一种地衣芽孢杆菌、筛选方法及用途.pdf

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1、(10)授权公告号 CN 102925377 B (45)授权公告日 2014.11.05 CN 102925377 B (21)申请号 201110386162.X (22)申请日 2011.11.28 C12N 1/20(2006.01) C12N 1/02(2006.01) C12Q 1/04(2006.01) C02F 3/34(2006.01) C12R 1/10(2006.01) C02F 101/34(2006.01) C02F 101/38(2006.01) (73)专利权人 上海海洋大学 地址 201306 上海市浦东新区临港新城沪城 环路 999 号 (72)发明人 张庆华。

2、 郭婧 王娟 封永辉 张永华 范斌 (74)专利代理机构 上海三和万国知识产权代理 事务所 ( 普通合伙 ) 31230 代理人 陈伟勇 CN 101323843 A,2008.12.17, 全文 . 曹煜成 等 .“地衣芽孢杆菌 De 在优质草鱼 养殖中的应用研究” .南方水产 .2008, 第 4 卷 ( 第 3 期 ), 第 15-19 页 . 张庆华 等. “地衣芽孢杆菌对养殖水体氨氮、 残饵降解特性研究” .水生生物学报 .2011, 第 35 卷 ( 第 3 期 ), 第 498 页摘要 . (54) 发明名称 一种地衣芽孢杆菌、 筛选方法及用途 (57) 摘要 本发明属于微生物技。

3、术领域， 本发明提供了 一种地衣芽孢杆菌， 其能分泌多种酶类， 促进动 物酶活性并提高动物的免疫力， 减少病原菌侵 害 ； 此外还能降解养殖水体中的氨氮、 残余饵料 蛋白质和淀粉， 净化养殖水体。本发明还提供了 一种地衣芽孢杆菌的筛选方法及其降解氨氮的 用途。本发明的地衣芽孢杆菌保存号为 CCTCC No.M2011325。 (51)Int.Cl. (56)对比文件 审查员 蔺娜 权利要求书 1 页 说明书 4 页 序列表 2 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利 权利要求书1页 说明书4页 序列表2页 (10)授权公告号 CN 102925377 B CN 102925。

4、377 B 1/1 页 2 1. 一种地衣芽孢杆菌 (Bacillus licheniformi)， 在中国典型培养物保藏中心的保藏 编号为 CCTCC No.M2011325。 2. 一种权利要求 1 的地衣芽孢杆菌的用途， 所述地衣芽孢杆菌用于降解养殖水体中的 氨氮。 3. 如权利要求 2 所述的地衣芽孢杆菌用途， 其特征在于， 所述的地衣芽孢杆菌用于降 解蛋白质和 / 或淀粉。 4. 如权利要求 3 所述的地衣芽孢杆菌用途， 其特征在于， 所述的地衣芽孢杆菌降解蛋 白质和淀粉的条件 ： 温度为 10 40 ,pH 为 4.0 9.0, 盐度为 0.5% 3%, 氨氮初始浓 度为 50mg。

5、/L 200mg/L。 5. 如权利要求 3 所述的地衣芽孢杆菌用途， 其特征在于， 所述的地衣芽孢杆菌降解蛋 白质和淀粉的条件 : 温度为 30， pH 为 7， 盐度为 2%, 氨氮初始浓度为 100mg/L。 权 利 要 求 书 CN 102925377 B 2 1/4 页 3 一种地衣芽孢杆菌、 筛选方法及用途 技术领域 0001 本发明属于生物技术领域， 具体涉及微生物技术领域， 特别涉及一种地衣芽孢杆 菌。 背景技术 0002 近年来随着人们生活水平的提高和环保意识的增强， 对水产品的安全和品质提出 了新的更高要求。 但是由于水产养殖集约化、 高密度饲养模式的大规模应用， 使得养殖。

6、水体 中有机物、 氨氮和亚硝酸氮等污染物的浓度增加， 不但导致水质恶化， 而且直接毒害养殖动 物， 引起病害的频繁发生， 水产品品质也在不断下降， 造成养殖水体生态遭到严重破坏。针 对水产养殖中出现的这些问题， 微生态制剂的调控技术已经成为解决养殖水域污染病害问 题的有效手段之一。相对于传统的物理和化学方法而言， 微生态技术具有成本低、 收效大、 无二次污染等优点， 是当前环境治理尤其是水环境污染治理的研究热点。 0003 具有高效除氮能力的细菌既有自养型细菌 （硝化细菌、 光合细菌等） , 也有恶臭假 单胞菌、 芽孢杆菌等异养型细菌。目前芽孢杆菌是水产养殖中应用最多的微生物之一。一 方面由于。

