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磁性纳米颗粒溶液、其制备方法及用途.pdf

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文档编号：863278

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1、10申请公布号CN101982420A43申请公布日20110302CN101982420ACN101982420A21申请号201010513790522申请日20101020C01G49/06200601C12Q1/0220060171申请人北京惟馨雨生物科技有限公司地址100084北京市海淀区成府路文津国际公寓1201室72发明人曾雨黄巍张大奕拉威尔法克鲁林穆斯塔法奥兹曼维塞林保诺夫74专利代理机构北京市德权律师事务所11302代理人王建国54发明名称磁性纳米颗粒溶液、其制备方法及用途57摘要本发明公开了一种分散在聚丙烯胺的盐酸盐水溶液中的磁性纳米颗粒溶液。制备磁性纳米颗粒溶液的方法，包。

2、括下列步骤利用共沉积法合成磁性纳米颗粒；利用超声分散法在溶剂中分散磁性纳米颗粒，得到磁性纳米颗粒溶液；其特征在于所述的溶剂为聚丙烯胺的盐酸盐水溶液。本发明也公开了利用该磁性纳米颗粒溶液制备磁性生物传感器的方法及在制备磁性生物传感器的应用。本发明磁性纳米颗粒溶液制备的磁性生物传感器，保持该生物传感器活性达到99959997，可保留原生物传感器对特定底物的定量响应强度和检测灵敏度，同时可以通过磁体回收将生物传感器从水体或土壤样品中分离，为生物传感器在环境检测与医药领域的应用提供了技术支持。51INTCL19中华人民共和国国家知识产权局12发明专利申请权利要求书2页说明书10页附图5页CN10198。

3、2422A1/2页21一种磁性纳米颗粒溶液，该磁性纳米颗粒分散在溶剂中，其特征在于所述的溶剂是聚丙烯胺的盐酸盐水溶液。2根据权利要求1所述的磁性纳米颗粒溶液，其特征在于所述的磁性纳米颗粒是直径为1521NM的氧化铁。3一种制备磁性纳米颗粒溶液的方法，该方法包括下列步骤A利用共沉积法合成磁性纳米颗粒；B利用超声分散法在溶剂中分散磁性纳米颗粒，得到磁性纳米颗粒溶液；其特征在于所述的溶剂为聚丙烯胺的盐酸盐水溶液。4根据权利要求3所述的制备磁性纳米颗粒溶液的方法，其特征在于所述的磁性纳米颗粒是直径为1521NM的氧化铁。5根据权利要求4所述的制备磁性纳米颗粒溶液的方法，其特征在于步骤B的超声分散法在溶。

4、剂中分散磁性纳米颗粒包括下列步骤向步骤A中制得的磁性纳米颗粒中加纯水，制得磁性纳米颗粒水溶液，在聚丙烯胺的盐酸盐水溶液中加入磁性纳米颗粒水溶液，在超声条件下震荡，离心，弃去上清液，加入等体积纯水，在超声条件下震荡，离心，弃去上清液，再次加入等体积纯水，获得磁性纳米颗粒溶液。6根据权利要求5所述的制备磁性纳米颗粒溶液的方法，其特征在于步骤B的超声分散法在溶剂中分散磁性纳米颗粒包括下列步骤向步骤A中制得的磁性纳米颗粒中加纯水，制得磁性纳米颗粒水溶液，在聚丙烯胺的盐酸盐水溶液中加入磁性纳米颗粒水溶液，在20KHZ至120KHZ超声条件下震荡520分钟，2000RPM至6000RPM下离心520分钟，。

5、弃去上清液，加入等体积纯水，在20KHZ至120KHZ超声条件下震荡520分钟，2000RPM至6000RPM下离心520分钟，弃去上清液，再次加入等体积纯水，获得磁性纳米颗粒溶液。7一种磁性生物传感器的构建方法，该方法包括下列步骤A接种生物传感器的单菌落于液体培养基中，获得细胞悬浮液。B利用共沉积法合成磁性纳米颗粒；C利用超声分散法在溶剂中分散磁性纳米颗粒，得到磁性纳米颗粒溶液；D将步骤A制得的细胞悬浮液与步骤C制得的磁性纳米颗粒溶液共培养，磁体回收已经结合磁性纳米颗粒的生物传感器，得到磁性生物传感器；其特征在于步骤C中所述的溶剂为聚丙烯胺的盐酸盐水溶液。8根据权利要求7所述的磁性生物传感器。

6、的构建方法，其特征在于所述的磁性纳米颗粒是直径为1521NM的氧化铁。9根据权利要求8所述的磁性生物传感器的构建方法，其特征在于步骤C的超声分散法在溶剂中分散磁性纳米颗粒包括下列步骤向步骤B中制得的磁性纳米颗粒中加纯水，制得磁性纳米颗粒水溶液，在聚丙烯胺的盐酸盐水溶液中加入磁性纳米颗粒水溶液，在超声条件下震荡，离心，弃去上清液，加入等体积纯水，在超声条件下震荡，离心，弃去上清液，再次加入等体积纯水，获得磁性纳米颗粒溶液。10根据权利要求9所述的磁性生物传感器的构建方法，其特征在于步骤C的超声分散法在溶剂中分散磁性纳米颗粒包括下列步骤向步骤B中制得的磁性纳米颗粒中加纯水，制得磁性纳米颗粒水溶液，。

7、在聚丙烯胺的盐酸盐水溶液中加入磁性纳米颗粒水溶液，在20KHZ至120KHZ超声条件下震荡520分钟，2000RPM至6000RPM下离心520分钟，弃去上权利要求书CN101982420ACN101982422A2/2页3清液，加入等体积纯水，在20KHZ至120KHZ超声条件下震荡520分钟，2000RPM至6000RPM下离心520分钟，弃去上清液，再次加入等体积纯水，获得磁性纳米颗粒溶液。11根据权利要求7至10中任一权利要求所述的磁性生物传感器的构建方法，其特征在于所述的生物传感器选自不动杆菌ACINETOBACTERSPADPWH_LUX、不动杆菌ACINETOBACTERSPAD。

8、PWH_TOL和不动杆菌ACINETOBACTERSPADPWH_ALK。12权利要求1或2所述的磁性纳米颗粒溶液用于制备磁性生物传感器的应用。权利要求书CN101982420ACN101982422A1/10页4磁性纳米颗粒溶液、其制备方法及用途技术领域0001本发明涉及一种磁性纳米颗粒溶液，以及该磁性纳米颗粒溶液的制备方法，磁性生物传感器的构建方法，及该磁性纳米颗粒溶液的用途。背景技术0002社会各行业在生产、运输、使用和处置过程中，往往伴随着大量具有环境风险的污染物残留、泄露和排放。近年来，随着我国工业、农业和市政建设的快速发展，由上述污染物所导致的环境污染事故层出不穷，受污染场地的数目。

