的荧光显微镜检。
来自胎儿肝脏的代表性肝祖细胞的 AFP 成分被染色。细胞大小表示同时存在早期 的祖细胞和更进化的肝祖细胞。
图 11a， 11b， 11c 和 11d 显示了以表达 AFP 选择的代表性细胞。CD14 染色阳性的细 胞 (11b 和 11d) 是成肝细胞的特征。表面标记染色阴性的细胞 ( 图 11a 和 11c) 较小且大 小和形态与早期肝祖细胞一致。
图 12a 到 12c 是相同的视野且显示了在该视野中有两个 AFP 阳性细胞。图 12a 显 示了一个聚焦相的图像。图 12b 显示了用 AFP 抗体的免疫荧光。图 12c 显示了 (a) 和 (b) 的覆盖图， 显示了在肝脏细胞组中 AFP 阳性细胞的形态学。发现不论从胎儿还是从成年肝 脏中分离的 AFP 阳性细胞都具有相似的细胞大小和形态学。
图 13a 和 13b 显示了用钙黄绿素标记的细胞 (a) 以显示所有细胞类型。图 13(b) 由共表达 AFP 的相同细胞组成并显示了只有两个细胞为 AFP- 阳性。细胞大小不是 AFP 阳 性的要素。
肝脏的再生能力是广泛公认的， 且通常通过正常情况下增殖静息的肝细胞进入细胞周期来实现这点。然而， 当肝细胞再生受损时， 小胆管增生并侵入相邻的肝细胞实质中。 在人类和实验动物中， 这些管细胞称为卵形细胞， 其与缺陷型再生的联系导致相信它们是 转化的干细胞或祖细胞。 这些细胞具有极大的生物学益处， 因为其正常相应细胞， 即肝祖细 胞可用作肝脏移植的替代选择且它们也可用作基因治疗以矫正先天性代谢错误的载体。 尽 管已经明确地证实了祖细胞分化成肝细胞的能力， 但是由于供体肝脏组织的缺乏， 对所述 细胞的要求还不能满足所需的供应。
正如本文所公开的， 从人尸体肝脏分离肝脏祖细胞是新的且是意想不到的， 因为 本领域流行的观点是由于局部缺血肝脏丧失了其实用性。
通过应用本发明人首次用于从尸体获得本发明的独特细胞群体的独特方法， 标记 和参数的组合获得了从本文所述的尸体供体分离人肝祖细胞。
甲胎蛋白和白蛋白这两种胞质蛋白质认为是肝细胞谱系特别可靠的标记。 它们已 成为从肝脏中的其它细胞类型鉴定肝细胞亚群体的策略的基础。 在肝细胞的鉴定中两者都 是关键性向导， 但甲胎蛋白尤其是在经过流式细胞术纯化后的肝祖细胞的鉴定特征。甲胎 蛋白， 即 AFP 也已经被用于在任何类型的分离策略后评估肝祖细胞的纯度。
然而， 在证实这两种标记在鉴定肝细胞谱系中的有效性的严格对照中， 进行了 PCR 分析以检测在肝脏组织中已知的多种细胞类型中的表达。PCR 分析是检测即使微量的特定 mRNA 种类的表达时最敏感的测定法。本文公开的本发明证实了在造血祖细胞中可发现 AFP 和白蛋白两者 mRNA 的具体同种型意味着当使用该敏感测定法时， 必须使用其它标准， 例如 使用 AFP 的外显子 1 探针用于从造血细胞群体限定肝细胞。尽管 PCR 分析揭示了造血祖细 胞可表达 AFP 和白蛋白 mRNA 种类， 但 mRNA 表达水平极低。事实上， 当在蛋白质水平上测量 AFP 和白蛋白时， 在造血祖细胞中不致发现可检测的 AFP 或白蛋白。因此， 对于常规蛋白测 定法 ( 免疫荧光， Western 印迹等 ) 和高水平表达 mRNA 的测定法 (Northern 印迹 )， AFP 和 白蛋白仍然是确定肝细胞谱系的有价值的标记。
本发明还公开了 RT-PCR 特异性引物的设计和制备以测定肝细胞与造血细胞群体 中 AFP mRNA 同种型的表达方式。人 AFP RT-PCR 引物的三种不同组合用于区别肝细胞和造 血细胞谱系中 AFP mRNA 的表达。为了检测造血细胞中 AFP 的表达， 如实施例 1 所举例， 本 发明人筛选了肝细胞与造血细胞来源的一些细胞系中 AFP 的完全与截短形式。在这些试验 中使用 RT-PCR， 它是已知鉴定特定 RNA 模板时最敏感的技术。迄今的数据表明人 AFP 在来 自肝祖细胞的两个人细胞系 (HepG2 和 Hep3B) 中以完全形式存在， 在来自造血祖细胞的人 细胞系 K562 中以截短形式存在。外显子 1 是肝祖细胞亚群体所特有的事实使得人们能够 使用它作为鉴定肝细胞与造血祖细胞类型的探针。 该试验用于鉴定本发明的肝脏祖细胞中 的特定亚群体。
因此， 为了检测肝脏祖细胞中人 AFP mRNA 的存在， 本发明人设计了 9 个 PCR 引物。 所有的引物组合检测人肝细胞系 HepG2 和 Hep3B 中的 AFP mRNA。然而， 除了用于全长 hAFP mRNA 的一个外所有的引物组合在人红白血病细胞系 K562 中都扩增 AFP mRNA 的部分。如 上推测， 这证实了在 K562 中表达 AFP 的一种截短形式， 而不是全长形式。该结果表明鉴定 肝细胞的有用引物仅仅是检测全长 AFP 的那些引物， 更多证明其表达以组织特异性方式受 到限制。筛选肝细胞与造血细胞来源的一些细胞系和原始组织中 AFP 的完全与截短形式。 尽管在一些造血组织中发现了 AFP 的截短形式， 但组织中哪一种细胞类型表达它仍是未知的。 由于在造血细胞的一些亚群体中发现了 AFP 的截短形式， 所以也分析了肝细胞和 造血细胞中的白蛋白。白蛋白的引物以类似于 AFP( 见上文 ) 的方式形成并用于评估肝细 胞与造血细胞系中白蛋白的表达 ( 见图 4)。对于 AFP， 在造血细胞系 K562 中发现了一种截 短的形式， 一种可被外显子 12-14 的引物检测的转录子。
在本文所述的研究之前， 在关于造血祖细胞的大量文献中， 没有一个曾报道在人 的正常造血祖细胞中成熟的或截矩的 AFP 或白蛋白的表达。
人肝脏祖细胞的处理和冷藏
为了最理想地从胎儿或成年肝脏产生分离的人肝脏祖细胞， 本文公开的方案使用 密度梯度的上面部分并去掉沉淀。 本文所公开的密度梯度离心的新变化是弃去沉淀并保留 具有低浮力密度的细胞 ( 即在梯度顶部收集的细胞 ) 并用于进一步研究。本发明人发现了 在 Percoll 密度梯度内或其顶部存在年幼的细胞 ( 即， 二倍体 ) 和对于冷藏更健康的细胞。
本文所述的培养方法学是特有的且被进一步改良用于人和 / 或啮齿类肝脏细胞。 另外， 培养基可包括用纯化的细胞外基质成分包裹的可生物降解珠， 然后可用于接种结合 到珠上的细胞以用于生物反应器。
本发明的冷藏方法学是特有的且不同于现有技术中使用的方法。 主要区别是由于 使用了不同的缓冲液且冷藏包括祖细胞群体的二倍体肝细胞群体， 该细胞密度低， 因此在 梯度离心中上浮。
成熟的人肝脏细胞的成功冷藏是非常需要的， 但在本领域中从未实现。 一般来说， 成功冷藏定义为在液氮温度 (-160℃到 180℃ ) 下冷冻细胞， 然后复苏它们并获得＞ 75％的 活力的能力且具有附着到培养皿上的能力。任何来源的细胞系， 例如精子和卵子和来自胎 儿组织的细胞可在含水缓冲液 ( 即， 诸如 DME， Dulbecco’ s 改良的 Eagle’ s 培养基， 或 RPMI 1640 的培养基 ) 并补充 10％血清 + 冷冻保护剂 ( 最常见的是二甲基亚砜 ： DMSO) 中成功冷 冻并在复苏时 70-90％有活力且具有极好的贴壁能力。
本发明的特殊冷藏方法学通过使用新缓冲液， 新细胞群体和包括以细胞外基质的 形式包埋细胞的改变来实现。 该方法学首次实现了复苏时的活力与冷冻前细胞分散后立即 测量的活力没有不同 ( 参见图 3)。实际活力由于到达时组织的状况而可变， 在本试验中胎 儿尸体肝脏细胞平均为 77％。 该冷藏方法学导致冷冻过程后的活力和复苏后离开体内的可 贴壁和增殖的细胞不明显损失。
细胞标记和流式细胞术
使用我们现在的定义， 即肝脏祖细胞是表达甲胎蛋白且表达或不表达白蛋白的未 成熟细胞群体， 评价了特异性选择这些细胞的标记。一个令人惊奇的发现是许多作为造血 祖细胞传统标记的标记 ( 即 CD34) 也可鉴定肝祖细胞亚群体。因此， 对 CD34 的单一颜色分 选导致明显富集 ( 至少 9- 倍 ) 表达 AFP 的细胞。然而， 不是所有的这些 AFP 阳性细胞都被 证实是肝祖细胞。根据白蛋白阳性的百分数， 大约 80-90％的细胞是肝祖细胞， 其它是未成 熟以致尚未表达白蛋白的肝祖细胞或者可能是表达甲胎蛋白的造血亚群体。
本发明使用了独特的流式细胞分选策略。使用 AFP 和白蛋白表达的组合作为肝祖 细胞的两个独特限定特征， 鉴定了限定肝祖细胞的抗原标记和其它流式细胞术参数。目前 的分选策略包括分选小细胞 ( 通过前向散射测量为＜ 15 微米 )， 它是二倍体 ( 使用 Hoechst
染料 33342 产生的荧光 )， 侧面散射无颗粒， 且对某些造血细胞抗原 ( 即血型糖蛋白 A， 红血 细胞抗原和 CD45) 为阴性， 接着是肝细胞亚群体和造血细胞亚群体共有的标记 ( 即 CD14 和 / 或 CD38) 为阳性。
在本文所述的实验中， 本发明人通过分选高度表达甲胎蛋白， 表达已知是特异性 造血干细胞标记的 CD34， 和任选微弱表达白蛋白的那些细胞来鉴定肝祖细胞。本文还描述 了造血细胞也可表达 AFP， 尽管是一种截短形式的证据。 本发明人描述了一种新细胞群体和 分离、 鉴定、 培养的方法， 以及使用该细胞群体的方法。 本发明的特定细胞群体的分离、 鉴定 和培养的成功部分通过先进的分离方法， 亲和压实， 具有更大速度和精确度的高速荧光激 活细胞分选， 和改进的冷藏和培养技术实现。
设计流式细胞分选策略从新分离的细胞悬液或从复苏的冷藏肝脏细胞中纯化肝 脏祖细胞， 它包括 1) 用一些抗特异性细胞表面标记的荧光探针标记的抗体染色细胞和 2) 在多参数流式细胞技术中使用阴性和阳性分选的联合。 从人肝细胞群体纯化特定谱系阶段 的方法可用于来自任何年龄供体的肝脏， 因为该标记似乎是谱系 - 位置特异性的。
改进的标记细胞的方法， 和相对于过去使用的流式细胞仪 (Becton Dickenson’ s FACSTAR PLUS， 以 2000-6000 个细胞 / 秒分选细胞且进行 2-4 种颜色分选 ) 显著改进的流 式细胞仪 ( 来自 Cytomation 的 “aMoFlo” 流式细胞仪， 以 40,000 个细胞 / 秒分选细胞且进 行 8 种颜色分选 ) 帮助成功分离， 和鉴定了这一新的细胞群体。 在细胞悬液中完全确定了 AFP 和白蛋白样免疫反应性的表达， 有清楚的一群细胞 与背景信号表现出明显的区别 ( 图 6)。在未分离的细胞悬液中 6.9±0.86％的细胞表达甲 胎蛋白， 而在 7.7±1.1％中存在白蛋白。 在 AFP 阳性细胞中， 75.6±4.9％共表达白蛋白， 而 80±5.5％的白蛋白阳性细胞也表达 AFP。因此， 大约 25％的表达甲胎蛋白的细胞不表达白 蛋白且 20％的表达白蛋白的细胞不表达甲胎蛋白。
完全细胞悬液 ( 即包括红细胞 ) 中带有本研究中使用的原则性表面标记的细胞比 例在表 1 中显示 ( 其中 GA 是血型胜蛋白 A， 红血细胞上的一种表面标记 ) ：
表1： 原始肝脏细胞悬液中 CD 阳性群体的百分数和 AFP 阳性的百分数
CD14 CD34 CD38 CD45 GA
未分离的悬液
占群体％ 3.7±0.8(8) 2.8±0.5 2.2±0.4 2.6±0.5 36.8±5
AFP 阳性％ 81.7±2.2 72.6±4.2 57.6±4.6 22.2±4.4 2.3±0.6
很明显， 血型糖蛋白 A(GA) 阳性细胞 ( 即红细胞 ) 是细胞群体的主要组分， 但 AFP- 阳性细胞是微小部分。因此， 当通过 Percoll 分离法去掉细胞悬液中的红细胞时， 表 达 AFP 的细胞比例显著增加到 12.9±1.9％且表达白蛋白的那些细胞增加到 12.1±2.3％。 共表达白蛋白的 AFP 阳性细胞百分数也增加到 80.5+8.2％且共表达 AFP 的白蛋白阳性细胞 比例增加到 89+3.1％， 尽管没有统计学上显著的改变。该操作对携带表面标记的细胞比例 的结果与显示 AFP 染色阳性的各亚组的比例一起在表 2 中显示。
表2： 去掉红细胞后肝脏细胞悬液中 CD 阳性群体的百分数和 AFP 阳性的细胞百分 数
CD14 CD34 CD38 CD45 GA
去掉红细胞
％占群体 7.4±1.3 3.4±0.5 4.8±0.9 8.2±0.3 27.5±4.7
％ AFP 阳性 89.8±1.3 77.1±2.9 53.5±7.2 32.5±1.3 1.8±0.9
在大多数情况下， 在以细胞表面标记选择的亚组中 AFP 的存在连续分布， 显示出 染色强度在阳性范围内的细胞明显占优势。然而， 对于共表达 AFP 的 CD38 阳性细胞的分布 是独特的。在 CD38- 阳性细胞中， AFP 共表达明显呈双峰分布， 其中明显有两个不同组的细 胞， 一个为 AFP 阳性组， 另一个为阴性。这点在图 8a 中显示， 它显示了表达 CD14 和 CD38 的 染色细胞的散点图以及在 CD14 和 / 或 CD38 阳性细胞中甲胎蛋白表达的单变量直方图。
结果表明甲胎蛋白 (AFP) 在胎儿肝脏组织的单细胞悬液 ( 即原始细胞悬液 ) 中 的 7％的细胞中存在。发现抗血型糖蛋白 A( 在红血细胞， 即红细胞上的一种抗原 ) 的抗体 鉴定出不表达 AFP 的细胞亚群体。因此， 从打算鉴定肝祖细胞的细胞中排除表达该抗原的 细胞 ( 即， 红细胞 )。CD38 抗原鉴定了一群细胞， 它们表现出 AFP 阳性细胞的比例显著提高 ( 即， 比未分离样品中的比例高 7 倍 )。两种抗原都具有许多同种型， 取决于是否有剪接变 异体编码的分子片断存在。鉴定各种同种型的抗体是可获得的。
造血祖细胞的传统标记， 即 CD34 存在于许多也表达 AFP 的细胞上。CD34 阳性细 胞的分选导致 AFP 阳性细胞的富集比原始细胞悬液中发现的高至少 9 倍 ( 在 CD34- 阳性细 胞中的 67％与在原始细胞悬液中的 7％ )。然而， 富集 AFP 阳性细胞最有效的单一抗体是 CD14， 它导致这些细胞的比例比原始群体增加 11 倍 (81％相对于 7％ )。
因此， 通过使用表面标记的组合提高了 AFP 阳性细胞的产率。因此， 测定 AFP 与表 面标记的选定组合共表达的程度以建立增加细胞内标记的选择程度。 该数据表示为表达表 面标记的 AFP 阳性细胞的比例 ( 称为 AFP 阳性细胞的 “产率” ) 和在表面标记限定的群体中 出现的所有 AFP 阳性细胞的比例 ( 称为 AFP 阳性细胞的 “富集” 系数 )。CD14， CD34 与 CD38 组合的结果以及用于比较的单个结果在表 3 中表示。
表 3.