7、芽孢杆菌在分离和培养方面对营养和环境条件均有较低要求， 具有生长速率快、 溶解氧要求浓度低、 能忍受酸性的环境等优点 ； 另一方面芽孢杆菌有利于提高养殖生物的 消化机能， 促进其对营养物质的吸收， 降解水体中的有机碎屑， 减少氨氮、 亚硝酸盐、 硫化氢 等有毒有害物质， 起到优化养殖环境， 促进水环境生态良性循环等功效。 发明内容 0004 本发明所要解决的第一方面的技术问题在于， 提供一种地衣芽孢杆菌 (Bacillus licheniformi)， 其能分泌多种酶类， 促进动物酶活性并提高动物的免疫力， 减少病原菌侵 害 ； 此外还能降解养殖水体中的氨氮、 残余饵料蛋白质和淀粉， 净化养殖。

8、水体。 0005 本发明所要解决的第二方面的技术问题在于， 提供一种地衣芽孢杆菌的筛选方 法。 0006 本发明所要解决的第三方面的技术问题在于， 提供一种地衣芽孢杆菌的应用。 0007 为了解决上述问题本发明的第一方面的技术方案是这样的 ： 一种地衣芽孢杆菌 (Bacillus licheniformi)， 其特征在于， 该地衣芽孢杆菌为 X3914， 在中国典型培养物保藏 中心的保藏编号为 CCTCC No.M2011325。 0008 所述地衣芽孢杆菌为 X3914， 于 2011 年 9 月 21 日在武汉中国典型培养物保藏中 心 （CCTCC） 保藏， 保藏编号为 CCTCC No.。

9、M2011325。芽孢杆菌种属， 细胞排列呈杆状、 单生， 0.8m （1.5 3.5） m、 革兰氏染色阳性， 有芽孢， 具有运动性， 异养型细菌， 在肉汁培养 基上菌落为扁平、 边缘不整齐、 表面粗糙皱褶。 0009 为了解决上述问题本发明的第二方面的技术方案是这样的 ： 一种地衣芽孢杆菌的 筛选方法 , 包括如下步骤 : 0010 (1) 健康大黄鱼体表消毒后， 取出肠道加入灭菌生理盐水混合研磨 , 稀释后分别 说 明 书 CN 102925377 B 3 2/4 页 4 涂布于营养琼脂培养基和 TCBS 培养基 ; 0011 (2) 将上述两种培养基平板置于 25 30恒温培养箱中培养。

10、 1 2d， 分别观察 平板上的菌落特征， 挑选出不同特征的菌落， 用琼脂培养基斜面保藏 ； 0012 (3) 将步骤 （2） 中的斜面培养的菌落用营养肉汤培养基扩大培养， 再利用筛选培 养基对菌株进行液体培养 ； 0013 (4) 最后用奈氏试剂检验培养液中 NH4+的产生情况， 以巨大芽孢杆菌 1.459（购 自 CGMCC）作对照， 如呈现黄色， 说明此种细菌可将有机氮转化为 NH4+， 即可判断菌株具 有氨氮降解功能。以此筛选出降解氨氮能力较强的菌株， 编号为 X3914， 即为保存号为 CCTCCM2011325 的菌株。 0014 优选地， 所述的步骤 （1） 中， 取出肠道称重后。

11、按 1:10 1:15（W/V） 的比例加入灭 菌生理盐水混合， 用用灭菌匀浆器研磨。 0015 优选地， 所述的步骤 （2） 的平板培养温度为 28。 0016 为了解决上述问题本发明的第三方面的技术方案是这样的 ： 一种地衣芽孢杆菌用 于降解氨氮。 0017 优选地， 所述的地衣芽孢杆菌用于降解蛋白质和 / 或淀粉。 0018 优选地， 所述的地衣芽孢杆菌降解蛋白质和淀粉的条件为， 温度为 10 40 ,pH 为 4.0 9.0, 盐度为 0.5% 3%, 氨氮初始浓度为 50mg/L 200mg/L。 0019 优选地， 所述的地衣芽孢杆菌降解蛋白质和淀粉的条件， 温度为 30， pH 。