9、与面积逐年扩大，对人民生活健康造成了重大威胁。在这些污染物中，以农药和石油化工产品为代表的复杂持久性有机污染物具有痕量、广泛存在和种类繁多等特点，给环境监测与风险评价提出了巨大的挑战。现有的传统化学分析方法面对复杂持久性有机污染物，具有操作繁琐复杂的预处理过程、耗时较长几小时至几天时间、设备昂贵和成本较高等缺点，并且无法有效评价复合污染条件下的生物毒性与环境生态风险。这些问题严重制约了相关污染场地的环境评估和风险评价，限制了突发性环境应急事故的快速评估，为新型检测技术，特别是以生物传感器BIOSENSOR为代表的生物快速检测技术的发展提供了良好的契机。0003据相关行业报告表明，英国环境监测市。

10、场目前已达到59亿英镑60亿人民币的规模ENVIRONMENTALKTNREPORT，2008。其中，快速检测技术所涵盖的市场份额达到2亿英镑20亿人民币。而从全球范围来看，最新的全球市场分析报告GLOBALINDUSTRYANALYSTS，INC预测生物传感器市场价值在2012年之前可以达到61亿美元400亿人民币。现有中国经济的高速发展已经付出了高昂的环境代价，这主要体现在污染场地带来的生态修复与人体健康问题、工业搬迁场地引发的二次开发问题和突发性环境事故导致的预警应急问题等。这些问题都伴随着对环境监测与风险评价的更高要求，表明中国政府对新型环境检测技术具有迫切的需求，预示着生物快速检测技。

11、术在中国具有广阔的市场。0004生物细胞传感器以活体微生物细胞作为宿主，可以真实的评价环境中目标物质的生物效应生物可利用性，检测方法简单易行，可直接应用于水样，具有稳定性和可靠性，与传统分析方法相比具有高度的准确性。而其低成本和快速响应的特点，可以满足此领域市场的需要，兼备操作简单和可实现定量测定等优点。但与此同时，生物细胞传感器由于受到自身特点的限制，具有难回收和难操控等问题。首先，由于活体生物细胞传感器本身具备生物活性，可以在自然环境中增殖与运动，因此一旦投入被检测或应用环境中，难以同土著微生物进行区别，更难以回收，其自身携带的目标基因、调控基因或报道基因存在巨大的环境风险。其次，对于土壤。

12、等复杂环境样品的分析，往往需要在检测过程中将样品与生物传感器分离，以避免复杂介质对检测信号的影响。0005磁性纳米颗粒是一种有效的远距离操纵工具，通过将磁性纳米颗粒与有机或无机材料结合，可以实现通过磁场对相应材料的运动进行远距离控制，已在微晶体和碳纳米管研究领域受到了广泛关注。在微生物学领域，已有研究成功将磁性纳米颗粒固定在活体酵母细胞，但应用于活体细菌细胞的研究尚未见报道，其面临的技术问题主要包括如何在固说明书CN101982420ACN101982422A2/10页5定化过程中保持细胞活性。发明内容0006本发明的目的是提供一种可以与生物传感器结合，同时保持该生物传感器活性，并使生物传感器。

13、具有磁性，便于检测回收的磁性纳米颗粒溶液，其制备方法及应用。0007为了达到上述目的，本发明提供了一种磁性纳米颗粒溶液，该磁性纳米颗粒分散在溶剂中，其特征在于所述的溶剂是聚丙烯胺的盐酸盐水溶液。0008本发明的磁性纳米颗粒溶液，其特征在于所述的磁性纳米颗粒是直径为1521NM的氧化铁。0009本发明还提供了一种制备磁性纳米颗粒溶液的方法，该方法包括下列步骤0010A利用共沉积法合成磁性纳米颗粒；0011B利用超声分散法在溶剂中分散磁性纳米颗粒，得到磁性纳米颗粒溶液；0012其特征在于所述的溶剂为聚丙烯胺的盐酸盐水溶液。0013本发明的制备磁性纳米颗粒溶液的方法，其进一步特征在于所述的磁性纳米颗。

14、粒是直径为1521NM的氧化铁。0014本发明的制备磁性纳米颗粒溶液的方法，其进一步特征在于步骤B所述的超声分散法在溶剂中分散磁性纳米颗粒包括下列步骤向步骤A所制得的磁性纳米颗粒中加纯水，制得磁性纳米颗粒水溶液，在聚丙烯胺的盐酸盐水溶液中加入磁性纳米颗粒水溶液，在超声条件下震荡，离心，弃去上清液，加入等体积纯水，在超声条件下震荡，离心，弃去上清液，再次加入等体积纯水，获得磁性纳米颗粒溶液。0015本发明的制备磁性纳米颗粒溶液的方法，其进一步特征在于步骤B所述的超声分散法在溶剂中分散磁性纳米颗粒包括下列步骤向步骤A所制得的磁性纳米颗粒中加纯水，制得磁性纳米颗粒水溶液，在聚丙烯胺的盐酸盐水溶液中加。

15、入磁性纳米颗粒水溶液，在20KHZ至120KHZ超声条件下震荡520分钟，2000RPM至6000RPM下离心520分钟，弃去上清液，加入等体积纯水，在20KHZ至120KHZ超声条件下震荡520分钟，2000RPM至6000RPM下离心520分钟，弃去上清液，再次加入等体积纯水，获得磁性纳米颗粒溶液。0016本发明还提供了一种磁性生物传感器的构建方法，该方法包括下列步骤0017A接种生物传感器的单菌落于液体培养基中，获得细胞悬浮液；0018B利用共沉积法合成磁性纳米颗粒；0019C利用超声分散法在溶剂中分散磁性纳米颗粒，获得磁性纳米颗粒溶液；0020D将步骤A制得的细胞悬浮液与步骤C制得的磁。

16、性纳米颗粒溶液共培养，磁体回收已经结合磁性纳米颗粒的生物传感器，制得磁性生物传感器；0021其特征在于步骤C中所述的溶剂为聚丙烯胺的盐酸盐水溶液。0022本发明的磁性生物传感器的构建方法，其进一步特征在于所述的磁性纳米颗粒是直径为1521NM的氧化铁。0023本发明的磁性生物传感器的构建方法，其进一步特征在于步骤C所述的超声分散法在溶剂中分散磁性纳米颗粒包括下列步骤向步骤B中所制得的磁性纳米颗粒中加纯水，制得磁性纳米颗粒水溶液，在聚丙烯胺的盐酸盐水溶液中加入磁性纳米颗粒水溶液，在超声条件下震荡，离心，弃去上清液，加入等体积纯水，在超声条件下震荡，离心，弃去上清说明书CN101982420ACN。

17、101982422A3/10页6液，再次加入等体积纯水，获得磁性纳米颗粒溶液。0024本发明的磁性生物传感器的构建方法，其进一步特征在于步骤C所述的超声分散法在溶剂中分散磁性纳米颗粒包括下列步骤向步骤B中所制得的磁性纳米颗粒中加纯水，制得磁性纳米颗粒水溶液，在聚丙烯胺的盐酸盐水溶液中加入磁性纳米颗粒水溶液，在20KHZ至120KHZ超声条件下震荡520分钟，2000RPM至6000RPM下离心520分钟，弃去上清液，加入等体积纯水，在20KHZ至120KHZ超声条件下震荡520分钟，2000RPM至6000RPM下离心520分钟，弃去上清液，再次加入等体积纯水，获得磁性纳米颗粒溶液。0025本。