CD14 CD34 CD38 CD14±CD38 CD14±CD34
富集 80.6±2.6 66.7±4.7 53.8±4.5 66.9±3.5 68.2±3.9
产率 39.8±2.6 26.9±4.4 22.0±2.7 50.6±2.7 52.2±5.5
富集 ： 表达任一 ( 或两种 ) 表面标记且同时为 AFP 阳性的细胞百分数。
产率 ： 同时表达一种或两种表面标记组合的 AFP 阳性细胞百分数。
对于 CD14/CD38 标记组合的这些数据还显示在图 9 中。
AFP 染色阳性的细胞形态学是可变的且包含来自胎儿肝脏而不是成人肝脏的细胞 悬液中的细胞大小和形状的全部范围。最大的 AFP- 阳性细胞大约 12-15 微米， 比大小范围 为 20-50 微米的成熟肝细胞小得多。这点在图 10 中显示， 该图显示了一些 AFP- 阳性细胞 选择表达特异性抗体。
在所有情况下一定比例的 AFP- 阳性细胞显示出不表达在本研究中使用的任何表 面抗体。这些 AFP 阳性 “裸” 细胞的外观在图 11a 和 11c 中表示， 其中将它们与从相同悬液 分选的 CD14 阳性 /AFP 阳性细胞的外观 ( 图 11b 和 11d) 进行了比较。图 11a 和 11b 是微 分干涉相差显微镜照片， 图 11c 和 11d 是 AFP 免疫荧光。很明显尽管两种细胞类型都是 AFP 阳性， 但表面抗原染色阴性的细胞比 CD14 阳性细胞更小且复杂度更低。
总之， 分选肝祖细胞的标记是血型糖蛋白 A-， CD45-， ICAM+， CD14+ 和 / 或 CD38+， 或者除了 ICAM+ 外所有这些标记都无， 且是二倍体， 无颗粒 ( 侧向散射 )， 不超过 15 微米 ( 前 向散射 )。这些分选细胞的表型是小细胞 ( ＜ 15 微米 )， 细胞质较小 ( 核 / 胞质比率高 )， 白蛋白和 / 或
。该细胞的形态学见图 10-12。胎儿和成人肝脏中表达甲胎蛋白的细胞的聚焦鉴定
使用聚焦显微镜以获得表达甲胎蛋白的人胎儿， 小儿， 或成人细胞的图像。 该方法 学允许现察这些细胞的形态学和大小并直接显示诸如 AFP 和 ALB 的细胞内蛋白的位置和诸 如 CD34 和 CD38 的膜表面标记的位置。表达 AFP 的细胞在胎儿， 小儿， 和成人肝脏中都有发 现 ( 图 12a)。正如预期， 胎儿肝脏具有最高百分数 (6-7％ ) 而成人肝脏具有小百分数 ( 青 年＜ 4％ ) 且在中年人中随年龄减少到＜ 1％。在年龄超过 57 岁的供体肝脏中没有发现表 达 AFP 的细胞。通过 Percoll 分离过程显著富集在尸体肝脏中发现的少量肝祖细胞使得在 供体肝脏的 Percoll 馏分 1 和 2 中得到 2％的细胞 ( 表 4)。
表 4 显示了来自 Percoll- 添加缓冲液的馏分的细胞大小和活力。在相同条件下 分离后较小的细胞 ( 馏分 1-3) 比较大的细胞 ( 馏分 4) 具有更高的活力。
表4
Percoll 馏分 活力 (％ ) 细胞大小 (μm)％ AFP+ 细胞
馏分 1 82 ＜ 12 0.5-1％
馏分 2 84 10-15 2％
馏分 3 85 15-25 ＜ 0.2％
馏分 4 56 25-50 ＜ 0.01％
这些结果表明优选用于肝脏细胞治疗以及器官移植的供体器官包括来自年龄达 到 45 岁的青年供体的器官且该肝脏优选从心跳停止的前 30 小时内分离。来自老年病人 ( 年龄＞ 71 岁 ) 的肝脏对于细胞治疗且也许对于完全器官移植， 特别是对于儿童不是合适 的供体， 因为它们具有较小 ( 如果有的话 ) 的来自肝祖细胞的再生能力且仅具有最小的已 知从成熟细胞获得的再生能力。
成熟谱系
本发明的发明人显示了局部缺血损伤的肝脏含有在正常和疾病状态下都能生长 并分化成肝细胞和胆细胞的肝祖细胞群体。本发明支持了这样的观点， 即肝脏谱系中的每 一位置是不同的成熟阶段且在肝脏中有多种干细胞群体。
令人惊奇的是本发明的肝脏提供了 3 种不同的成熟谱系 ： 一种负责肝生成， 产生 肝脏组织且具有肝细胞和胆细胞 ( 胆管 ) 的细胞命运 ； 另一种负责造血， 产生血细胞， 具有 淋巴细胞 (B 和 T)， 血小板， 巨噬细胞， 嗜中性白细胞和粒细胞的细胞命运 ； 第三种负责间充 质形成， 产生间充质衍生物且具有内皮细胞， 脂肪细胞， 基质细胞， 软骨细胞， 甚至是骨细胞 的细胞命运。
本发明分离的细胞群体具有作为成功地肝脏定向细胞治疗和 / 或基因治疗的巨 大潜力。如实施例所述， 本发明在非人灵长类以及人肝祖细胞可成功进行细胞培养和维持 同时仍保留其完全分化或成熟的能力的条件鉴定方面取得了巨大进展。 按照本文公开的教 导， 可以从尸体分离并在培养基中维持未分化的肝祖细胞， 然后更换成分化相关培养基用 于移植。
由于其明显的体外扩增能力， 本发明的细胞群体相似于造血谱系中的细胞， 可用 作细胞种子用于离开体内的扩增。这可消除对病人肝脏的主要侵入性手术切除术的必要 性。
一旦在培养基中建立人肝祖细胞， 可进行基因转移。这可用许多不同基因传递载 体系统来实现 ( 见下文提供的实施例 )。在这点上的一个重要考虑因素是一些形式的基因 转移需要迅速生长的细胞， 由于本发明的人二倍体细胞和 / 或祖细胞在正常生理学条件下 有效分裂， 因此这些细胞是将基因转移进肝脏的理想候选者。 另外， 本发明的细胞群体的生 长特征允许用于离开体内的基因转移， 其中使用的某些基因传递病毒载体需要细胞增殖以 便有效插入和表达基因。
本发明的祖细胞群体也适合于自体或同种异体肝脏定向细胞或基因治疗。很明 显， 使用自体肝祖细胞可消除有关移植细胞排斥的重要顾虑。本发明的细胞群体对于同种 异体细胞转移特别有吸引力， 因为其抗原分布情况表明它具有最小的免疫排斥现象。 而且， 已知具有高度免疫原性的诸如血细胞， 内皮细胞， 肝巨噬细胞的其它细胞成分通过该纯化 过程基本上被剔除。
一旦分离和纯化了该自体或同种异体肝祖细胞， 可对它们进行遗传修饰或原样使 用， 如果需要可进行增殖， 然后移植回宿主。 如果需要遗传修饰， 在遗传修饰后和移植前， 可 扩增那些遗传修饰的细胞和 / 或根据显性选择标记的插入和表达进行选择。可移植回肝室 或异位位点。为了移植进肝室中， 可使用门静脉输注或脾内注射。脾内注射是可选择的施 用途径， 因为经脾内注射移植的大多数肝祖细胞可移动进肝脏。一旦在肝室中， 移植的， 遗 传修饰的肝祖细胞成熟成正常肝细胞形态学。
另一医学方法可促进移植的肝祖细胞移入肝的效力。 动物模型证实在部分肝切除 术中， 施用血管形成因子和其它生长因子帮助移植的肝细胞移入和有活力。一个替代方法 是将遗传修饰的肝细胞移植进异位位点。
至今对于肝脏的细胞治疗方法仅显示出平常的效力。这可能是由于这样的事实， 即使用的供体细胞主要是成人肝脏细胞且分离和再注射后寿命短。另外， 使用成人细胞导 致强烈的免疫排斥。 在本案例中， 肝祖细胞提供了更大的效力， 因为其诱发免疫学排斥现象 的能力有限且因为它们具有广泛的再生潜力。
对于基因治疗， 正在进行的努力使用了 “定向可注射载体” ， 它是开发中的用于临 床治疗的最流行途径。 这些方法的效力有限， 因为免疫学问题和载体的瞬时表达都存在。 用 祖细胞进行离开体内的基因治疗 ( 或者使用可注射载体以某种方式靶向那些祖细胞群体 ) 可证实更有效， 因为该载体可导入离开体内的祖细胞的纯化亚群体 ； 选择修饰的细胞并重 新导入体内。祖细胞的优势是它们有巨大的扩增潜力， 最小的免疫反应诱导力 ( 如果有的 话 )， 和分化产生全部谱系的成熟细胞的能力。
共同或相互依赖的谱系
改进的方法学使得本发明人能够更严密地研究和鉴定肝祖细胞。 这些研究揭示了 肝祖细胞与造血祖细胞之间特别密切的关系， 表明这两个谱系之间有近亲关系。 事实上， 这 些研究表明肝祖细胞和造血谱系共有许多抗原标记 (CD14， CD34， CD38， c-kit， 卵形细胞抗 原 )， 共有生化特性 ( 即， 转铁蛋白， 谷胱甘肽 -S- 转移酶， 和甲胎蛋白的截短同种型 )， 且在 用于离开体内的扩增的培养要求 ( 细胞外基质的形式和特定激素要求 ) 上有广泛的重叠。两个谱系的祖细胞位于肝脏腺泡内的相同位点。最后， 两个成熟谱系的细胞中存在旁分泌 信号 ； 它是由各谱系产生的调节另一谱系的细胞的信号。 事实上， 可推断在肝细胞和造血细 胞之间有一个共同的谱系或至少是相互依赖的谱系。
可纯化本文公开的细胞群体并用于根据细胞的分离和培养条件产生骨髓造血细 胞或肝细胞衍生物。 因此， 如果细胞被再导入体内进入血液中， 它们可有效地产生骨髓造血 细胞衍生物 ； 如果被导入肝脏， 它们会产生肝脏细胞。 在离开体内维持的细胞中应出现相似 的现象。因此， 用同时限定肝和造血祖细胞的一组抗原 ( 即， CD38+， c-kit+， CD45-) 分选的 细胞群体接种的生物反应器系统可导致细胞群体具有多种命运。
本发明的细胞群体的另一重要方面是群体中的一些细胞展示出特异性的祖细胞 表面抗原 CD34。CD34 已被用作骨髓造血干细胞的方便的阳性选择标记。本文公开的本发 明显示了纯化任何祖细胞群体的更好方法， 例如随后可用于临床和临床前期程序的造血和 肝祖细胞群体。
人肝祖细胞的用途有许多且变化多样。它们包括 ： 1) 对人细胞的研究 ； 2) 产生疫 苗或抗病毒剂 ； 3) 毒理学研究 ； 4) 药品开发 ； 5) 蛋白质生产 ( 使用该细胞作为各种人特异 性因子的宿主 ) ； 6) 肝脏细胞治疗 ： 7) 肝脏基因治疗 ； 8) 可用于研究， 毒理学和抗微生物试 验， 蛋白质生产， 或者临床上用作肝脏辅助系统的人造生物肝脏。 考虑到正如本发明的发明 人所预言的， 在造血和肝生成之间有共同谱系的可能性， 相同的细胞可同时适合于肝细胞 或者造血细胞命运， 这取决于它们所放置的微环境。
高度纯化的人肝祖细胞的可获得性允许对人细胞进行更加广泛的研究， 且肯定会 帮助建立肝脏细胞治疗和基因治疗的成功方式， 并允许建立人的人造生物肝脏用于研究和 作为临床辅助装置。目前， 健康人体组织的供应有限妨碍了在肝脏细胞治疗或人的人造生 物肝脏中的临床计划。 从尸体获得的包括其祖细胞群体的二倍体细胞具有足够的扩增潜力 以极大地缓解这种有限的供应。
下面的实施例是举例性的且不打算进行限制性。
实施例
来自尸体的肝脏获取
来自尸体的肝脏经门静脉， 腔静脉， 或两者插入导管， 用缓冲液灌流以清除血液 ； 然后用含有胶原酶 / 蛋白酶的缓冲液灌流以酶促解离细胞。根据肝脏的大小通常进行 15-30 分钟的消化后， 将组织挤压通过干酪包布或尼龙滤膜或用梳子耙过以机械完成细胞 解离过程。 用含有血清的缓冲液清洗解离的细胞以灭活胶原酶和在灌流过程中使用的其它 酶。