12、为 7. 盐 度为 2%, 氨氮初始浓度为 100mg/L。 0020 优选地， 所述的地衣芽孢杆菌保存号为 CCTCCM2011325。 0021 说明 ： 营养琼脂培养基 ： 牛肉膏 3g， 蛋白胨 10g， NaC15g， 琼脂 15-20g， 水 l000mL， pH 值 7.0-7.2,121灭菌 20min。 0022 TCBS 配方 ： 多价蛋白胨 10g， 氯化钠 10g， 酵母浸出粉 5g， 硫代硫酸钠 10g， 柠檬 酸铁 1g， 牛胆粉 5g， 胆酸钠 3g， 蔗糖 20g， 柠檬酸钠 10g， 溴麝香草酚蓝 0.04g， 麝香草酚蓝 0.04g， 琼脂 14g。 002。

13、3 筛 选 培 养 基 ：葡 萄 糖 5.0g， (NH4)2SO40.25g， NaC11.0g， K2HPO40.5g， MgSO47H2O0.25g， 水 1000ml， pH7.2， 其中氨氮含量约为 50mg L。 0024 大黄鱼 （Pseudosciaena crocea） ， 于 2009 年 10 月 -12 月随机挑选自浙江省宁波 市象山海水网箱养殖场， 取样时测定水温 27， 海水盐度 26.8。 0025 有益效果， 本发明的地衣芽孢杆菌优点 ： 0026 1、 该株地衣芽孢杆菌是从大黄鱼肠道中筛选出来的， 对海水鱼及海水环境如高盐 度、 高压等有一定的耐受性， 用于净。

14、化大黄鱼养殖水体或其他海水养殖水体较其他来源菌 株有更好的适应性 ； 0027 2、 该地衣芽孢杆菌的生长与氨氮降解是同步进行的， 与其他生长率落后于氨氮浓 度降低的相比， 其具有更高的氨氮吸附效率， 具有更大的降解效率。 具体实施方式 0028 为了使本发明实现的技术手段、 创作特征、 达成目的与功效易于明白了解， 下面结 合具体图示， 进一步阐述本发明。 说 明 书 CN 102925377 B 4 3/4 页 5 0029 实施例 1 地衣芽孢杆菌的筛选 ： 0030 首先用 75% 的酒精对健康大黄鱼体表消毒 ； 无菌条件下解剖， 取出肠道， 75% 酒精 棉球擦拭肠管外壁， 无菌生理。

15、盐水反复冲洗。制备肠道总菌悬液时 ( 包括肠壁和肠内容 物 )， 先用无菌棉线分别结扎前肠、 中肠及后肠部位各取约 0.5cm 长的组织混合在一起作为 样品 , 称重后按 1 10(w/v) 的比例加入灭菌生理盐水混合， 用灭菌匀浆器充分研磨均匀， 研磨的样品设为10-1， 再用灭菌生理盐水对10-1样品进行倍比稀释至10-6， 各稀释度样品 均置于漩涡混合仪上振荡均匀。分别取各稀释度样品 0.1mL 涂布于 2 种选择性培养基平板 置 28培养 1 2d， 分别观察平板上的菌落特征， 挑选出不同特征的菌落， 如根据菌落大 小、 颜色、 透明度、 表面光泽度、 边缘形态等， 斜面保藏。 003。

16、1 将斜面保藏菌种， 用营养肉汤培养基扩大培养。利用氨化细菌液体培养基对菌株 进行液体培养， 并用奈氏试剂检验培养液中 NH4+的产生情况， 以巨大芽孢杆菌 1.459（购自 CGMCC） 作对照， 如呈现黄色， 说明此种细菌可将有机氮转化为 NH4+， 即可判断菌株具有氨氮 降解功能。以此筛选出降解氨氮能力较强的菌株， 编号为 X3914。 0032 实施例 2 0033 2.1 菌种的确认 0034 采用常规生理生化反应与分子 16S rRNA 技术对从大黄鱼肠道中筛选出来的菌 株 X3914 进行鉴定。测定 X3914 的 16S rRNA 共有 1511 个有效碱基， 根据地衣芽孢杆菌。