18、发明的磁性生物传感器的构建方法，其进一步特征在于所述的的生物传感器选自不动杆菌ACINETOBACTERSP,ADPWH_LUX、不动杆菌ACINETOBACTERSPADPWH_TOL和不动杆菌ACINETOBACTERSPADPWH_ALK。0026进一步，本发明还提供了磁性纳米颗粒溶液用于制备磁性生物传感器的应用。本发明的磁性生物传感器检测水体或土壤样品中污染物的应用，是将所述的磁性生物传感器与水体或土壤样品混合，培养所述磁性生物传感器，通过检测报道基因表达产物的发光强度来直接定量检测土壤样品污染物含量。其中使用多功能酶标仪作为检测仪器，使用磁体回收磁性生物传感器，所述培养温度为30。0。

19、027本发明的磁性纳米颗粒溶液与生物传感器结合，制备磁性生物传感器，可以同时保持该生物传感器活性达到99959997，可保留原生物传感器对特定底物的定量响应强度和检测灵敏度，同时可以通过磁体回收的方法将磁性生物传感器从水体或土壤样品中分离，有效增强了生物传感器的使用范围，为生物传感器在环境检测与医药领域的应用提供了技术支持。0028为了更好地理解本发明，现在结合附图及具体实施例对本发明进行详细地说明。0029在此需要说明的是本发明所用的生物材料、试剂、仪器如无特别说明均属于本领域常规的生物材料、试剂、仪器，均可以通过商业途径购得。本发明中所使用的培养基及方法如无特别说明，均为本领域常规的培养基。

20、及方法。附图说明0030图1是本发明制得的磁性纳米颗粒溶液的透射电子显微镜TEM照片。0031图2是悬浮状态左图与磁体吸附状态右图的本发明制得的磁性生物传感器不动杆菌ACINETOBACTERSPADPWH_LUX。0032图3是本发明制得的磁性生物传感器不动杆菌ACINETOBACTERSPADPWH_LUX薄片法的透射电子显微镜TEM照片。0033图4是图3部分区域的放大图像。0034图5是本发明制得的磁性生物传感器不动杆菌ACINETOBACTERSPADPWH_LUX的表面电子能谱EDX。0035图6是在琼脂糖板上菌落计数磁性生物传感器不动杆菌ACINETOBACTERSPADPWH_。

21、LUX数量的图示。0036图7是磁性生物传感器不动杆菌ACINETOBACTERSPADPWH_LUX细胞的生长和分裂的图示。0037图8是磁性生物传感器不动杆菌ACINETOBACTERSPADPWH_LUX对水中不同浓说明书CN101982420ACN101982422A4/10页7度水杨酸的响应。0038图9A和9B是磁性生物传感器不动杆菌ACINETOBACTERSPADPWH_ALK对海水中不同浓度石油的响应。0039图10是磁性生物传感器不动杆菌ACINETOBACTERSPADPWH_TOL对水中不同浓度甲苯的响应。0040图11是磁性生物传感器不动杆菌ACINETOBACTER。

22、SPADPWH_LUX对土壤不同水杨酸含量的响应。具体实施方式0041实施1磁性纳米颗粒溶液的制备0042将20ML浓度为10M的FECL3溶液加入到试管中，缓慢加入05ML浓度为20M的FECL2溶液，搅拌均匀。逐滴缓慢加入25ML浓度为10M的氯化铵溶液，同时1000RPM转速快速搅拌，直至出现黑色沉淀。使用磁体回收该沉淀，弃去上清液，加入等体积纯水。反复重复磁体回收过程，直至上清液PH值为70，获得含有磁性纳米颗粒水溶液。0043取100MG聚烯丙基胺盐酸盐POLYALLYLAMINEHYDROCHLORIDE，PAH，加入至100ML纯水中，配置浓度为100G/L的聚烯丙基胺盐酸盐水溶。

23、液。取10ML该聚烯丙基胺盐酸盐水溶液，加入10ML上述步骤中制备得到的磁性纳米颗粒水溶液，40KHZ超声波条件下振荡10分钟，3000RPM条件下离心10分钟，弃去上清液。加入等体积纯水，重复上述超声、离心、弃去上清液过程。再次加入等体积纯水，获得磁性纳米颗粒溶液。0044实施2磁性纳米颗粒溶液的制备0045将20ML浓度为10M的FECL3溶液加入到试管中，缓慢加入05ML浓度为20M的FECL2溶液，搅拌均匀。逐滴缓慢加入25ML浓度为10M的氯化铵溶液，同时1000RPM转速快速搅拌，直至出现黑色沉淀。使用磁体回收该沉淀，弃去上清液，加入等体积纯水。反复重复磁体回收过程，直至上清液PH。

24、值为70，获得含有磁性纳米颗粒的水溶液。0046取100MG聚烯丙基胺盐酸盐POLYALLYLAMINEHYDROCHLORIDE，PAH，加入至100ML纯水中，配置浓度为100G/L的聚烯丙基胺盐酸盐水溶液。取10ML该聚烯丙基胺盐酸盐水溶液，加入10ML上述步骤中制备得到的磁性纳米颗粒水溶液，20KHZ超声波条件下振荡5分钟，2000RPM条件下离心5分钟，弃去上清液。加入等体积纯水，重复上述超声、离心、弃去上清液过程。再次加入等体积纯水，获得磁性纳米颗粒溶液。0047实施3磁性纳米颗粒溶液的制备0048将20ML浓度为10M的FECL3溶液加入到试管中，缓慢加入05ML浓度为20M的F。

25、ECL2溶液，搅拌均匀。逐滴缓慢加入25ML浓度为10M的氯化铵溶液，同时1000RPM转速快速搅拌，直至出现黑色沉淀。使用磁体回收该沉淀，弃去上清液，加入等体积纯水。反复重复磁体回收过程，直至上清液PH值为70，获得含有磁性纳米颗粒的水溶液。0049取100MG聚烯丙基胺盐酸盐POLYALLYLAMINEHYDROCHLORIDE，PAH，加入至100ML纯水中，配置浓度为100G/L的聚烯丙基胺盐酸盐水溶液。取10ML该聚烯丙基胺盐酸盐水溶液，加入10ML上述步骤中制备得到的磁性纳米颗粒水溶液，120KHZ超声波条件下振荡20分钟，6000RPM条件下离心20分钟，弃去上清液。加入等体积纯。