灌流缓冲液 P1 和 P2 放在 37℃水浴中。在 Miller 型灌流盒中进行灌流， 该灌流 盒在整个灌流过程中维持在 37 ℃。灌流期间给缓冲液充氧。盒中的所有管道用 70 ％的 乙醇清洗， 接着用蒸馏水清洗， 然后用 P1 清洗以保证从系统中去掉空气。对于大块肝脏 (100-300g) 使用在肝脏的切口表面可利用的各种血管， 使用配置在 60ml 注射器上的 16 号 针头的 Teflon 插管进行肝脏插管以便用冰冷的 P1 缓冲液流过肝脏。对于可获得完整肝叶 的情况， 可对残留的腔静脉做插管。试验大块肝脏中的各种血管以获悉哪一条血管可提供 最佳的组织灌流。该操作也从肝脏中去掉了任何剩余的血液。对选定的血管做插管并使用 医疗级粘合剂 ( 例如， 医疗级 “超级胶 (superglue)” ) 密封固定。使用医疗级粘合剂密封所有其它的大血管和表面开口， 且如果需要， 使用带粘合剂的 Q- 滴头帮助密封开口。一旦 粘合剂干燥， 将肝脏样品放在合适大小的玻璃杯内的尼龙网上。将 P1 缓冲液加入杯中， 并 将肝脏浸没在缓冲液。将装有肝脏的杯子放在灌流盒内， 并连接上插管的输出管道。用可 接受的反压开始以大约 24mls/ 分钟的低速， 然后缓慢增加到 58ml/ 分钟和 90ml/ 分钟之间 以优化流速将 P1 缓冲液再循环 15 分钟。必须确认没有过多的灌流液从肝脏泄露。15 分钟 后， 从杯中取出 P1 缓冲液并用含有胶原酶的 P2 缓冲液代替。再循环 P2 缓冲液直到肝脏被 充分消化 ( 通过肝脏从深色微红棕色向淡棕色的颜色转变和通过获得肝脏的软糊状结构 来评估 )。P2 缓冲液再循环不超过 20-25 分钟。一旦结束灌流， 从杯中排出 P2 缓冲液并将 肝脏在杯中转移到生物学包布上。
向杯中加入细胞培养基 (DMEM)， 去掉插管和粘合剂以及肝脏的任何未消化区。使 用组织镊子和剪刀破坏肝脏被膜 ( 肝被膜 )。 这允许将消化的组织释放进培养基中， 剩下结 缔组织和任何未消化的材料。将消化的材料放入 DMEM 中， 然后通过一系列不同大小的滤膜 过滤。滤膜放在大型漏斗的内侧以帮助过滤。消化的材料首先用单层干酷包布过滤， 接着 用 400μ 的尼龙滤膜过滤， 然后通过 70μ 的特氟隆滤膜。将滤液平分进离心管并以 70g 离 心 4 分钟。
离心后， 在加入 Percoll 前， 上清称为馏分 1(F1)。 向细胞沉淀中加入 DMEM 和等渗 的 Percoll 以得到分别为 3 ∶ 1 的最终比率。 例如， 5ml 体积的堆积细胞的小团悬浮于 30ml 的 DMEM 和 10ml 的等渗 Percoll 中。将样品以 100g 离心 5 分钟以产生称为 F4 馏分的沉淀。 上清以 200 至 400g 再离心 5 分钟以获得称为 F3 馏分的沉淀。现在上清再以 600-800g 离 心以获得称为 F2 馏分的沉淀。以 1200-1800g 进行最后的离心以获得称为 F1 馏分的沉淀。 悬浮不同馏分的细胞并使用锥虫蓝染料排斥试验评估其活力。不同馏分的活力在表 4 中提 供。
保留肝脏灌流后与肝脏组织的血管或胆管树保持结合的细胞。 这些细胞在酶灌流 后获得的原始细胞悬液中发现， 且一般在悬液中的细胞通过后留在滤网 ( 例如， 干酪包布 ) 的上部。用酶再次处理血管和胆管树的这些残留物， 所得的细胞与其它细胞合并在一起。
大多数研究者在肝脏灌流中通常使用 Percoll 分馏法以排除他们认为是碎片和 死亡细胞的成分 ； 但这些研究者仅保留了最终的细胞沉淀。本文所公开的对常规灌流的新 变化是， 这里称为 F4 的第一细胞沉淀含有发现对局部缺血， 无论是暖或冷局部缺血最敏感 的细胞， 且具有较低浮力密度的细胞 ( 即， 从以较高速度离心获得的沉淀收集的细胞 ) 对局 部缺血敏感性较小。在 F1， F2， 和 F3 馏分中的这些细胞较小， 可能是年幼的实质细胞且具 有更大的冷冻适应性 ( 见冷藏部分 )。而且， 这些细胞基本上是二倍体细胞， 而来自成人 F4 馏分中的细胞含有大量多倍体细胞。多倍体细胞可以是双核或单核的， 且可以是四倍体或 八倍体， 或者甚至是更高水平的倍性。
倍性与细胞群体的分馏相关
发 现 上述 成人肝脏 细胞的 馏分 (F1-F4) 含 有不 同的 细胞 群体 ； F1 含有碎 片， 红血细胞， 肝星形细胞， 和含有祖细胞群体 ( 肝谱系或造血谱系的祖细胞 ) 的小肝细胞 ( ＜ 12μm) ； F2 馏分含有是二倍体， 小实质细胞的较大肝细胞 (12-15μm) ； F3 馏分含有更 大型的实质细胞 (15-25μm) 且由二倍体和四倍体细胞的混合物组成 ； F4 馏分 ( 所有其它 研究者使用的馏分 ) 由最大的实质细胞 (25-50μm) 组成且几乎全部是多倍体 ( 例如， 四倍体和八倍体 )。
一般来说， F1-F3 馏分中的实质细胞冷冻后 79-95％具有活力 ； F4 馏分中的实质细 胞冷冻后具有 50-80％的活力 ( 依赖于到达时肝脏的状态 )。鉴定的影响 F4 馏分中实质细 胞活力的变量是 ： 1) 供体的年龄 ( 供体的年龄越大， 细胞的预后越差 ) ； 2) 心跳停止到交付 到实验室之间的时间 ( 越短越好 )。这些因素是相互影响的以致于迅速交付的年长供体的 组织比花费太长运输时间的年轻病人的组织更有吸引力。
局部缺血对细胞分馏的影响
检查由于局部缺血时间和温度的影响细胞活力的结果。 肝脏保持在环境或以上温 度的情况称为暖局部缺血。肝脏保持在环境温度以下的情况称为冷局部缺血。在通常实践 中， 暖局部缺血相应于活体温度与室温之间的温度， 而冷局部缺血相应于室温以下的任何 温度， 例如， 大约 10℃或大约 4℃。
在暖局部缺血中， 肝脏保持在环境温度以上， 然后灌流肝脏。 在暖局部缺血的另一 形式中， 肝脏保持在环境以上温度一定时间， 然后冷却， 随后用暖解离溶液灌流。处理各灌 流产生的单细胞悬液以提供具有不同比例的二倍体和多倍体细胞的细胞馏分。 祖细胞是二 倍体细胞的亚群体。 而且， 观察到分化的多倍体细胞对环境以上温度的局部缺血敏感。 在下 表中， 择过用染色死细胞的细胞核的碘化丙锭 (PI) 染色区分活的大鼠肝脏细胞与死细胞。 在以流式细胞术分选的活的和死亡细胞馏分中在固定， 透化， 以及用 PI 复染之后观察所有 细胞中的细胞核来计数单核或双核细胞。 表5
暖局部缺血时间 活细胞双核％ 死细胞双核％
无 32 30
2 小时 27 47
使用大鼠作为模型测量了由于暖局部缺血时间的影响来自肝脏灌流的总细胞产 量。使用大约 8 周龄， 各 250-300g 的雄性 Sprague-Dawley 大鼠。测量无局部缺血的动物 每个肝脏产生＞ 400x106 个分离的细胞。暖局部缺血时间不超过 1 小时时发现总细胞产量 迅速下降到每个肝脏提供 150 到 250x106 个细胞。时间在大约 1 小时到 5 小时之间时发现 总细胞产量相对稳定在每个肝脏产生 50 到 150x106 个之间的细胞。 暖局部缺血时间不超过 1 小时时活细胞产量迅速下降， 大于 1 小时时稳定在每个肝脏大约 10x106 个细胞。因此， 发 现活细胞的比例与暖局部缺血呈双峰。在不超过 1 小时时， 活细胞和死细胞都急剧降低以 致于活力比不变。在大于 1 小时和达到 5 小时时观察到稳定的活细胞百分数。
使用上述大鼠模型测量由于暖局部缺血时间的影响肝脏细胞核的投射区。 灌流肝 脏， 细胞分离为单细胞悬液， 并用碘化丙锭染色。以流式细胞术收集活细胞 (PI- 阴性 )， 然 后附着到显微镜载玻片上， 固定， 透化并用 PI 复染以观察细胞核。对于无局部缺血灌流的 对照动物， 发现细胞核面积具有双峰分布， 相应于单核和双核活的肝脏细胞都存在。 暖局部 缺血 1 小时后和 2 小时后， 发现双核细胞的比例降低。由于双核细胞必定是多倍体， 认为这 些数据表明多倍体细胞比二培体细胞对局部缺血更敏感。
通过分析单核细胞中细胞核的大小进一步支持了二倍体细胞对局部缺血的抗性。 单核细胞可以是二倍体或者是多倍体， 二倍体细胞具有比多倍体细胞更小的细胞核。上述 大鼠模型用于制备测量细胞核面积的活细胞。图 1a 中提供了总细胞核的百分数， 表明具有
小核的细胞对局部缺血具有相对抗性。由于多倍体核倾向于比二倍体核更大， 发现这些数 据表明了二倍体细胞对暖局部缺血具有相对的抗性。发现在对照肝脏和局部缺血 2 小时后 的肝脏中细胞核大小之间的改变无区别， 如图 1b 所示。
也有利地检查了由于低温局部缺血时间的影响细胞的活力， 见表 6 和 7。 在该实施 方案中， 肝脏基本上在死后立即迅速冷冻到大约 10℃。 甚至更有利的是， 肝脏基本上在死后 立即迅速冷冻到大约 4℃。 通过本领域的技术人员已知的一些任何方法可实现冷冻， 包括但 不限于在供体尸体腹部堆积冰块或冰冷的液体袋的简单权宜之计。 肝脏保持在一种上述环 境温度以下， 然后在时间达到大约 30 小时， 或更有利的是在时间达到 20 小时时按所述进行 灌流。处理灌流产生的单细胞悬液以提供祖细胞。观察到多倍体细胞对即使温度维持在环 境温度以下和甚至在 4℃的局部缺血敏感。
表6
人胎儿肝脏
# 139 5
冷局部缺血 ( 小时 ) 18 66平均活力 +/- 标准差 ( 标准误差 ) 75.4±15.9(1.7) 24±8.9(4)表7 小儿和成年人肝脏馏分 肝脏 # 冷局部缺血 ( 小时 ) 活力 ± 标准差 ( 标准误差 )F19＜ 2067.9±18.3(6.1)F14＞ 2062.5±17.5(8.8)F27＜ 2083.4±10.3(3.9)F26＞ 2073±16(6.5)23CN 101955906 A说8 ＜ 20明书81.9±8(2.8)21/37 页F3F35＞ 2075.2±14.5(6.5)F4 F4
16 13＜ 20 ＞ 2081.6±7.4(1.9) 21.2±24.9(6.6)按一种或多种上述方法所述从供体肝脏制备的祖细胞适用于冷藏， 流式细胞术， 细胞染色， 细胞分选， 肝脏再生， 生物反应器， 人造肝脏和按下文上述作为治疗性疗法。
在人供体中的暖局部缺血
样品 Ren#200 是 1999 年 5 月 21 日接受的男性成年供体。该供体被宣告脑死亡且 评估为用于器官移植的供体。然而， 在移植的外科医生能获取器官前， 供体心跳停止。外科 医生能在心跳停止的 30-60 分钟内取出肝脏， 该时期构成 “暖局部缺血时间” 。交叉夹紧的 时间是 1999 年 5 月 20 日 21:19。用运输缓冲液 (Viaspan) 冲洗肝脏并放在冰上运回 UNC。 UNC 在第二天上午 11 点收到 ( 构成 13 小时 41 分钟的冷局部缺血 ) 并立即处理。发现该处 理产生了具有所示活力的下列细胞悬液 ：