17、在 Genebank 中的 16S rRNA 进行分子鉴定 ； 再结合生理生化反应 X3914 为革兰氏阳性， 杆状， 有芽孢， 氧化酶与过氧化氢酶均为阳性， 且具运动性， 进一步采用法国生物梅里埃细菌鉴定 仪 （参照 常见细菌鉴定手册 ） ， 最终确定 X3914 为地衣芽孢杆菌。 0035 (1)VITEK-32 细菌鉴定仪对菌株 X3914 的鉴定报告 0036 0037 2.2 菌种 16S rRNA 测序结果 说 明 书 CN 102925377 B 5 4/4 页 6 0038 测序引物 ： 0039 27f （对应于 E.coli 的 8-27 位碱基） ： 5 -agagttt。

18、gatcctggctcag-3 ， 见 Seq.No.1 ； 1492r（对应于 E.coli 的 1492-1514 位碱基） ： 5 -tacggctaccttgttacgactt-3 ， 见 Seq. No.2。 0040 测序结果 （共 1511bp） ： 见 Seq.No.3. 0041 实施例 3 该菌株对氨氮、 残余饵料蛋白和淀粉的降解能力 0042 用接种环挑取 X3914 菌株斜面培养物接种到活化培养基中， 28摇床培养 18-20h 后， 用 0.85% 无菌生理盐水离心洗涤 3 次， 最后用生理盐水制成菌液。以筛选培养基作为模 拟含氨氮废水， 分别以温度、 盐度、 pH、。

19、 氨氮初始浓度作为变量， 确定 X3914 降解氨氮的最佳 条件。在氨氮初始浓度 100mg/L， 温度为 30， 盐度在 1.5% 到 2.0% 之间， pH 在 7 时， 该 地衣芽孢杆菌对氨氮的降解能力达到最高， 24h 内的氨氮降解率达到 36.2%。 0043 以大黄鱼养殖用水为基质， 配制成pH值7.0、 含1%大黄鱼饲料的养殖水体培养基， 灭菌后接种 5% 的地衣芽孢杆菌 X3914 菌液， 28静置培养， 并每隔 24h 取上清测定蛋白质、 淀粉含量。 其中， 蛋白氮的测定采用半微量凯氏定氮法， 淀粉含量的测定采用碘显色法 ； 48h 内接种 5% 菌量的蛋白质和淀粉的降解率分。

20、别为 35.2% 和 52.6%。 0044 筛 选 培 养 基 ：葡 萄 糖 5.0g， (NH4)2SO40.25g， NaC11.0g， K2HPO40.5g， MgSO47H2O0.25g， 水 1000ml， pH7.2， 其中氨氮含量约为 50mg L。 0045 通过单因子实验， 从温度 10， 15， 20， 25， 30， 35， 40中确定 X3914 的 最佳降解温度为 30。 0046 通过单因子实验， 从盐度 0.5%， 1.0%， 1.5%， 2.0%， 2.5%， 2.6%， 2.7%， 3.0%， 5.0% 中 确定 X3914 的最佳降解盐度为 2.0%。 0。

21、047 通过单因子实验， 从 pH 为 4.0， 5.0， 6.0， 7.0， 8.0， 9.0， 10.0 中确定 X3914 的最佳 降解 pH 为 7.0。 0048 通过单因子实验， 从氨氮初始浓度为 10mg/L， 20mg/L， 30mg/L， 40mg/L， 50mg/L， 100mg/L， 150mg/L， 200mg/L， 300mg/L 中确定 X3914 的最佳降解氨氮初始浓度为 100mg/L。 0049 蛋白质降解率 (%)=| 培养后蛋白氮浓度 - 培养前蛋白氮浓度 |/ 培养前蛋白氮浓 度 100% 0050 淀粉降解率 (%)=| 培养后淀粉浓度 - 培养前淀粉浓度 |/ 培养前淀粉浓度 100% 0051 以上显示和描述了本发明的基本原理、 主要特征和本发明的优点。本行业的技术 人员应该了解， 本发明不受上述实施例的限制， 上述实施例和说明书中描述的只是说明本 发明的原理， 在不脱离本发明精神和范围的前提下本发明还会有各种变化和改进， 这些变 化和改进都落入要求保护的本发明范围内。 本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其 等同物界定。 说 明 书 CN 102925377 B 6 1/2 页 7 0001 序 列 表 CN 102925377 B 7 2/2 页 8 0002 序 列 表 CN 102925377 B 8 。