26、水，重复上述超声、离心、弃去上清液过程。再次加入等体积纯水，获得磁性纳米颗粒溶液。说明书CN101982420ACN101982422A5/10页80050参考图1，实施例13中所制得的磁性纳米颗粒溶液的透射电子显微镜TEM照片显示该磁性纳米颗粒几乎都是球形形状并且氧化铁颗粒的大小分布是1521NM之间，包括端值。0051实施4磁性生物传感器不动杆菌ACINETOBACTERSPADPWH_LUX的制备00521细胞培养0053生物传感器不动杆菌ACINETOBACTERSPADPWH_LUX购自惟馨雨生物技术有限公司或根据现有技术公开的文献HUANGWEETALCHROMOSOMALLYLO。

27、CATEDGENEFUSIONSCONSTRUCTEDINACINETOBACTERSPADP1FORTHEENVIRONMENTALDETECTIONOFSALICYLATEENVIRONMICROBIOL7，13391348，2005所述方法构建单菌落接种至LB液体培养基LB，30培养过夜后，取10ML菌液CFU5108CELLS/ML，3000RPM离心10分钟，弃去上清液，加入等体积纯水。使用涡旋振荡器使细胞混合均匀，再次3000RPM离心10分钟，弃去上清液，加入1ML纯水浓缩，该细胞悬浮液浓度约为5109CELLS/ML。00542磁性纳米颗粒溶液制备0055如实施例1所述。005。

28、6另取10ML聚烯丙基胺盐酸盐水溶液，加入10ML纯水，40KHZ超声波条件下振荡10分钟，3000RPM条件下离心10分钟，弃去上清液。加入等体积纯水，重复上述超声、离心、弃去上清液过程。再次加入等体积纯水，获得聚烯丙基胺盐酸盐水溶液阴性对照。00573磁性生物传感器构建0058取500L步骤1中制备的细胞悬浮液，加入45ML步骤2中制备的磁性纳米颗粒溶液。30条件下震荡培养30分钟。使用磁体置于试管侧壁10分钟，回收已结合磁性纳米颗粒的生物传感器，弃去上清液，加入等体积纯水，使用漩涡振荡器是细胞混合均匀。上述磁体回收步骤重复三次，最后将所获得磁性物质溶解于等体积液体矿质培养基1升液体矿物质。

29、培养基含有25GNA2HPO4、25GKH2PO4、10GNH4CL、01GMGSO47H2O、10L饱和CACL2溶液、10L饱和FESO4溶液和1MLBAUCHOPELSDEN溶液中，获得磁性生物传感器不动杆菌ACINETOBACTERSPADPWH_LUX。0059另取500L步骤1中获得的生物传感器细胞悬浮液，加入45ML步骤2中制备的聚烯丙基胺盐酸盐水溶液阴性对照。30条件下震荡培养30分钟。使用3000RPM离心10分钟，加入等体积纯水，使用漩涡振荡器是细胞混合均匀。上述离心回收步骤重复三次，最后将所获得沉淀溶解于等体积液体矿质培养基中，获得无磁性纳米颗粒的生物传感器不动杆菌ACI。

30、NETOBACTERSPADPWH_LUX阴性对照。0060实施5磁性生物传感器不动杆菌ACINETOBACTERSPADPWH_ALK的制备00611细胞培养0062生物传感器不动杆菌ACINETOBACTERSPADPWH_ALK购自惟馨雨生物技术有限公司单菌落接种至含有10MG/L卡那霉素的LB液体培养基LBK，30培养过夜后，取10ML菌液CFU5108CELLS/ML，3000RPM离心10分钟，弃去上清液，加入等体积纯水。使用涡旋振荡器使细胞混合均匀，再次3000RPM离心10分钟，弃去上清液，加入1ML纯水浓缩，该细胞悬浮液浓度约为5109CELLS/ML。00632磁性纳米颗粒。

31、溶液制备0064如实施例2所述。说明书CN101982420ACN101982422A6/10页900653磁性生物传感器构建0066取500L步骤1中获得的生物传感器细胞悬浮液，加入45ML步骤2制备的磁性纳米颗粒溶液。30条件下震荡培养30分钟。使用磁体置于试管侧壁10分钟，回收已结合磁性纳米颗粒的生物传感器，弃去上清液，加入等体积纯水，使用漩涡振荡器是细胞混合均匀。上述磁体回收步骤重复三次，最后将所获得磁性物质溶解于等体积液体矿质培养基1升液体矿物质培养基含有25GNA2HPO4、25GKH2PO4、10GNH4CL、01GMGSO47H2O、10L饱和CACL2溶液、10L饱和FESO。

32、4溶液和1MLBAUCHOPELSDEN溶液中，获得磁性生物传感器不动杆菌ACINETOBACTERSPADPWHALK。0067另取500L步骤1中获得的生物传感器细胞悬浮液，加入45ML实施例4步骤2中制备的聚烯丙基胺盐酸盐水溶液阴性对照。30条件下震荡培养30分钟。使用3000RPM离心10分钟，加入等体积纯水，使用漩涡振荡器是细胞混合均匀。上述离心回收步骤重复三次，最后将所获得沉淀溶解于等体积液体矿质培养基1升液体矿物质培养基含有25GNA2HPO4、25GKH2PO4、10GNH4CL、01GMGSO47H2O、10L饱和CACL2溶液、10L饱和FESO4溶液和1MLBAUCHOP。

33、ELSDEN溶液中，获得无磁性纳米颗粒的生物传感器不动杆菌ACINETOBACTERSPADPWH_ALK阴性对照。0068实施例6磁性生物传感器不动杆菌ACINETOBACTERSPADPWH_TOL的制备00691细胞培养0070磁性生物传感器不动杆菌ACINETOBACTERSPADPWH_TOL购自惟馨雨生物技术有限公司或根据现有技术公开的文献HUANGWEETALCHARACTERIZINGTHEREGULATIONOFTHEPUPROMOTERINACINETOBACTERBAYLYIADP1ENVIRONMICROBIOL10，16681680，2008所述方法构建单菌落接种至含。

34、有10MG/L卡那霉素的LB液体培养基LBK，30培养过夜后，取10ML菌液CFU5108CELLS/ML，3000RPM离心10分钟，弃去上清液，加入等体积纯水。使用涡旋振荡器使细胞混合均匀，再次3000RPM离心10分钟，弃去上清液，加入1ML纯水浓缩，该细胞悬浮液浓度约为5109CELLS/ML。00712磁性纳米颗粒溶液制备0072如实施例3所述。00733磁性生物传感器构建0074取500L步骤1中获得的生物传感器悬浮液，加入45ML步骤2中制备的磁性纳米颗粒溶液。30条件下震荡培养30分钟。使用磁体置于试管侧壁10分钟，回收已结合磁性纳米颗粒的生物传感器，弃去上清液，加入等体积纯水。