表8
因此， 对经历暖局部缺血以致于导致其不适合于器官移植的人肝脏组织进行的处 理发现产生含有二倍体细胞的分离细胞馏分。
在从人肝脏分离的二倍体细胞中甲胎蛋白的表达
车辆碰撞后冲击创伤单位 (Shock Trauma Unit) 收到且宜告 DOA 的男性病人， 37 岁， 估计在冲击创伤单位接受前 25 分钟死于心跳停止。经过外部消毒准备供体尸体用于器 官捐赠。无菌取出肝脏， 包装进无菌袋中， 冷却用于转移到附近的细胞实验室中。通过使用 无菌表面温度探针测量供体肝脏核心温度。在估计的死亡时间后 45 分钟记录到 10℃的温 度。开始用暖解离溶液 ( 见上文 ) 灌流肝脏。按上文所述制备供体肝脏细胞悬液， 经过按 上文所述在补充了 Percoll 的缓冲液中离心来分离活的二倍体细胞。将分离的细胞分成等 分试样用于冷藏， 用于包括抗原定型的进一步鉴定， 和用于在移植进抗原匹配的受体前在
细胞培养基中的扩增。
第二例男性病人， 34 岁， 在交通事故后急诊室收到且宣告 DOA， 死于内部撕裂引起 的失血且因此估计在急诊室收到前 45 分钟时心搏停止。经过外部消毒准备供体尸体用于 器官捐赠。无菌取出肝脏， 包装进无菌袋中， 冷却用于转移到附近的细胞实验室中。通过使 用无菌表面温度探针测量供体肝脏的温度。在估计的死亡时间后 80 分钟记录到 10℃的温 度。开始用溶液 ( 见上文 ) 灌流肝脏。按上文所述制备供体肝脏细胞悬液， 经过按上文所 述在补充了 Percoll 的缓冲液中离心来分离活的二倍体细胞。将分离的细胞分成等分试样 用于冷藏， 用于包括抗原定型的进一步鉴定， 和用于在移植进抗原匹配的受体前在细胞培 养基中的扩增。
按上述从两个供体制备分离细胞的样品用于以抗甲胎蛋白的抗体染色， 和经过在 FACStar 细胞计数器上的细胞分选进行分析。将相应于基本上是二倍体细胞的具有小核的 单核实质细胞的细胞亚馏分与相应于多倍体细胞， 即具有大核的单核细胞和双核细胞的细 胞亚馏分进行比较。 来自经历不同时间的暖局部缺血的年龄和性别匹配的供体的细胞比较 用于评估二倍体和多倍体肝脏细胞对暖局部缺血影响的相对敏感性。 表达甲胎蛋白的肝祖 细胞是肝脏二倍体细胞的亚群体。 评估出表达甲胎蛋白的细胞在冷或暖局部缺血中存活的 能力等于或好于其它二倍体肝脏细胞群体。
用于 PCR 研究的引物形成
在肝细胞与其它细胞类型中差别表达的甲胎蛋白 (AFP) 同种型分析。细胞系 ： 两 种人肝细胞瘤， Hep3B 和 HepG2， 在补充了 1mM 丙酮酸钠， 2mM L- 谷酰胺， 50U/ml 青霉素， 50μg/ml 链霉素， 0.1mMMEM 非必需氨基酸溶液， 5μg/ml 胰岛素和 10％ FBS 的 Eagle’ s MEM 中维持。人红白血病细胞系， K562 和小鼠胚胎成纤维细胞系， STO 在补充了 2mM L- 谷酰胺， 50U/ml 青霉素， 50μg/ml 链霉素， 5x10-5M2-ME 和 10％ FBS 的 DMEM/F12 中维持。
RT-PCR ： 用标准方法从 Hep3B， HepG2， 和 STO 中提取总 RNAs。经过寡聚 -dT 引发合 成 cDNA 并使用本发明人设计和制备的用于人甲胎蛋白 (AFP) 的引物组进行 PCR 扩增。引 物序列如下，
hAFP1 ： 5’ -ACCATGAAGTGGGTGGAATC-3’ ，
hAFP2 ： 5’ -CCTGAAGACTGTTCATCTCC-3’ ，
hAFP3 ： 5’ -TAAACCCTGGTGTTGGCCAG-3’ ，
hAFP4 ： 5’ -ATTTAAACTCCCAAAGCAGCAC-3’ ，
hAFP 外显子 2 ： 5’ -CTTCCATATTGGATTCTTACCAATG-3’ ，
hAFP 外显子 3 ： 5’ -GGCTACCATATTTTTTGCCCAG’ ，
hAFP 外显子 4 ： 5’ -CTACCTGCCTTTCTGGAAGAAC-3’ ，
hAFP 外显子 5 ： 5’ -GAGATAGCAAGAAGGCATCDC-3’ ， 和
hAFP 外显子 6 ： 5’ -AAAGAATTAAGAGAAAGCAGCTTG-3’ ，
引物的组合如下 ：
hAFP1 和 hAFP2，
hAFP3 和 hAFP4，
hAFP1 和 hAFP4，
hAFP 外显子 2 和 hAFP4，hAFP 外显子 3 和 hAFP4，
hAFP 外显子 4 和 hAFP4，
hAFP 外显子 5 和 hAFP4， 和
hAFP 外显子 6 和 hAFP4。
在由 1μM 各引物， 200μM 各 dNTP， 50mM KCl， 1.6mM MgCl2， 10mMTris HCl， pH8.3， 和 1.25U Amplitaq 聚合酶 (Cetus Corp) 组成的 50μl 总体积中进行 PCR。样品加热到 94℃ 3 分钟， 接着 94℃下 2 分钟， 62℃下 2 分钟， 72℃下 3 分钟扩增 30 个循环。最后一个循 环后， 在 72℃进行最后的延伸步骤 7 分钟。然后在 Tris- 醋酸盐 EDTA 缓冲液中含有 5μg/ ml 溴化乙锭的 2％琼脂糖凝胶上对 5μl 的各 PCR 反应液走电泳。人 AFP 基因由 15 个外显 子组成。 为了区分截短的转录子与功能性完全的 AFP mRNA， 选择 AFP cDMA 序列的两个不同 部分作为 RT-PCR 的靶分子。hAFP1 和 hAFP2 的引物组合用于扩增含有起始 MET 的外显子 1 至外显子 3， 而 hAFP3 和 hAFP4 的组合扩增外显子 12 至含有终止密码子的外显子 14。PCR 的结果是两种引物组合部导致在来自 Hep3B 和 HepG2 的 RNA 中检测到强烈的扩增带 ( 泳道 1， 2， 4， 和 5)。相反， 用 hAFP3 和 hAFP4 引物组在来自 K562 的 RNA 中仅检测到 C- 末端部分 的特异性带 ( 泳道 7 和 8)。该结果表明红白血病细胞系 K562 仅表达无 N- 末端的 AFP 的截 短形式。为支持该假设， 使用 hAFP1 和 hAFP4 引物进行了 AFP 全编码区的 PCR。正如所预期 的， Hep3B 和 HepG2 cDNA 的 PCR 显示出 2.1 Kb 的单一显著带 ( 泳道 3 和 6)， 而在 K562 中 没有带 ( 泳道 9)。对照是无 RNA 的样品和来自小鼠胚胎成纤维细胞系 (STO) 的样品。两者 都没有显示出任何可检测的带型。接着， 构建了从外显子 2 至外显子 6 的一系列 5’ 引物以 观察在 hAFP mRNA 的正常和变异体形式之间的区别。结果表明 K562 中 hAFP 的变异体形式 具有除了外显子 1 外所有的编码区。用于人 AFP RT-PCR 的 hAFP1 和 hAFP4 引物的组合适 合于检测含有完全 AFP mRNA 种类的肝细胞谱系中的 AFP mRNA 表达。使用该特异性引物组 合的 RT-PCR 分析可排除在肝细胞或非肝细胞中表达任何截短形式的可能性。该试验用于 鉴定肝脏祖细胞的特异性亚群体或区分共有表面标记的肝细胞或造血细胞群体。
供体肝脏的处理
尸体肝脏 ； 在死后不同时间， 但优选在至少 24 小时， 最多在 30 小时内获得的肝脏。 使用酶消化和机械解离的组合处理肝脏， 胎几 “尸体” 肝脏首先通过机械解离制备， 而成人 尸体肝脏首先通过酶消化解离。各种处理的描述在下面给出。胎儿和成人肝脏都在酶缓 冲液中消化不同的时间长度， 该酶缓冲液用于解离将组织中的细胞结合在一起的细胞外基 质。混合用于分离肝脏细脏的胶原酶是由 Boehringer-Mannheim 生产的高纯度的 “释放酶 (Liberase)” 的酶制品， 它由纯化的胶原酶和弹性蛋白酶的混合物组成。 该酶混合物以小得 多的浓度使用且有害的 “副作用” 更小。
酶溶液 ： 胶 原 酶 溶 液， 60-70mg/100ml 缓 冲 液 (Sigma 的 IV 型 胶 原 酶， 目录号 #C5138 或 Worthington 的 B 型胶原酶， 目录号 #LS005273 ； 两者都是富含胶原酶但具有许 多酶杂质的细菌制品 ) 或者在 P2 缓冲液 ( 见下文 ) 中制备且以 0.23mg/ml 使用的释放酶 (Boehringer-Mannheim 的纯化胶原酶 / 弹性蛋白酶制品， 目录号 1814184)。
细胞洗涤溶液 ： 补充了胰岛素 (5μg/ml)， 转铁蛋白 (5μg/ml)， 与纯化的牛或人 血清白蛋白以 1 ∶ 1 的摩尔比结合的游离脂肪酸混合物 ( 见下文 ) 的 RPMI 1640(Gibco)。
游离脂肪酸的混合物 ： 未成熟的细胞群体和损伤的老年肝脏细胞需要脂类维持和合成其细胞膜。尽管完全成熟的肝细胞可从单一脂肪酸来源 ( 亚油酸 ) 合成其细胞膜， 但 幼年实质细胞不能， 因此需要许多不同脂肪酸的混合物来实现其脂类需要。我们提供了一 种复杂的混合物， 然后与高度纯化的牛血清白蛋白或高度纯化的人白蛋白以 1 ∶ 1 的摩尔 比结合。一般来说， 优选人白蛋白以避免与 “疯牛病” 或牛海绵型脑病相关的问题。因此， 游离脂肪酸的混合物在细胞培养基中以大约 7.6μeq/L(7.6μM) 的终浓度使用。
组合的总共 100mM 的游离脂肪酸的贮液制备如下 ：
棕榈酸 31.0mM 油酸 13.4mM
棕榈油酸 2.8mM 亚油酸 35.6mM
硬脂酸 11.6mM 亚麻酸 5.6mM
单个脂肪酸成分的制备 ；
按如下将单个成分分别溶于 100％的乙醇中 ：
棕榈酸 1M 贮液， 溶于热乙醇中
棕榈油酸 1M 贮液， 易溶于乙醇
硬脂酸 151mM 贮液， 以 1g/21ml 溶于热乙醇中
油酸 1M 贮液， 易溶于乙醇 亚油酸 1M 贮液， 易溶于乙醇
亚麻酸 1M 贮液， 易溶于乙醇
然后混合这些单个贮液以获得 100mM 的 FFA 混合物。使用通氮气制备单个 FFA 和 FFA 混合物的等分试样以减少氧化和增加稳定性。贮液冷冻在 -20℃。
P1 灌流缓冲液 — 无钙和镁的灌流缓冲液 (pH7.2)， 对下列各成分的终浓度限定 为： 118mM NaCl， 4.7mM KCl， 1.2mM KPO4， pH 7.4， 2.5mM NaHCO3， 0.5mM EDTA， 5.5mM 葡萄糖， 0.5％牛血清白蛋白 (BSA)， 抗坏血酸 (50μg/ml)， 胰岛素 (4μg/ml)， 和地塞米松 (1μM).
P2 灌流缓冲液 -Dulbecco’ s 改良的 Eagle’ s 培养基或补充了 0.5％ BSA， 抗坏血 酸 (50μg/ml)， 胰岛素 (4μg/ml) 和地塞米松 (1μM) 的 RPMI 1640。
DMEM 一含有葡萄糖， 丙酮酸钠和 L- 谷酰胺且进一步补充了 5 ％胎牛血清， 胰岛 素 (4μg/ml) 和 地 塞 米 松 (1μM) 的 Dulbecco’ s 改 良 的 Eagle’ s 培 养 基 (Gibco)。 补 充 了 ITS+TM 培 养 基 添 加 剂 (5mls/500mls) 和 地 塞 米 松 (0.1μM) 的 Chee’ s 培 养 基。 Percoll(Pharmacia) 用 10XDulbecco’ s 磷酸盐缓冲液以 9 ∶ 1 稀释。
冷藏实验
用于冷藏方法的肝脏来自尸体供体， 年幼的如胎儿肝脏 ( 妊娠期 12 周至 25 周 )， 年 老 的 如 77 岁。 新 的 冷 藏 缓 冲 液 使 用 如 下 ； 补 充 2 ％ 人 血 清 (Gibco) 或 胎 牛 血 清 (Biowhittaker)， 专用于成熟实质细胞的 10 ％冷冻保护剂二甲基亚砜 (Sigma 目录 号 #D5879 或 D8779) 或 用 于 祖 细 胞 的 二 甲 基 亚 砜 或 甘 油 (Sigma 目 录 号 #G6279) 的 Viaspan(Dupont 目录号 #1000-46-06)。缓冲液还添加了抗生素 ( 青霉素 200U/ml ； 链霉素 100μg/ml)。缓冲液还补充了激素和生长因子 ： 胰岛素 (5μg/ml)， 转铁蛋白 (5μg/ml)， 表皮生长因子 (50μg/ml)， FGF(10ng/ml)， IGF II(10ng/ml)。缓冲液还添加了与牛血清 白蛋白 (BSA) 或人血清白蛋白 (HSA) 结合的脂类 ： 游离脂肪酸 (7.6μM) 和高密度脂蛋白 (10μg/ml)。缓冲液还进一步添加了微量元素 ( 硒 (10-9M)， 铜 (10-7M)， 锌 (5X10-11M) 和抗 氧化剂， AEOL 10112( 一种专卖抗氧化剂， porphorin 是过氧化物歧化酶模拟物， 以 10μg/
ml 使用 )， 它是一种由 Incara 的子公司 AEOLUS 制备的产品。
在本文所述的组合物中的改变是将鉴定为肝脏细胞特制的无血清激素限定的培 养基的组成部分的主要营养成分， 脂类， 激素和生长因子组合起来。新缓冲液导致 F4 馏分 中肝脏细胞的活力从低到大约 10％或更低 ( 在死后大约 30 小时的上限时间收集的状态极 差的样品 ) 到高达 80％ ( 在接近 1 小时或以上的早期时间期间收集的好样品 )。F1-F3 馏 分的活力稳定在 40％以上， 该事实支持这些馏分显具有倍性状态和代谢活力更有益于合成 细胞外基质成分和 / 或为活力和生长所需的其它细胞因子的 “幼年” 细胞 ； 因此它们很可能 更易于冷冻。在缓冲液中使用过氧化物歧化酶模拟物将细胞的活力提高了 5-10％。
上述组合物的另一选择是使用一种改良的缓冲液， 其中去掉 Viaspan 且在基础 培养基 ( 例如 RPMI 1640) 中补充胰岛素 (5μg/ml)， 转铁蛋白 (5μg/ml)， 与 BSA 结合的 -9 游离脂肪酸 (7.6μM)， 高密度脂蛋白 (10μg/ml)， 微量元素 [ 硒 (10 M)， 铜 (10-7M)， 锌 -11 (5X10 M)]， 和 AEOL 10112。 以诸如与层粘连蛋白混合的 IV 型胶原蛋白或与纤连蛋白混合 的 III 型胶原蛋白的细胞外基质的形式包裹细胞。
按上述处理的胎儿 “尸体” 肝脏细胞悬浮于冷藏缓冲液 ( 上述 ) 中， 以 5-10X108 个 细胞 /ml 等分进 3ml 的冷冻小瓶中并在该条件下维持 1-2 小时。然后使用计算机控制速率 的冷冻库 (Forma Cryomed) 将细胞冷冻到 -160℃的液氮温度， 然后贮存在大型蒸发相的液 氮 (-160℃ ) 贮存罐中。 细胞在该过程中存活良好且在 50-270 天的贮存期间不出现明显的 活力损失 ( 见图 4)。
处理和冷冻后 F4 馏分活力的最大范围随着实验室 “夹紧时间” 和接受样品之间的 时间长度的改变而改变， 也随着肝脏状态 ( 纤维变性， 局部缺血等 ) 的不同而改变。一般来 说， F4 馏分对肝脏的处理变化和组织的一般健康状况最敏感。明显的是， F2 和 F3 馏分通常 是有活力的且容易冷冻保存， 即使它从状况较差的肝脏样品获得。 F1 馏分是更易变的， 它含 有大量碎片， 脂肪小滴以及包括小实质细胞 ( 假定包括肝祖细胞 ) 和各种造血亚群体 ( 即， 红细胞 ) 的许多小细胞。
表 9. 冷藏 ： 胎儿肝脏
处理后的平均活力 ： 75-85％
处理后的平均活力 ： 相当于处理后。
表 10. 冷藏 ： 成人肝脏
活力 ( 冷冻后 )
F1-F3 ： ＞ 75％， 具有较好的贴壁能力
F4 ： ＜ 60％具有较差的贴壁能力
流式细胞术
下面的分选方法是任选的。细胞以单个排列通过流动室， 在其中细胞暴露于激光 中。通过 “前向散射” ， 或者由于光束交错折射的光量来测定各细胞的近似体积。散射光， 即来自诸如细胞核， 内质网高尔基体， 囊泡等的细胞内结构的 “侧向散射” 用于测定细胞内 复杂性的量 ( 即， 活细胞和更成熟的细胞含有比静息细胞或年幼细胞更多的细胞内组分 )。 通过高度特异性， 特征性抗原与细胞表面上的蛋白质复合物的结合获得更多关于细胞特征 的选择性信息。这些抗体可共价结合到荧光分子上， 例如， 异硫氰酸荧光素 (FITC)， 藻红蛋 白 (PE)， 和 PE 的串连偶合物和细胞色素， 它们被激光束激发， 各荧光团以特定的波长产生发射光。通过选择一组与特定的抗体偶连的区别性发色团， 可选择感兴趣的细胞群体。
根据其参数输入分析细胞。使用各种收集装置以每秒达到 40,000 次或更高的速 度收集所需细胞， 包括使用 Eppendorf 管和锥形管， 和任意大小的多孔板。
表 11. 染色程序中使用的抗体和试剂
抗体 供应商， Cat#， Lot#
山羊抗人 AFP Chemicon， AB635， C4P168
单克隆小鼠抗人 Thy Chemicon， MAB1294， 293OCD
单克隆小鼠抗人
AFP-PE 偶连物 Chromaprobe， P41020， A45P7
生物素标记的兔抗山羊 Vector Laboratories， BA-5000， J0313
生物素标记的兔抗山羊， Jackson Immunochemicals 200-152-096， 25985
链霉抗生物素蛋白 /AMCA 偶连物， Jackson Immunochemicals， 016-150-084， 40001
驴抗绵羊 AMCA 偶连物， Jackson Immunochemicals， 713-156-4732202
驴抗山羊 CY5 偶连物， Jackson Immunochemicals， 705-156-147， 38756
山羊 IgG， Jackson Immunochemicals， 005-000-002， 38837
绵羊 IgG， Jackson Immunochemicals， 013-000-002， 39945
绵羊抗人白蛋白， Serotec， ABP102， 210498
小鼠单克隆抗人 ：
CD14/TriColor 偶连物 Pharmingen
ICAM Pharmingen
CD34/FITC 偶连物 Pharmingen 34374X
CD38/PE 偶连物 Pharmingen 31015X
CD38/FITC 偶连物 Pharmingen 31014X
血型糖蛋白 A PE 偶连物 Pharmingen 32591A
CD 45/PE 偶连物 Pharmingen 31255X
CD 45/FITC 偶连物 Pharmingen 31254X
同种型对照 IgG1 PE Pharmingen 33815X
IgG2 FITC Pharmingen 33814X
Kit RE 偶连物 Caltag MHCK04
兔抗人 AFP-FITC 偶连物 Accurate
未偶连的山羊抗人 AFP ″ AXL625 061
7 氨基放线菌素 D(7AAD)Mol Probes A-1310， 4981-1
在用于流式细胞术的细胞制品中使用的主要溶液 ：
BSA ： 牛血清白蛋白 (Pentex V)
PBS ＝磷酸盐缓冲液 ；
FBS ＝胎牛血清 ；
AFP ＝甲胎蛋白
含激素的 Dulbecco’ s 改良的 Eagles 培养基 ： HC_DMEM500mL DMEM， 高葡萄糖无酚红
25mL 胎牛血清 (FBS)
20mL 5mM EGTA
胰岛素 (5μg/ml)， 转铁蛋白 (5μg/ml) -9
微量元素 [ 硒 (10 M)， 铜 (10-7M)， 锌 (5X10-11M)]
抗生素 ( 青霉素 -100μg/ml， 链霉素 -100μg/ml)
500mg 牛血清白蛋白 (BSA)30mg DNase
38μl 与 BSA 结合的游离脂肪酸溶液。
通过带 0.2μm 孔的 Nalgene 过滤器过滤灭菌。
Hanks 缓冲盐溶液 - 改良型 ： HBSS-mod
50mL 10X HBSS
10mL 1M Hepes
青霉素 -100μg/ml/ 链霉素 -100μg/ml
500mg BSA
30mg DNase
定容到 400mL
pH 调到 7.3
最终定容到 500mL
0.2μm 的无菌过滤
用于免疫化学的封闭缓冲液
100ml 的 HBSS_mod
2.2mL 45％硬骨鱼胶和
0.8BSA
0.5mL 1％皂苷溶于 HBSS
用于免疫荧光显微镜的固定介质
0.5mL2X PBS
0.25g n- 丙基没食子酸
5.7g 甘油
冷冻肝脏组织制品用于流式细胞术的方法
在 37℃下迅速复苏冷冻的肝脏组织。 用 HC-DMEM 在冰上以每分钟 1ML 的速度将各 6 肝脏的冷冻小瓶 ( 各含大约 3mL 的含 5-10X10 个细胞 /mL 的缓冲液 ) 定容到 10mL。然后 在 4℃下将样品以 1200RPM 离心 5 分钟。弃去上清， 细胞沉淀重悬于 5mL HC-DMEM 中。反复 洗涤细胞直到上清清澈。 然后计数细胞并使用锥虫蓝染料排斥试验以血细胞计数器评估活 力。按照实验方案将细胞分成多份。制备标准管用作含 1-2X106 个细胞之间的对照数据， 通常通过从 5 ～ 10X106/mL 的细胞悬液中各取 200μl 实现。需要下列标准管 ：
1)OCS. 由未染色的对照细胞组成的原始细胞悬液。
2) 单独的 FITC 用于补偿调节。 将 5μL FITC- 标记的抗血型糖蛋白 A 加入 200μl 细胞悬液中。另一选择是将 FITC- 标记的 CD34， CD38 和 CD45 各 7μl 加入 200μl 细胞中 的混合物。3) 单独的 PE 用于补偿调节。使用血型糖蛋白 -PE(2μl 到 1mL 的 HC-DMEM 且将其 30μL 加入 200μL 细胞中 )。
4) 单独的 7AAD 用于补偿。通过用 2 ％低聚甲醛固定 200μL 细胞悬液并然后将 5μl 的 100μM 7AAD 和 5μL 去污剂 (1％皂苷 ) 加入在 HBSS-mod 中的 1mL 这些细胞悬液 中可产生良好的信号。7AAD 强烈染色透化处理的细胞。
5) 单独的 Cy5 用于补偿。 200μL 固定的细胞 (2％低聚甲醛 ) 在 2％山羊血清中培 养 40 分钟以便用绵羊 IgG 标记细胞表面。 然后将细胞用 Cy5 偶连的驴抗山羊 IgG(1 ∶ 800) 培养 40 分钟。
6) 单独的 AMCA 用于补偿。 与 7AAD 一样， 产生人工强信号用于补偿调节。 将 200μL 固定细胞 (2％低聚甲醛 ) 在 2％绵羊血清中培养 40 分钟以便用绵羊 IgG 标记细胞表面。 然 后将细胞用 AMCA 偶连的驴抗绵羊 IgG(1 ∶ 800) 培养 90 分钟。
7)AMCA/Cy5 对照。用 AMCA- 偶连的驴抗绵羊 IgG 和 Cy5 偶连的驴抗山羊 IgG 培养 固定 (2％低聚甲醛 ) 和透化处理 (0.05％皂苷 ) 的细胞 90 分钟。
8) 单克隆同种型对照。用小鼠 IgG1 PE 偶连物和小鼠 IgG2 FITC 偶连物培养细 胞。浓度应与用于标记分析和分选管的浓度匹配。