35、，使用漩涡振荡器是细胞混合均匀。上述磁体回收步骤重复三次，最后将所获得磁性物质溶解于等体积液体矿质培养基中，获得磁性生物传感器不动杆菌ACINETOBACTERSPADPWH_TOL。0075另取500L步骤1中获得的生物传感器悬浮液，加入45ML实施例4步骤2中制备的聚烯丙基胺盐酸盐水溶液阴性对照。30条件下震荡培养30分钟。使用3000RPM离心10分钟，加入等体积纯水，使用漩涡振荡器是细胞混合均匀。上述离心回收步骤重复三次，最后将所获得沉淀溶解于等体积液体矿质培养基1升液体矿物质培养基含有25GNA2HPO4、25GKH2PO4、10GNH4CL、01GMGSO47H2O、10L饱和CA。

36、CL2溶液、10L饱和FESO4溶液和1MLBAUCHOPELSDEN溶液中，获得无磁性纳米颗粒的生物传感器不动杆菌ACINETOBACTERSPADPWH_TOL阴性对照。说明书CN101982420ACN101982422A7/10页100076实施例7磁性生物传感器不动杆菌ACINETOBACTERSPADPWH_LUX的特性0077对实施例4的磁性生物传感器不动杆菌ACINETOBACTERSPADPWH_LUX做如下实验，实验过程及结果如下0078磁性生物传感器不动杆菌ACINETOBACTERSPADPWH_LUX悬浮状态图2左图与普通细胞悬浊液无显著差异，在磁体吸附状态图2右图下。

37、，磁性生物传感器不动杆菌ACINETOBACTERSPADPWH_LUX可被有效富集和回收。证明了磁性纳米颗粒溶液使得生物传感器不动杆菌ACINETOBACTERSPADPWH_LUX具有了磁性。0079如图3所示，薄片法的磁性生物传感器不动杆菌ACINETOBACTERSPADPWH_LUX的透射电子显微镜照片显示磁性纳米颗粒粘附于细胞表面。如图4所示，图3中部分放大的图像显示磁性纳米颗粒都粘附于细胞外壁上，在胞质中没有发现磁性纳米颗粒。此外，如图5所示，磁性生物传感器不动杆菌ACINETOBACTERSPADPWH_LUX的表面电子能谱EDX证实了细胞壁上氧化铁纳米颗粒的存在。0080然后。

38、用磁性和非磁性的生物传感器不动杆菌ACINETOBACTERSPADPWH_LUX的平板计数来估测该磁性生物传感器不动杆菌ACINETOBACTERSPADPWH_LUX的效率。0081计数结果是磁性生物传感器不动杆菌ACINETOBACTERSPADPWH_LUX的数量是222010108CUF/ML，非磁性生物传感器不动杆菌ACINETOBACTERSPADPWH_LUX细胞数量是800051104CUF/ML图6，表明磁性化生物传感器不动杆菌ACINETOBACTERSPADPWH_LUX的效率是9996001。因为，通过在琼脂糖板上菌落计数来计数磁性生物传感器不动杆菌ACINETOBA。

39、CTERSPADPWH_LUX的数量，因此，该实验也表明磁性化的细菌细胞还是活的，因此该磁性生物传感器是生物相容性的。在PAH中分散的磁性纳米颗粒不能进入胞质解释了高水平存活率的原因。并且我们也检查了磁性化细胞的生长和分裂，图7表明在30温育120分钟期间，非磁性化的细胞数量从0增加到12，这证明了磁性化的细胞能够正常分裂和生长。0082对实施例5和6中制得的磁性生物传感器不动杆菌ACINETOBACTERSPADPWH_ALK和不动杆菌ACINETOBACTERSPADPWH_TOL做了相同的实验，实验过程及结果相同。0083实施例8磁性生物传感器不动杆菌ACINETOBACTERSPADP。

40、WH_LUX对水中水杨酸含量的检测00841样品准备0085称取1601MG水杨酸钠，加入到100ML纯水中，得到浓度为10MM的水杨酸钠储备溶液。分别上述获得的水杨酸钠溶液按比例用纯水稀释，配置浓度为50NM、100NM、1M、10M和100M的水杨酸钠溶液。0086称取2702G六水合丁二酸钠，加入到100ML纯水中，使用022M滤膜MILLIPORE过滤，得到无菌丁二酸钠储备溶液，该溶液丁二酸钠浓度为1M。00872样品测试0088取176L实施例4中获得的磁性生物传感器和无磁性阴性对照的生物传感器，加入黑色底透的96孔酶标板美国CORNINGCOSTAR公司孔内。每孔内分别加入4L丁二。

41、酸那储备溶液和20L上述系列水杨酸钠溶液，使用纯水作为阴性对照CONTROL，每组测试包括三个平行样。0089使用多功能酶标仪型号SYNERGY2，美国BIOTEK公司对96孔酶标板内生物发说明书CN101982420ACN101982422A8/10页11光强度进行测量。培养温度为30，每10分钟进行一次测量，每次测量前振荡1分钟以保证细胞混合均匀。00903数据处理0091计算步骤2中测试过程所获得的每种生物传感器三组平行样均值，获得每种生物传感器阴性对照与诱导组不同时刻生物发光强度。每种生物传感器诱导组不同时刻生物发光强度除以对应时刻阴性对照组生物发光强度，获得每种生物传感器诱导组不同时。

42、刻生物发光相对倍数。取每种生物传感器诱导组不同时刻生物发光相对倍数峰值及其前后各2个时间点生物发光相对倍数，计算平均值，获得该生物传感器生物发光响应倍数。0092磁性生物传感器不动杆菌ACINETOBACTERSPADPWH_LUX对水中不同浓度水杨酸的响应如图8所示。测试结果表明，磁性生物传感器不动杆菌ACINETOBACTERSPADPWH_LUX与原生物传感器均对水杨酸有显著响应，生物发光响应倍数随水杨酸浓度增加而增强。两种生物传感器对相同浓度水杨酸溶液的响应无显著差异，表明磁性生物传感器不动杆菌ACINETOBACTERSPADPWH_LUX可以有效识别并对水溶液中水杨酸产生定量响应。。

43、0093实施例8磁性生物传感器不动杆菌ACINETOBACTERSPADP_ALK对海水中石油含量的检测。00941样品准备0095分别125L英国北海布伦特原油和伊朗锡里岛原油，溶解于100ML海水中，使用40KHZ超声波振荡30秒，摇匀，该乳浊液含有石油浓度为100MG/L。将该乳浊液按不同比例使用海水稀释，配制浓度为01、02、1、2、10、20、100MG/L的系列石油海水溶液。0096称取2702G六水合丁二酸钠，加入到100ML纯水中，使用022M滤膜MILLIPORE过滤，得到无菌丁二酸钠储备溶液，该溶液丁二酸钠浓度为1M。00972样品测试0098取20L实施例5中制得的磁性生。

44、物传感器和无磁性阴性对照生物传感器的悬浮液，加入黑色底透的96孔酶标板美国CORNINGCOSTAR公司孔内。每孔内分别加入4L丁二酸那储备溶液和176L上述系列石油水溶液，使用纯水作为阴性对照CONTROL，每组测试包括三个平行样。0099使用多功能酶标仪型号SYNERGY2，美国BIOTEK公司对96孔酶标板内生物发光强度进行测量。培养温度为30，每10分钟进行一次测量，每次测量前振荡1分钟以保证细胞混合均匀。01003数据处理0101计算步骤2中测试过程所获得的每种生物传感器三组平行样均值，获得每种生物传感器阴性对照与诱导组不同时刻生物发光强度。每种生物传感器诱导组不同时刻生物发光强度除。

45、以对应时刻阴性对照组生物发光强度，获得每种生物传感器诱导组不同时刻生物发光相对倍数。取每种生物传感器诱导组不同时刻生物发光相对倍数峰值及其前后各2个时间点生物发光相对倍数，计算平均值，获得该生物传感器生物发光响应倍数。0102磁性生物传感器不动杆菌ACINETOBACTERSPADPWH_ALK对海水中不同浓度石油的响应如图9A、9B所示。测试结果表明，磁性生物传感器不动杆菌ACINETOBACTERSPADPWH_ALK与原生物传感器均对海水中不同浓度的原油有显著响应，生物发光响应倍数随说明书CN101982420ACN101982422A9/10页12原油浓度增加而增强。相同石油浓度条件下。

46、，磁性生物传感器生物发光响应倍数显著低于原生物传感器，这可能是由于磁性生物传感器表面聚丙烯基胺高分子膜对非极性分子传质的阳碍作用，但两种生物传感器对原油的检测限相同，表明磁性生物传感器ACINETOBACTERSPADPWH_ALK可以有效识别并对海水中原油产生定量响应。0103实施例9磁性生物传感器ACINETOBACTERSPADPWH_TOL对水中甲苯含量的检测01041样品准备0105取甲苯20L加入到100ML纯水中，40KHZ超声波30秒，得到甲苯饱和储备溶液，浓度为600M。将该乳浊液按不同比例使用纯水稀释，配制浓度为6、60和600M的系列甲苯溶液。0106称取2702G六水合。

47、丁二酸钠，加入到100ML纯水中，使用022M滤膜MILLIPORE过滤，得到无菌丁二酸钠储备溶液，该溶液丁二酸钠浓度为1M。01072样品测试0108取20L实施例6中获得的磁性生物传感器和无磁性阴性对照生物传感器悬浮液，加入黑色底透的96孔酶标板美国CORNINGCOSTAR公司孔内。每孔内分别加入4L丁二酸那储备溶液和176L上述系列甲苯水溶液，使用纯水作为阴性对照CONTROL，每组测试包括三个平行样。0109使用多功能酶标仪型号SYNERGY2，美国BIOTEK公司对96孔酶标板内生物发光强度进行测量。培养温度为30，每10分钟进行一次测量，每次测量前振荡1分钟以保证细胞混合均匀。0。

48、1103数据处理0111计算步骤2中测试过程所获得的每种生物传感器三组平行样均值，获得每种生物传感器阴性对照与诱导组不同时刻生物发光强度。每种生物传感器诱导组不同时刻生物发光强度除以对应时刻阴性对照组生物发光强度，获得每种生物传感器诱导组不同时刻生物发光相对倍数。取每种生物传感器诱导组不同时刻生物发光相对倍数峰值及其前后各2个时间点生物发光相对倍数，计算平均值，获得该生物传感器生物发光响应倍数。0112磁性生物传感器不动杆菌ACINETOBACTERSPADPWH_TOL对水中不同浓度甲苯的响应如图10所示。测试结果表明，磁性生物传感器ACINETOBACTERSPADPWH_TOL与原生物传。

49、感器均对甲苯有显著响应，生物发光响应倍数随甲苯浓度增加而增强。两种生物传感器对相同浓度甲苯溶液的响应无显著差异，表明磁性生物传感器不动杆菌ACINETOBACTERSPADPWH_LUX可以有效识别并对水溶液中甲苯产生定量相应。0113实施例10磁性生物传感器不动杆菌ACINETOBACTERSPADPWH_LUX对土壤水杨酸含量的检测01141细胞培养0115不动杆菌ACINETOBACTERSPADPWH_LUX单菌落接种至LB液体培养基LB，30培养过夜后，取10ML菌液CFU5108CELLS/ML，3000RPM离心10分钟，弃去上清液，加入等体积纯水。使用涡旋振荡器使细胞混合均匀，再次3000RPM离心10分钟，弃去上清液，加入1ML纯水浓缩，该细胞悬浮液浓度约为5109CELLS/ML。01162磁性生物传感器构建说明书CN101982420ACN101982422A10/10页130117取500L步骤1中获得的细胞悬浮液，加入45ML实施例1中制备的磁性纳米颗粒溶液。30条件下震荡培养30分钟。使用磁体置于试管侧壁10分钟，回收已结合磁性纳米颗粒的生物传感器，弃去上清液，加入等体积纯水，使用漩涡振荡器是细胞混合均匀。上述磁体回收步骤重复三次。

摘要
申请专利号：	CN201010513790.5	申请日：	2010.10.20
公开号：	CN101982420A	公开日：	2011.03.02
当前法律状态：	授权	有效性：	有权
法律详情：	专利权的转移IPC(主分类):C12Q 1/02登记生效日:20160524变更事项:专利权人变更前权利人:北京惟馨雨生物科技有限公司变更后权利人:上海合森生物科技有限公司变更事项:地址变更前权利人:100084 北京市海淀区成府路文津国际公寓1201室变更后权利人:201802 上海市嘉定区众仁路399号1幢B区5楼5309室\|\|\|授权\|\|\|实质审查的生效IPC(主分类):C01G 49/06申请日:20101020\|\|\|公开
IPC分类号：	C01G49/06; C12Q1/02	主分类号：	C01G49/06
申请人：	北京惟馨雨生物科技有限公司
发明人：	曾雨; 黄巍; 张大奕; 拉威尔·法克鲁林; 穆斯塔法·奥兹曼; 维塞林·保诺夫
地址：	100084 北京市海淀区成府路文津国际公寓1201室
优先权：
专利代理机构：	北京市德权律师事务所 11302	代理人：	王建国
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内容摘要

本发明公开了一种分散在聚丙烯胺的盐酸盐水溶液中的磁性纳米颗粒溶液。制备磁性纳米颗粒溶液的方法，包括下列步骤：利用共沉积法合成磁性纳米颗粒；利用超声分散法在溶剂中分散磁性纳米颗粒，得到磁性纳米颗粒溶液；其特征在于所述的溶剂为聚丙烯胺的盐酸盐水溶液。本发明也公开了利用该磁性纳米颗粒溶液制备磁性生物传感器的方法及在制备磁性生物传感器的应用。本发明磁性纳米颗粒溶液制备的磁性生物传感器，保持该生物传感器活性达到99.95％-99.97％，可保留原生物传感器对特定底物的定量响应强度和检测灵敏度，同时可以通过磁体回收将生物传感器从水体或土壤样品中分离，为生物传感器在环境检测与医药领域的应用提供了技术支持。