9) 细胞内同种型对照。用未免疫的绵羊 IgG 和山羊 IgG 培养固定 (2％低聚甲醛 ) 和透化处理 (0.05％皂苷 ) 的细胞 90 分钟作为用于鉴定白蛋白和甲胎蛋白的抗体的对照。 用 Cy5 偶连的驴抗山羊 IgG 和 AMCA- 偶连的驴抗绵羊 IgG 继续培养 90 分钟。
制备分选管用于获得表达特定组合的 CD 标记的选定细胞群体。正常情况下这些 管含有 50-70X106 个细胞。将细胞重悬于 1mL 含有 HC_DMEM+1％ BSA+500pM 7AAD(5μL 的 100μM 贮液 ) 的染色缓冲液中。根据细胞数将各 15 到 25μL 之间的 CD 34FITC， CD38 PE， 6 或 CD 45 PE 加入染色缓冲液中 ( 正常情况下每 10X10 个细胞 3μL 的 Pharmingen 抗体 )。 以 1 ∶ 60 的稀释度加入抗 c-Kit 抗体， 血型糖蛋白 A 以 1 ∶ 500 的稀释度使用。在黑暗中 在冰上染色 40 分钟。染色后用 HBSS-mod 洗涤细胞两次并用在 PBS 中的 2％低聚甲醛在冰 上固定 30 分钟。
细胞内染色用于细胞分选
为了进行细胞的细胞内染色用于以流式细胞术分析甲胎蛋白 (AFP)， 将细胞悬液 用在 HBSS_mod 中的皂苷 (Sigma S4521)0.05％的溶液在冰上透化处理 10 分钟。然后将细 胞在含有 1％硬骨鱼胶和 0.8％ BS 和 0.005％皂苷的 HBSS_mod 溶液中封闭 20 分钟， 接着用 山羊抗人 AFP 和绵羊抗人白蛋白 ( 均在封闭缓冲液中以 1 ∶ 800 稀释 ) 在黑暗中在室温下 培养 90 分钟。细胞用含有 0.01％皂苷的 HBSS_mod 洗涤两次， 接着用 Cy5- 偶连的驴抗山羊 IgG 和 AMCA- 偶连的驴抗绵羊 IgG 培养 90 分钟。
另一选择是， 在第一抗体之后， 细胞用生物素标记的兔抗山羊 IgG( 在含有 2％人 血清和 0.01％皂苷的封闭缓冲液中 1 ∶ 500 稀释， 在黑暗中室温下培养 90 分钟 ) 培养。接 着用含有 0.01％皂苷的 HBSS_mod 洗涤两次， 然后用在 0.01％皂苷 /HBSS_mod 中的 9μg/mL 链霉抗生物素蛋白 /Cy5 偶连物黑暗中室温下培养 90 分钟。最后， 细胞用 HBSS_mod 洗涤两 次并重悬于 HBSS_mod 中， 通过 50μm 的筛子过滤以去掉细胞团块用于在流式细胞器上分析 和分选。
如果打算选择肝祖细胞， 免疫选择包括去掉是多倍体和 / 或表达与肝脏成熟造血细胞相关的诸如红血细胞上的血型糖蛋白 A 的标记的细胞。另外展示出在所有成熟造血细 胞上表达的 CD45 的细胞 ； 展示出与成熟肝细胞相关的诸如在所有肝细胞和胆细胞中发现 的连接蛋白 32 的标记的细胞 ； 和表达与成熟间充质细胞相关的诸如在肝星形细胞中的视 网膜样蛋白 (retinoids) 或冯 . 维勒布兰德氏因子或内皮中的因子 8 的标记的细胞都被去 掉。
分选的细胞群体的免疫组织化学染色
流式细胞器分析和分选后染色细胞的甲胎蛋白。 在含有 1％ BSA 的 0.3％ HBSS-mod 中收集分选的细胞馏分。回到实验室时， 调节所收集的样品的体积以提供 0.5X106 个细胞 /mL 且用 Shandon 细胞旋转 (Cytospin) 器将 200μL 等分试样旋转到显微镜玻片上。细胞 旋转玻片标本空气干燥并贮存用于后来染色甲胎蛋白和 / 或白蛋白。用橡皮障圈住显微镜 玻片上的附着细胞 “盘” 以产生一个 “井” 用于使用免疫组织化学试剂。玻片在含有 0.3％ Triton X 的 tris 缓冲液 (“低盐” 的含 0.9％ NaCl 的 10mM Tris， pH7.4) 中浸泡 10 分钟， 接着在单独的低盐 Tris 中浸泡 10 分钟。
然后细胞在上述含 10％兔血清的硬骨鱼胶封闭溶液中室温下封闭 90 分钟。在低 盐 Tris 中洗涤两次后， 细胞用在含有 2％兔血清的封闭缓冲液中以 1 ∶ 100 稀释的山羊抗 人 AFP 抗体 4℃下培养过夜。在 Tris 缓冲液中洗涤两次后， 接着用在封闭缓冲液中的生物 素标记的兔抗山羊 IgG(1 ∶ 200) 室温下培养 90 分钟。用链霉抗生物素蛋白 /AMCA 复合物 ( 以 9μg/mL 存在于低盐 Tris 缓冲液中 ) 的最终培养用于通过 AMCA 荧光染料与生物素标 记的兔抗体的结合定位 AFP- 样免疫反应。用 Tris 缓冲液洗涤两次后， 使得细胞制品接近 干燥， 之后在抗褪色封固培养基 (0.25g n- 丙基没食子酸在含 1mL PBS 的 5.7g 甘油中 ) 上 盖上盖玻片。当复染合适细胞的白蛋白时， 使用包括德克萨斯红偶连的兔抗人抗白蛋白抗 体与第一抗甲胎蛋白抗体。
通过删去第一或第二抗体制备对照玻片以证实在没有抗甲胎蛋白的抗体或生物 素标记的第二抗体时细胞没有 AMCA 标记。使用紫外激发发射蓝光 (450nm) 区光的 AMCA 染 料用表面荧光显微镜术检查玻片。
借助于细胞和 / 或基因治疗的肝脏再生
本发明具有治疗诸如下列疾病的直接实践应用 ： 克 - 纳二氏综合征， 杜-约 (Dubin-Johnson) 综合征， 酪氨酸血症， 肝硬化， 纤维变性， 脂肪肝， 肝炎， 急性肝脏衰竭， 慢 性肝脏衰竭， 肝胆管炎， 肝软化， 肝大， 肝癌， 肝胚细胞瘤， 或其组合。 本实施例的其它肝脏疾 病和肝脏疾病的其它相关例子同样适合作为本疗法的候选者且包括阿拉惹综合征， 酒精肝 疾病， α-1- 抗胰蛋白酶缺陷， 自身免疫肝炎， 巴德 - 希阿里综含征， 胆闭锁， Byler 疾病， 诸 半乳糖血症， 吉尔伯综合征， 糖原存储疾病， 如肝外胆管癌和肝细胞癌的癌症， Caroli 疾病， 血管瘤， 血色病， 甲型肝炎， 乙型肝炎， 丙型肝炎， 戊型肝炎， 庚型肝炎， 肝脏移植， 迟发性皮 肤血卟啉病， 原发性胆肝硬化， 原卟啉症， 红细胞肝病， 罗托综合征， 硬化胆管炎， 和肝豆状 核变性。肝脏的先天性遗传疾病也是可矫正的。例如， 遗传性疾病苯丙酮酸尿 (PKU) 由婴 儿不能使用氨基酸苯丙氨酸引起。如果早期不治疗， PKU 会导致大脑和神经损伤和智力迟 钝。在生命的前几周开始特别低蛋白的饮食是目前唯一可能的治疗方法。可适用这种形式 的疗法的其它靶基因及其相关肝脏疾病的例子包括， 但不限于， 家族性高胆固醇血症中的 LDL 受体基因， 血友病中的因子 VIII 和 IX 的凝血因子基因， 肺气肿中的 α-1- 抗胰蛋白酶基因， 苯丙酮酸尿中的苯丙氨酸羟化酶基因， 血氨过多中的鸟氨酸转氨甲酰酶基因， 和在各 种补体缺陷形式中的补体蛋白基因。
由于人尿激酶纤溶酶原激活剂 (uPA) 可激活跨种的纤溶酶原， 因此为了诱导肝脏 再生可构建从 RSV-LTR 启动子表达人尿激酶的重组腺病毒载体 Ad-RSV-uPA。仅仅以例证 的方式选择了该基因， 因为包括但不限于下列基因的任何其它目的基因同样是合适的 ： 甲 氨酰合成酶 I， 鸟氨酸转氨甲酰酶， 精氨琥珀酸合成酶， 精氨琥珀酸裂解酶， 精氨酸酶， 延胡 索酰乙酰乙酸水解酶， 苯丙氨酸羟化酶， α-1- 抗胰蛋白酶， 葡萄糖 -6- 磷酸酶， 低密度脂蛋 白受体， 胆色素原脱氨酶， 因子 VIII， 因子 IX， 胱硫醚 β- 合成酶， 支链酮酸脱羧酶， 白蛋白， 异戊酰 -CoA 脱氢酶， 丙酰 CoA 羧化酶， 甲基丙二酰 CoA 变位酶， 戊二酰 CoA 脱氢酶， 胰岛素， 转铁蛋白， β- 葡萄糖苷酶， 丙酮酸羧化酶， 肝脏磷酸化酶， 磷酸化酶激酶， 甘氨酸脱羧酶， H- 蛋白， T- 蛋白， Menkes 疾病蛋白， 或肝豆状核变性基因 pWD 的产物， 和 / 或 CFTR。
为了构建和产生重组腺病毒载体， 按如下方法制备人 uPA 的 cDNA。将含有该蛋 白质编码序列的 L.326 kb HindIII/Asp718 uPA 片断插入 pXCJL.1 中在 Rous 肉瘤病毒 LTR(RSV) 启动子转录控制下的且在牛生长激素多聚腺苷化信号上游的 HindIII/Asp718 位 点。本领域的技术人员可选择肝脏细胞特异性启动子， 例如乙肝启动子， 甲肝启动子， 丙肝 启动子， 白蛋白启动子， α-1- 抗胰蛋白酶启动子， 丙酮酸激酶启动子， 磷酸烯醇丙酮酸羧激 酶启动子， 转铁蛋白启动子， 运甲状腺素蛋白启动子， 甲胎蛋白启动子， α- 纤维蛋白原启动 子， 和 β- 纤维蛋白原启动子等许多其它合适的启动子。 在用 pJMI7 和命名为 Ad-RSV-uPA 的载体共转染后制备病毒。通过在 293 细胞中 扩增单个噬菌斑进行 Ad-RSV-uPA 的筛选。感染 3 天后以 ELISA 检测上清的免疫学反应性 uPA 和以纤维蛋白噬斑试验检测纤维蛋白裂解活性证实 Ad-RSVuPA 感染时产生 uPA 的催化 活性。纯化的病毒以等分试样贮存在 -80℃并在注射前用 HgDMEM 培养基立即稀释。通过 OD 测量和标准噬斑试验测定病毒滴度。 载体的构建基本上按美国专利号 5,980,886 所述进 行， 本文引用以供参考。病毒在 208F 细胞中滴定。
年龄为 5 至 6 周的 C57BL/6 雌性小鼠 (Jackson Laboratories， Bar Harbor， ME) 在无特定病原体的环境中圈养。从安乐死的小鼠获得各种时间期限的局部缺血肝脏样品 且按上文所述分离肝脏祖细胞。对于门静脉插管， 通过腹膜内施用 0.5ml 20mg/ml 的 2， 2， 2- 三溴乙醇麻醉受体小鼠。 做一个腹部中线切口并分离皮肤与腹膜以产生一个皮下袋。 打 开腹膜并暴露门静脉。 在门静脉中插入硅氧烷管 (0.02″ I.D.， 0.037″ 0.D.， S/P Medical Grade， Baxter， III.) 并用含肝素的盐水灌流。之后将插管穿过腹膜并用 4.0 丝缝合固定。 3cm 长的插管在末端结扎并放在皮下以前产生的袋中。 在不早于 24 小时之后给小鼠提供病 毒感染的祖细胞。在一些小鼠中门静脉插管与 2/3 肝切除术一起进行。然后进行部分肝切 除术。为了灌流门静脉， 麻醉小鼠， 在已存在的腹部切口的邻近位置打开皮肤。暴露插管并 连接到注射器泵上。为了进行病毒灌注， 将在 DMEM 中的腺病毒制品在 5 到 10 分钟内通过 插管注射进门静脉。为达到细胞治疗的目的， 可使用任何细胞群体作为自体或同种异体材 料并移植进诸如本实施例的情况的患者的特定靶器官或其附近。 细胞可在任意合适的培养 基， 载体或稀释剂或包括微载体， 珠， 微粒体， 微球体， 囊泡等的任何类型的药物传递系统中 移植。
在腺病毒感染的肝祖细胞通过插管注射进门静脉后进行所有生物化学和组织学
分析。对 uPA 的 ELISA 试验以针对 uPA 的催化结构域和受体结合结构域的两个不同单克隆 抗体为基础。一个单克隆抗体用过氧化物酶标记。在临床病理学实验室中以常规自动方法 分析血清总蛋白和白蛋白。已知腺病毒灌注进 C57BI/6 小鼠的门静脉导致 100％的肝细胞 转导， 每个细胞有超过 1 拷贝的腺病霉 DNA。相同剂量的 Ad-RSV-uPA 导致 90％的死亡率， 至少部分与出血相关。当使用较低剂量的 Ad-RSV-uPA 时， 死亡率不超过 5％且选择该剂量 用于肝脏再生实验。 灌注 Ad-RSV-uPA 导致血清尿激酶瞬时升高， 在 4 天后达到大约 350ng/ ml 的峰值 ( 比内源性水平高 70 到 100 倍 )， 到第 12 天下降到背景浓度。uPA 的升高也与血 清 SGPT 浓度的升高相关。 在腺病毒灌注后不同的时间时， 用 3H- 胸苷灌注动物， 并测定掺入 肝脏 DNA 的放射性量作为定量细胞增殖的方法。用 AdRSV-uPA 处理的动物胸苷摄入的增加 时期在第 3 天开始且持续 8 天。因此， 用 Ad-RSV-uPA/ 卵形细胞处理时肝脏 3H- 胸苷摄入 的时期比用只有部分肝切除术获得的长得多。阴性对照腺病毒的受体显示出在第 4 天达到 肝脏 3H- 胸苷摄入峰值， 其在 24 小时后回到基线水平且在第 11 天 3H- 胸苷摄入增加最小。 总之， 通过 SGPT 水平测量肝脏反应且 3H- 胸苷摄入的高速率归功于肝内尿激酶生产表明发 生了明显的肝脏生物合成性再生。无 uPA 灌注的肝祖细胞比无 uPA 插入的腺病毒更好。
用重组腺病毒 / 来自无心跳的尸体供体的祖细胞处理的动物的显微镜组织学发 现表明到第 3 天， 处理的小鼠具有含有巨噬细胞和嗜中性白细胞的中度炎症性浸润， 肝细 胞中的退化改变包括空泡形成， 致密且较少有丝分裂的细胞核。施用 Ad-RSV-uPA/ 卵形细 胞 8 至 10 天后， 有肝脏恢复的证据， 包括存在多病灶再生， 异源性大小的细胞核和大量减少 的炎症反应以及较少的退化肝细胞。到 3 至 4 周， 浸润消散且肝脏出现正常。