权利要求书

1：一种磁性纳米颗粒溶液，该磁性纳米颗粒分散在溶剂中，其特征在于：所述的溶剂是聚丙烯胺的盐酸盐水溶液。
2：根据权利要求 1 所述的磁性纳米颗粒溶液，其特征在于：所述的磁性纳米颗粒是直径为 15-21nm 的氧化铁。
3：一种制备磁性纳米颗粒溶液的方法，该方法包括下列步骤： a. 利用共沉积法合成磁性纳米颗粒； b. 利用超声分散法在溶剂中分散磁性纳米颗粒，得到磁性纳米颗粒溶液；其特征在于：所述的溶剂为聚丙烯胺的盐酸盐水溶液。
4：根据权利要求 3 所述的制备磁性纳米颗粒溶液的方法，其特征在于：所述的磁性纳米颗粒是直径为 15-21nm 的氧化铁。
5：根据权利要求 4 所述的制备磁性纳米颗粒溶液的方法，其特征在于：步骤 b 的超声分散法在溶剂中分散磁性纳米颗粒包括下列步骤：向步骤 a 中制得的磁性纳米颗粒中加纯水，制得磁性纳米颗粒水溶液，在聚丙烯胺的盐酸盐水溶液中加入磁性纳米颗粒水溶液，在超声条件下震荡，离心，弃去上清液，加入等体积纯水，在超声条件下震荡，离心，弃去上清液，再次加入等体积纯水，获得磁性纳米颗粒溶液。
6：根据权利要求 5 所述的制备磁性纳米颗粒溶液的方法，其特征在于：步骤 b 的超声分散法在溶剂中分散磁性纳米颗粒包括下列步骤：向步骤 a 中制得的磁性纳米颗粒中加纯水，制得磁性纳米颗粒水溶液，在聚丙烯胺的盐酸盐水溶液中加入磁性纳米颗粒水溶液，在 20KHz 至 120KHz 超声条件下震荡 5-20 分钟， 2000rpm 至 6000rpm 下离心 5-20 分钟，弃去上清液，加入等体积纯水，在 20KHz 至 120KHz 超声条件下震荡 5-20 分钟， 2000rpm 至 6000rpm 下离心 5-20 分钟，弃去上清液，再次加入等体积纯水，获得磁性纳米颗粒溶液。
7：一种磁性生物传感器的构建方法，该方法包括下列步骤： a. 接种生物传感器的单菌落于液体培养基中，获得细胞悬浮液。 b. 利用共沉积法合成磁性纳米颗粒； c. 利用超声分散法在溶剂中分散磁性纳米颗粒，得到磁性纳米颗粒溶液； d. 将步骤 a 制得的细胞悬浮液与步骤 c 制得的磁性纳米颗粒溶液共培养，磁体回收已经结合磁性纳米颗粒的生物传感器，得到磁性生物传感器；其特征在于：步骤 c 中所述的溶剂为聚丙烯胺的盐酸盐水溶液。
8：根据权利要求 7 所述的磁性生物传感器的构建方法，其特征在于：所述的磁性纳米颗粒是直径为 15-21nm 的氧化铁。
9：根据权利要求 8 所述的磁性生物传感器的构建方法，其特征在于：步骤 c 的超声分散法在溶剂中分散磁性纳米颗粒包括下列步骤：向步骤 b 中制得的磁性纳米颗粒中加纯水，制得磁性纳米颗粒水溶液，在聚丙烯胺的盐酸盐水溶液中加入磁性纳米颗粒水溶液，在超声条件下震荡，离心，弃去上清液，加入等体积纯水，在超声条件下震荡，离心，弃去上清液，再次加入等体积纯水，获得磁性纳米颗粒溶液。
10：根据权利要求 9 所述的磁性生物传感器的构建方法，其特征在于：步骤 c 的超声分散法在溶剂中分散磁性纳米颗粒包括下列步骤：向步骤 b 中制得的磁性纳米颗粒中加纯水，制得磁性纳米颗粒水溶液，在聚丙烯胺的盐酸盐水溶液中加入磁性纳米颗粒水溶液，在 20KHz 至 120KHz 超声条件下震荡 5-20 分钟， 2000rpm 至 6000rpm 下离心 5-20 分钟，弃去上 2 清液，加入等体积纯水，在 20KHz 至 120KHz 超声条件下震荡 5-20 分钟， 2000rpm 至 6000rpm 下离心 5-20 分钟，弃去上清液，再次加入等体积纯水，获得磁性纳米颗粒溶液。
11：根据权利要求 7 至 10 中任一权利要求所述的磁性生物传感器的构建方法，其特征在于：所述的生物传感器选自：不动杆菌 (Acinetobacter sp.)ADPWH_lux、不动杆菌 (Acinetobacter sp.)ADPWH_Tol 和不动杆菌 (Acinetobacter sp.)ADPWH_alk。
12：权利要求 1 或 2 所述的磁性纳米颗粒溶液用于制备磁性生物传感器的应用。