总之， 这些研究表明尿激酶表达与肝祖细胞结合诱导明显的肝脏实质细胞再生。
生物反应器
使用高效生物反应器 (HPBR) 培养从尸体供体分离的人肝细胞祖细胞。该方法 可提供大量细胞进一步用于医学目的或生物反应器， 该生物反应器自身可用作生物学上 有用的细胞分泌蛋白和因子的生产装置， 该因子可包括但不限于肝细胞生长因子 (HGF)， 胰岛素样生长因子 -I 和 II(IGF-I 和 II)， 表皮生长因子 (EGF)， a 型和 b 型转化生长因子 (TGF-α 和 TGF-β)， 神经生长因子 (NGF)， 成纤维细胞生长因子 (FGF)， 血小板衍生生长因 子 (PDGF)， 肉瘤生长因子 (SGF)， 粒细胞巨噬细胞集落刺激生长因子 (GM-CSF)， 血管内皮生 长因子 (VEGF)， 催乳激素和生长激素释放因子 (GHRF) 和各种造血生长因子， 例如白介素 (IL)IL-1， IL2， IL-3， IL-4， IL-5， IL-6， IL-7， IL-8， IL-10， IL-11， 等， 红细胞分化因子 (EDF) 或促卵泡激素释放蛋白 (FRP)， 抑制素， 干细胞增殖因子 (SCPF) 及这些蛋白质的活性片断， 亚基， 衍生物和其组合等本领域已知的许多其它因子。 一般来说， 本文所用的这些细胞因子 是指选自细胞因子， 淋巴因子， 白介素， 集落刺激因子， 激素， 趋化因子， 抗趋化因子， 凝血因 子， 溶栓蛋白， 补体蛋白， 酶， 免疫球蛋白和抗原的分泌蛋白。在该生物学活性蛋白中， 本领 域的技术人员可选择因子 VIII， 因子 IX， 因子 VII， 红细胞生成素， α-1- 抗胰蛋白酶， 降钙 素， 生长激素， 胰岛素， 低密度脂蛋白， 载脂蛋白 E， IL-2 受体和其拮抗剂， 过氧化物歧化酶， 免疫反应修饰剂， 甲状旁腺激素， 干扰素 (IFNα， β， 或 γ)， 神经生长因子， 葡糖脑苷脂酶， 集落刺激因子， 白介素 (IL)1 至 15， 粒细胞集落刺激因子 (G-CSF)， 粒细胞， 巨噬细胞集落刺 激因子 (GM-CSF)， 巨噬细胞集落刺激因子 (M-CSF)， 成纤维细胞生长因子 (FGF)， 血小板产 生的生长因子 (PDGF)， 腺苷脱氨酶， 胰岛素样生长因子 (IGF-1 和 IGF-2)， 巨核细胞启动配体 MPL， 血小板生成素， 或其组合。
不局限于在生物反应器中生长细胞的该具体方案， 在本领域的方法中其它已知的 方案是同样合适的且可容易地从公开的美国专利号 6,001,585 ； 5,998,184 ； 5,846,817 ； 5,622,857 ； 5,571,720 ； 5,563,068 ； 5,512,474 ； 5,443,985 ； 5,342,781 ； 5,330,915 ； 5,320,963 ； 5,202,254 ； 4,833,083 ； 和 4,760,028 中采用， 本文引用以供参考。
本装置含有 450 10kD 的纤维素纤维和 540 聚丙烯纤维， 其它参数的详情参见， 例如美国专利号 5,622,857， 本文引用以供参考。按上述分离细胞。所有必须材料从 Sigma Chemical Co. 或者 LifeTechnologies 获得。长期培养基的附着培养基如下 ： RPMI 1640(500mL) ； 50mL(10％ )FBS ； 4mM L- 谷酰胺 ； 1x 青霉素 / 链霉素 ； 庆大霉素 ； 15mM HEPES ； 10mU/mL 胰岛素 ； 10mU/mL 转铁蛋白 ； 硒； 在使用附着培养基前用培养基冲洗 HPBr 系统 1 天。 将 500mg 预先膨胀的 Cytodex 3 微载体接种到 HPBr 的内部环形空间。 充氧器纤维作为微载 体的支架且防止它们分布在整个 ECS 中。将活的人肝细胞祖细胞也接种进内部环形空间， 用手摇动和旋转装置以实现细胞与微载体的均匀混合。假定肝细胞直径在 10-20μm 之间， 细胞与微载体的接种量比率为大约 500。 细胞和微载体的表观粘稠度迅速增加， 表明细胞与 微载体和细胞与细胞的附着正迅速且正常地进行着。在该混合 2-3 分钟内， 在内部环形空 间形成细胞与微载体的离散型凝胶。在附着培养基中 37℃下培养 ( 以静止状态 ) 过夜后， 将培养基换成长期培养基 (2L)。不以任何方式局限于这些体积， 因为本领域的技术人员可 容易地按比例确定生产以达到所需水平。 肝细胞培养 5 周， 每周给系统更换新鲜培养基。 通 过每天检测样品监测细胞的代谢功能。5 周后， 通过下列程序获得大于 90％的活细胞和载 体回收率 ： 使用与 0.44mL(0.23M)EDTA 混合的在 PBS 中的 0.1％胶原酶冲洗培养的 ECS 和 HPBr10 分钟 ； 用注射筒的无菌空气排出 ECS 的内含物 ； 用长期培养基重复该过程且洗涤和 分离所收集的材料。
HPBr 同样适合于细胞的培养和遗传转化 ( 例如， HGF 基因表达 )。下面是用于固 着依赖型细胞 ( 例如， SW 480 P3 ； ATDC#CCL228) 的遗传无病毒方案。该方案可由本领域 的技术人员从使用培养孔和培养皿的公开方法适当改良和优化。在 HPBr 中优选具有 10kD 性质的培养纤维。按上文所述以几乎相同的方式操作该生物反应器。Cytodex 1 微载体 (Pharmacia， Sigma Chemical Co. 销售 ) 广泛用于培养固着依赖型细胞。可将大范围的细 胞密度接种进 HPBr 的 ECS 中， 密度范围为 ： 按需要从 1x104 到 1x1011 个细胞或更高。推荐 的细胞与微载体的接种量比率是大约 10 的范围， 尽管本领域的技术人员可按需要进行修 改。在整个实验过程中以大约 10cpm( 或更大 ) 轻轻旋转该装置。培养细胞大约 1 天 ( 或 者更长， 取决于具体细胞 ) 后， 达到最佳汇合以获得有效转染。可调节细胞与微载体接种量 的比率以明确影响为治疗和经济效率进行的时间设计。在转染的当天， 制备 DNA 质粒溶液 ( 例如， pCMV) 和阳离子脂类溶液 ( 例如， LIPOFECTIN 试剂， LifeTechnologies)。这些试剂 必须是无血清的， 即使总体过程需要存在血清。混合合适量的 DNA 和脂类溶液， 然后将混合 物注射进装置的 ECS 中。转染大约几个 ( 和甚至好几个 ) 小时后， 如果合适， 可恢复使用血 清， 且继续按以前培养大约几天。当扩增永久转化的细胞时可使用更长的时间。按与前面 所述相似的方式收获细胞。
人造肝脏
作为上面实施例的延伸， 本领域的技术人员可容易地采用该生物反应器作为体外肝脏支持系统。异种移植 ( 种间器官移植 ) 通过使用动物器官可帮助缓解供体肝脏矩缺。 然而将动物器官移植进人类的潜在危险是感染供体动物的病毒可能会感染受体。 由于器官 移植受体可能服用药物以抑制免疫系统和防止器官排斥， 因此他们不能抵抗感染的动物病 毒。另外， 动物病毒可在感染的宿主中变异成可感染具有正常免疫系统的人类的形式。结 果， 可能产生一种新的致病性人类病毒。体外肝脏支持系统可克服这些缺点。用于人类器 官移植的优选动物种类是猪和灵长类。然而， 很明显如果可获得以人细胞为基础的人造肝 脏， 它会优于动物肝脏。
在培养所需时间后， 获得来自尸体肝脏祖细胞的成熟肝细胞。 按常规获得 20 至 50 亿个高 ( 超过 80％ ) 活力的细胞。一般来说， 使用的培养基是补充了激素的 Waymouth 培养 基。为了供应 20 到 50 亿个细胞， 生物反应器按比例扩充到两个节制容器， 每个具有 40mm 的内部直径和 100mm 的高度。在该具体情况下每个节制容器使用直径大约 2mm 且总体积 250ml 的玻璃珠。以 360ml/ 分钟的循环速率供应培养基。以稳定的耗氧率证实肝细胞的高 活力。 然后将该生物反应器固着在由于全部肝脏衰竭而通过手术去掉了肝脏的无肝脏的人 类受体上。另外， 可以不去掉肝脏， 但该生物反应器会帮助机能障碍的肝脏更好地恢复。
本领域的技术人员会知道作为体外肝脏支持系统的生物反应器的固着方法或者 会知道本领域已如的替代方法， 例如在美国专利号 6,008,049 ； 5,981,211 ； 5,976,870 ； 5,891,713 ； 5,827,729 ； 5,643,794 ； 5,622,857 ； 5,605,835 ； 和 5,270,192 中所述， 本文分 别引用其各自的全文以供参考。 根据这些参考文献很明显供体人造肝脏的细胞不必局限于 人类， 该细胞的跨种使用现在是可能的。 例如， 来自猪或灵长类的肝脏细胞同样适合于人类 使用。
将来自左股动脉的血液导入 Minntech 血浓缩器中。将 12fringeelecath 插管插 入股动脉中并以 1/4″ PVC 管道连接到血浓缩器上。血浓缩器将血液分成无细胞的超滤液 部分和血细胞部分。血细胞部分通过相似的管道返回股静脉。超滤液通过 1/4 ″ PVC 管 道流出血浓缩器并使用滚动泵调到 40ml/ 分钟的流速进入肝细胞生物反应器系统。灌流 通过生物反应器后， 超滤液经过左颈静脉返回病人。为了证实体外肝脏代谢的提供， 在生 物反应器的入口向超滤液中施加已知被肝脏代谢的两种不同化学品 7- 乙氧基香豆素和 利多卡因。在超滤液返回病人前在生物反应器的出口测量各自的代谢物， 7-OH- 香豆素和 monoethylglycinexylidide(MEGX)。 观察到 7- 乙氧基香豆素和利多卡因都被明显代谢。 因 此该结果证实使用生物反应器作为支持系统可提供体外肝脏代谢。 分离血细胞与血浆使受 体对外源性肝细胞的免疫学反应最小化。 因此， 来自人类供体的肝细胞， 如在我们的例子中 从尸体获得的肝脏细胞和诸如猪的非人来源可用于生物反应器以提供体外肝脏支持。
非肝脏细胞的尸体祖细胞
本发明还涉及从非肝脏的组织获得富含祖细胞的细胞群体的方法。 该组织的例子 包括但不限于肾上腺， 血管， 骨髓， 角膜， 胰岛， 胆管， 晶状体， 肺， 肾， 心脏， 肠， 卵巢， 胰腺， 甲 状旁腺， 松果体， 脑垂体， 皮肤， 睾丸， 膀胱， 脑， 脊髓， 胸腺， 或甲状腺。
提供了下列实施例作为一般性策略， 可根据具体需要对其进行修改而不改变本发 明的范围和实质。在一个举例性的实施方案中， 提供受试者祖细胞用于患有任何胰岛素缺 陷疾病的病人。
在这些研究中使用了胎儿和非胎儿尸体。放血后， 原位鉴定总胆管 (CBD)， 取出并放入 Dulbecco’ s 改良的 Eagles 培养基 (DMEM) 溶液中。然后通过用镊子解剖取出相连的 胰腺腺泡和胰岛出口以及附着的血管。然后将 CBD， 与其相连的分支， 主要胰腺管一起横切 成大约 300μm 长的微器官外植块或逐个分散的单细胞。然后将这些样品在添加了生长因 子， 含有或不含 1 型胶原蛋白或基质胶作为生长底物的 DMEM 中培养。通过响应细胞将溴化 脱氧尿苷 (BrdU) 掺入 DNA 来判断生长因子刺激增生的效力。使用抗 BrdU 的抗体来观察和 鉴定短期反应 (24-48 小时 )。通过作为特定生长因子添加的结果这些细胞群体在细胞培 养基中生长和增殖的能力来判断长期反应。以 1ng/ml， 10ng/ml 和 100ng/ml 的浓度使用三 种不同的生长因子 (EGF， TGF-α， 和 bFGF) 来区分祖细胞。通过 BrdU 标记评估到的增殖激 活在施用 10ng/ml 生长因子 EGF 时在 24 小时的时间长度内出现。在 10 和 100ng/ml 剂量 之间没有观察到区别。向 CBD 组织外植块中加入 EGF 导致不同细胞的增殖和这些细胞的聚 簇。初步的长期生长实验表明 CBD 尸体组织内确实存在较大的增殖潜力且可在培养基中维 持至少 21 天。
用于治疗肝脏疾病的祖细胞
d- 半乳糖胺是一种能诱导相似于人类病毒性肝炎损害的损伤的化合物并用于诱 导肝炎模型。 四氯化碳通过肝脏细胞中药物代谢酶系统的作用产生具有极高反应性的游离 基团， 且这些游离基团通过与肝脏细胞膜蛋白结合强烈抑制细胞活性或可引起细胞器膜脂 类的过氧化作用， 从而导致肝脏细胞的坏死和肝脏脂肪的累积。 因此， 这些化合物广泛用作 急性药物诱导的诸如脂肪肝， 慢性肝炎和肝硬化的人类肝炎的试验模型。
因此， 在本实施例中， 本发明人按照美国专利号 4,898,890( 本文引用以供参考 ) 中详细报道的方法进行了试验以证实根据本发明的尸体祖细胞的效力。每千克体重 250mg 的 d- 半乳糖胺溶于每千克体重 5ml 的生理盐溶液中经过腹膜内注射各重 180 至 200g 的 Wistar 品系的雄性大鼠。通过以自动分析器测量谷氨酸 - 草酰乙酸转氨酶 (GOT)， 谷氨 酸 - 丙酮酸转氨酶 (GPT)， 和 ALP 来检查血液样品的血清。 除了安慰剂组中的大鼠用培养基 安慰剂溶液代替祖细胞悬液给药外， 以完全相同于将大约 1-5x104-107 个肝脏尸体祖细胞 直接施用到损伤肝脏的小组的方式处理诱导肝脏损伤的安慰剂对照组。 在另一系列的实验 中， 用四氯化碳代替来损伤大鼠肝脏。当与未损伤的对照组相比时诱导肝脏损伤的动物显 示出 GOT， GPT， 和 ALP 明显增加。当与未用肝祖细胞处理的诱导肝脏损伤的对照相比时， 用 祖细胞处理的大鼠证实 GOT， GPT， 和 ALP 的增加受到显著抑制。该结果表明祖细胞抑制或 甚至逆转且肯定防止 d- 半乳糖胺和四氯化碳诱导的肝脏损伤。
一个 11 岁的女孩患有肝脏疾病高胆红素血症， 引起一种由肝脏产生的物质胆红 素在其血液中过量积聚， 作为治疗， 她每天需要在紫外光下度过 12 至 15 小时， 一种称为光 线疗法的过程。将来自尸体供体的肝细胞直接移植进其肝脏 ( 门静脉 ) 后， 注意到其胆红 素水平显著下降， 尽管她仍然需要花费大约 4 到 6 小时进行光线疗法， 但她现在已起作用。
因此， 这种尸体肝祖细胞的应用可用于预防和治疗包括但不限于病毒性肝炎， 脂 肪肝， 慢性肝炎， 纤维变性和肝硬化的肝脏机能障碍和损伤。 另外很清楚本方法允许预防和 / 或治疗由诸如化学疗法， 或药物滥用， 或者酗酒的其它原因引起的肝脏代谢机能障碍和 / 或损伤。有许多药物和物质具有引起肝脏损伤的倾向， 它们包括但不限于止痛剂， 退热剂， 消炎药物， 和抗风湿病药物， 例如， 对乙酰氨基酚， 阿斯匹林， 保泰松， 舒林酸， 异丁芬酸， 金 化合物等。抗生素 ： 氨基苷类， 多肽， 头孢菌素， 青霉素， 四环素等。化疗剂 ： 磺胺药物， 异烟肼等。抗癌药 ： 丝裂霉素 C， 顺式铂氨， 6-MP， 亚硝基脲等。麻醉剂 ： 卤烷， 甲氧氟烷等。治疗 精神病药物 ： 氯丙嗪， 安定， 巴比妥等， 利尿剂 ： 噻嗪类等。
这些及其它有用的应用对本领域的技术人员是显而易见的。可预见的肝脏疾病 的具体例子包括但不限于阿拉惹综合征， 酒精肝疾病， α-1- 抗胰蛋白酶缺陷， 自身免疫 肝炎， 胆闭锁， 胆管缺乏， 骨髓衰竭， 巴德 - 希阿里综合征， Byler 疾病， 克 - 纳二氏综合征， Caroli 疾病， 胆汁郁积瘙痒症， 胆石病， 接合高胆红素血症， 慢性移植物与宿主疾病， 原因不 明性肝疾病， 糖尿病， 杜 - 约综合征， 红细胞肝性原卟啉症， 肝外胆管癌， 家族性高胆固醇血 症， 半乳糖血症， 吉尔伯综合征， 糖原存储疾病， 血管瘤， 血色病， 肝脑病， 肝胆管炎， 肝软化， 肝大， 肝癌， 肝胚细胞瘤， 遗传性血色病， 黄胆， 肝内胆汁郁积， 肝囊肿， 肝移植， 与 Bacillus cereus 相关的肝衰竭， 混合型冷球蛋白血症， 鸟氨酸转氨甲酰基酶缺陷， 紫癜肝病， 迟发性 皮肤血卟啉病， 原发性胆肝硬化， 顽固性腹水， 罗托综合征， 肉样瘤病， 硬化性胆管炎， 皮脂 腺病， Summerskill 综合征， 血小板减少症， 酪氨酸血症， 静脉曲张性出血， 肝脏静脉闭合疾 病， 和肝豆状核变性。
祖细胞的制备
本实施例提供了分离定向和未定向肝脏祖细胞的步骤。尽管各种技术在本领域 是已知的， 但仍然详细公开了一个优选的实施方案且应明白其它的制备技术同样是适合 的， 只要它们与所需目标相适应。例如， 优选的非限制性技术参见美国专利号 5,807,686， 5,916,743， 5,672,346， 5,681,559， 5,665,557， 5,672,346， 和 5,663,051， 本文引用以供参 考。 使用 Percoll 或者诸如 Histopaque 的其它合适的密度梯度可初步分离多能或 定型肝细胞， 即低密度的肝脏细胞， 离心后用培养基洗涤两次且重悬于 10ml 淘洗培养基 中。对于逆流淘洗， 经过将取样位点偶连到装配有 JE-5 转子和标准室的 Beckman JGM/ E 离心机的入口液流上注射洗涤的低密度单核细胞。然而， 可使用任何商品连续流动的离 心机和淘洗机， 优选采用包括室装置的一次性塑料插管以利于以密度为基础的分离， 例如， 使用 Deerfield， IL 的 BaxterInternational Inc. 销售的 “Fenwal Models CS 3000” 和 “Autopheresis C” ； Cobe manufacturing of Lakewood， CO. 销售的 “IBM Model 12997” 。 仪器的选择取决于本领域的技术人员。蠕动泵 (Cole Palmer Instruments， Chicago， IL) 提供了淘洗培养基的连续流动， 该培养基是含有 100mg/dl D- 葡萄糖， 0.3mM 乙二胺四乙酸 (EDTA) 二钠和 50mg/dl 牛血清白蛋白且 pH 调到 7.2 的 0.9％生理盐溶液。用前灭菌该培 养基。以 15ml/ 分钟的总体流速， 900g 的转速室温下传递细胞。收集 100ml 的洗脱物后， 流速增加到 25ml/ 分钟。转速保持恒定， 流速依次增加到 29ml/ 分钟， 33ml/ 分钟， 和 37ml/ 分钟， 每次增加时收集 200ml。 通过卸下转子并用 100ml 淘洗培养基冲洗室捕获室中保留的 细胞。洗涤各细胞馏分并以 300g 离心 10 分钟。收集合适的馏分， 以锥虫蓝染料排斥法测 定活力并用细胞计数器 (Coulter Electronics， Hialeah， FL) 测定细胞回收率。
作为选择， 肝脏细胞可不通过密度梯度分离处理并悬浮于含有 5 ％胎牛血清， 0.01 ％ EDTA 重 量 / 体 积， 1.0g/l D- 葡 萄 糖 的 磷 酸 盐 缓 冲 液 (PBS)， pH7.4 中， 且使用 JA-17 转子和标准分离室 (BeckmanInstruments) 在 10℃下以 1,950rpm 的转速直接注射进 Beckman 逆流离心淘洗系统中， 样品以 12 到 14ml/ 分钟之间的流速洗脱。因此该方法是通
用的且不必依赖于密度梯度分离。在合适馏分中获得的祖细胞一般具有 8.0 到 9.4 微米范围的细胞直径 ； 大多数细 胞具有落入 8.3 至 9.2 微米范围内的直径。这些直径根据本领域已知的技术测量。如果需 要， 可进一步进行基于细胞标记的阳性或阴性选择。
可单独使用本领域的技术人员已知的各种其它抗体或与上述肝脏祖细胞标记结 合使用。该选择取决于需要分离或富集的细胞类型且包括但不限于， 对造血细胞和淋巴细 胞抗原特异性的抗体， 例如， 对 T- 细胞特异性的抗 -CD2， 抗 -CD2R， 抗 -CD3， 抗 -CD4， 抗 -CD5 和抗 -CD8 ； 对 T- 细胞亚群和 B- 细胞亚群特异性的抗 -CD6 ； 对大多数 T- 细胞亚群特异性 的抗 -CD7 ； 对 B- 细胞特异性的抗 -CD12， 抗 -CD19 和抗 -CD20， 抗 -CD72， 抗 -CDw78 ； 对单 核细胞特异性的抗 -CD13 和抗 -CD14 ； 对天然杀伤细胞特异性的抗 -CD16 和抗 -CD56 ； 对 血小板特异性的抗 CD41 ； 对皮质胸腺细胞和胰岛细胞特异性的抗 -CD1a， CD1b 和 CD1c ； 对前体 B- 细胞， 单核细胞和血小板特异性的抗 -CD9 ； 对淋巴祖细胞， C-All 和粒细胞特 异性的抗 -CD10 ； 白细胞特异性的抗 -CD11a ； 粒细胞， 单核细胞和天然杀伤细胞特异性的 抗 -CD11b ； 对单核细胞， 粒细胞， 天然杀伤细胞和多毛细胞白血病特异性的抗 -CD11c ； 粒 细胞特异性的抗 -CD15 ； 粒细胞， 单核细胞和血小板特异性的抗 -CDw17 ； 白细胞特异性的 抗 -CD18 ； 成熟 B- 细胞特异性的抗 -CD21 ； B- 细胞细胞质和成熟 B- 细胞特异性的抗 -CD22 ； 激活的 B- 细胞特异性的抗 -CD23 ； B- 细胞和粒细胞特异性的抗 -CD24 ； 激活的 T- 细胞 和 B- 细胞和激活的巨噬细胞特异性的抗 -CD25 和抗 -CD26 ； 主要 T- 细胞亚群特异性的 抗 -CD27 和抗 -CD28 ； 激活的 T- 细胞和 B- 细胞和 Sternberg Reed 细胞特异性的抗 -CD30 ； 血小板， 单核细胞 / 巨噬细胞， 粒细胞和 B- 细胞特异性的抗 -CD31 ； 巨噬细胞， 粒细胞， B- 细胞和嗜曙红细胞特异性的抗 -CDw32 ； 单核细胞， 骨髓祖细胞和骨髓白血病特异性的 抗 -CD33 ； 造血前体细胞特异性的抗 -CD34 ； 粒细胞， 单核细胞， B- 细胞， 一些 NK 细胞， 和红 细胞特异性的抗 -CD35 ； 单核细胞 / 巨噬细胞和血小板特异性的抗 -CD36 ； 成熟 B- 细胞特 异性的抗 -CD37 ； 血浆细胞， 胸腺细胞和激活的 T- 细胞特异性的抗 -CD38 ； 成熟 B- 细胞特 异性的抗 -CD39 ； B- 细胞和癌特异性的抗 -CD40 ； 血小板和巨核细胞特异性的抗 -CD42 和 42b ； 除循环 B- 细胞外的白细胞特异性的抗 -CD43 ； 白细胞和红细胞特异性的抗 -CD44 ； 白 细胞特异性的抗 -CD45 ； T- 细胞， B- 细胞亚群， 单核细胞和巨噬细胞特异性的抗 -CD45RO ； B- 细胞， 单核细胞和 T- 细胞亚群特异性的抗 -CD45RA ； B- 细胞， T- 细胞亚群， 单核细胞， 巨噬细胞和粒细胞特异性的抗 -CD45RB ； 造血细胞和非造血细胞特异性的抗 -CD46， CD55， CD58 和 CD59 ； 所有细胞类型特异性的抗 -CD47 ； 白细胞和嗜中性白细胞特异性的抗 -CD48 ； 血小板， 激活的和长期培养的 T- 细胞特异性的抗 -CDw49b ； 对单核细胞， T- 细胞和 B- 细胞 特异性的抗 -CDw49d ； 血小板和巨核细胞特异性的抗 -CDw49f ； 白细胞特异性的抗 -CDw50 和 CDw52 ； 血小板特异性的抗 -CD51 ； 包括正常和肿瘤血浆细胞的白细胞特异性的抗 -CD53 ； 内皮细胞特异性的抗 -CD54 ； T- 细胞亚群和血小板特异性的抗 -CDw60 ； 血小板和巨核细胞 特异性的抗 -CD61 ； 激活的血小板特异性的抗 -CD62 ； 激活的血小板， 单核细胞 / 巨噬细胞 特异性的抗 -CD63 ； 单核细胞 ( 上调干抗素 γ) 特异性的抗 -CD64 ； 粒细胞和与单核细胞 的异源性反应特异性的抗 -CDw65 ； 粒细胞特异性的抗 -CD66 和 67 ； 单核细胞和巨噬细胞 特异性的抗 -CD68 ； 激活的 B- 细胞和 T- 细胞， 激活的巨噬细胞和天然杀伤细胞特异性的 抗 -CD69 ； 激活的 T- 细胞和 B- 细胞， Sternberg-Reed 细胞， 和退行发育的大细胞淋巴瘤特 异性的抗 -CDw70 ； 激活的 T- 细胞 B- 细胞， 巨噬细胞， 增生细胞特异性的抗 -CD71 ； B- 细胞亚群和 T-- 细胞亚群特异性的抗 -CD73 ； B- 细胞和单核细胞 / 巨噬细胞特异性的抗 -CD74 ； 成熟 B- 细胞特异性的抗 -CDw75 ； 成熟 B- 细胞和 T- 细胞亚群特异性的抗 -CD76 ； 滤泡中心 B- 细胞特异性的抗 -CD77 ； 抗细胞因子和生长因子的抗体 ( 例如， IL1-IL13， EGF， IGF I 和 II， TGF-α 和 β， TNF-α 和 β， FGF， NGF， CIF， IFN-α 和 β， CSF 的抗体 ) ： 病毒抗原 ( 例 如， 乙型肝炎包膜蛋白或 HIV 包膜蛋白 )， 激素， 细胞或肿瘤相关抗原或标记， 粘连分子， 止 血分子和内皮细胞。本领域已知的其它标记和富集方法同样合适， 例如在作为参考文献引 用的美国专利号 5,840,502 中所公开的。
所有上面引证的参考文献和出版物分别以其各自的整体在本文中引用以供参考。
尽管已经举例说明和描述了本发明的优选实施方案， 但可预料到可对其作出各种 修改而不偏离本发明的实质和范围。本领域的技术人员将认识到， 或者使用不超过常规的 实验能确定， 许多与本文所述的本发明的具体实施方案等同的方案。