说明书

磁性纳米颗粒溶液、其制备方法及用途
    技术领域本发明涉及一种磁性纳米颗粒溶液，以及该磁性纳米颗粒溶液的制备方法，磁性生物传感器的构建方法，及该磁性纳米颗粒溶液的用途。
     背景技术
     社会各行业在生产、运输、使用和处置过程中，往往伴随着大量具有环境风险的污染物残留、泄露和排放。近年来，随着我国工业、农业和市政建设的快速发展，由上述污染物所导致的环境污染事故层出不穷，受污染场地的数目与面积逐年扩大，对人民生活健康造成了重大威胁。在这些污染物中，以农药和石油化工产品为代表的复杂持久性有机污染物具有痕量、广泛存在和种类繁多等特点，给环境监测与风险评价提出了巨大的挑战。现有的传统化学分析方法面对复杂持久性有机污染物，具有操作繁琐 ( 复杂的预处理过程 )、耗时较长 ( 几小时至几天时间 )、设备昂贵和成本较高等缺点，并且无法有效评价复合污染条件下的生物毒性与环境生态风险。这些问题严重制约了相关污染场地的环境评估和风险评价，限制了突发性环境应急事故的快速评估，为新型检测技术，特别是以生物传感器 (biosensor) 为代表的生物快速检测技术的发展提供了良好的契机。
     据相关行业报告表明，英国环境监测市场目前已达到 5.9 亿英镑 (60 亿人民币 ) 的规模 (Environmental KTN report， 2008)。其中，快速检测技术所涵盖的市场份额达到 2 亿英镑 (20 亿人民币 )。而从全球范围来看，最新的全球市场分析报告 (GlobalIndustry Analysts， Inc.) 预测生物传感器市场价值在 2012 年之前可以达到 61 亿美元 (400 亿人民币 )。现有中国经济的高速发展已经付出了高昂的环境代价，这主要体现在污染场地带来的生态修复与人体健康问题、工业搬迁场地引发的二次开发问题和突发性环境事故导致的预警应急问题等。这些问题都伴随着对环境监测与风险评价的更高要求，表明中国政府对新型环境检测技术具有迫切的需求，预示着生物快速检测技术在中国具有广阔的市场。
     生物细胞传感器以活体微生物细胞作为宿主，可以真实的评价环境中目标物质的生物效应 ( 生物可利用性 )，检测方法简单易行，可直接应用于水样，具有稳定性和可靠性，与传统分析方法相比具有高度的准确性。而其低成本和快速响应的特点，可以满足此领域市场的需要，兼备操作简单和可实现定量测定等优点。但与此同时，生物细胞传感器由于受到自身特点的限制，具有难回收和难操控等问题。首先，由于活体生物细胞传感器本身具备生物活性，可以在自然环境中增殖与运动，因此一旦投入被检测或应用环境中，难以同土著微生物进行区别，更难以回收，其自身携带的目标基因、调控基因或报道基因存在巨大的环境风险。其次，对于土壤等复杂环境样品的分析，往往需要在检测过程中将样品与生物传感器分离，以避免复杂介质对检测信号的影响。
     磁性纳米颗粒是一种有效的远距离操纵工具，通过将磁性纳米颗粒与有机或无机材料结合，可以实现通过磁场对相应材料的运动进行远距离控制，已在微晶体和碳纳米管研究领域受到了广泛关注。在微生物学领域，已有研究成功将磁性纳米颗粒固定在活体酵母细胞，但应用于活体细菌细胞的研究尚未见报道，其面临的技术问题主要包括如何在固定化过程中保持细胞活性。发明内容本发明的目的是提供一种可以与生物传感器结合，同时保持该生物传感器活性，并使生物传感器具有磁性，便于检测回收的磁性纳米颗粒溶液，其制备方法及应用。
     为了达到上述目的，本发明提供了一种磁性纳米颗粒溶液，该磁性纳米颗粒分散在溶剂中，其特征在于所述的溶剂是聚丙烯胺的盐酸盐水溶液。
     本发明的磁性纳米颗粒溶液，其特征在于所述的磁性纳米颗粒是直径为 15-21nm 的氧化铁。
     本发明还提供了一种制备磁性纳米颗粒溶液的方法，该方法包括下列步骤：
     a. 利用共沉积法合成磁性纳米颗粒；
     b. 利用超声分散法在溶剂中分散磁性纳米颗粒，得到磁性纳米颗粒溶液；
     其特征在于：所述的溶剂为聚丙烯胺的盐酸盐水溶液。
     本发明的制备磁性纳米颗粒溶液的方法，其进一步特征在于：所述的磁性纳米颗粒是直径为 15-21nm 的氧化铁。
     本发明的制备磁性纳米颗粒溶液的方法，其进一步特征在于：步骤 b 所述的超声分散法在溶剂中分散磁性纳米颗粒包括下列步骤：向步骤 a 所制得的磁性纳米颗粒中加纯水，制得磁性纳米颗粒水溶液，在聚丙烯胺的盐酸盐水溶液中加入磁性纳米颗粒水溶液，在超声条件下震荡，离心，弃去上清液，加入等体积纯水，在超声条件下震荡，离心，弃去上清液，再次加入等体积纯水，获得磁性纳米颗粒溶液。
     本发明的制备磁性纳米颗粒溶液的方法，其进一步特征在于：步骤 b 所述的超声分散法在溶剂中分散磁性纳米颗粒包括下列步骤：向步骤 a 所制得的磁性纳米颗粒中加纯水，制得磁性纳米颗粒水溶液，在聚丙烯胺的盐酸盐水溶液中加入磁性纳米颗粒水溶液，在 20KHz 至 120KHz 超声条件下震荡 5-20 分钟， 2000rpm 至 6000rpm 下离心 5-20 分钟，弃去上清液，加入等体积纯水，在 20KHz 至 120KHz 超声条件下震荡 5-20 分钟， 2000rpm 至 6000rpm 下离心 5-20 分钟，弃去上清液，再次加入等体积纯水，获得磁性纳米颗粒溶液。
     本发明还提供了一种磁性生物传感器的构建方法，该方法包括下列步骤：
     a. 接种生物传感器的单菌落于液体培养基中，获得细胞悬浮液；
     b. 利用共沉积法合成磁性纳米颗粒；
     c. 利用超声分散法在溶剂中分散磁性纳米颗粒，获得磁性纳米颗粒溶液；
     d. 将步骤 a 制得的细胞悬浮液与步骤 c 制得的磁性纳米颗粒溶液共培养，磁体回收已经结合磁性纳米颗粒的生物传感器，制得磁性生物传感器；
     其特征在于：步骤 c 中所述的溶剂为聚丙烯胺的盐酸盐水溶液。
     本发明的磁性生物传感器的构建方法，其进一步特征在于：所述的磁性纳米颗粒是直径为 15-21nm 的氧化铁。
     本发明的磁性生物传感器的构建方法，其进一步特征在于：步骤 c 所述的超声分散法在溶剂中分散磁性纳米颗粒包括下列步骤：向步骤 b 中所制得的磁性纳米颗粒中加纯水，制得磁性纳米颗粒水溶液，在聚丙烯胺的盐酸盐水溶液中加入磁性纳米颗粒水溶液，在超声条件下震荡，离心，弃去上清液，加入等体积纯水，在超声条件下震荡，离心，弃去上清
     液，再次加入等体积纯水，获得磁性纳米颗粒溶液。
     本发明的磁性生物传感器的构建方法，其进一步特征在于：步骤 c 所述的超声分散法在溶剂中分散磁性纳米颗粒包括下列步骤：向步骤 b 中所制得的磁性纳米颗粒中加纯水，制得磁性纳米颗粒水溶液，在聚丙烯胺的盐酸盐水溶液中加入磁性纳米颗粒水溶液，在 20KHz 至 120KHz 超声条件下震荡 5-20 分钟， 2000rpm 至 6000rpm 下离心 5-20 分钟，弃去上清液，加入等体积纯水，在 20KHz 至 120KHz 超声条件下震荡 5-20 分钟， 2000rpm 至 6000rpm 下离心 5-20 分钟，弃去上清液，再次加入等体积纯水，获得磁性纳米颗粒溶液。
     本发明的磁性生物传感器的构建方法，其进一步特征在于：所述的的生物传感器选自：不动杆菌 (Acinetobacter sp,)ADPWH_lux、不动杆菌 (Acinetobacter sp.)ADPWH_ Tol 和不动杆菌 (Acinetobacter sp.)ADPWH_alk。
     进一步，本发明还提供了磁性纳米颗粒溶液用于制备磁性生物传感器的应用。本发明的磁性生物传感器检测水体或土壤样品中污染物的应用，是将所述的磁性生物传感器与水体或土壤样品混合，培养所述磁性生物传感器，通过检测报道基因表达产物的发光强度来直接定量检测土壤样品污染物含量。其中使用多功能酶标仪作为检测仪器，使用磁体回收磁性生物传感器，所述培养温度为 30℃。本发明的磁性纳米颗粒溶液与生物传感器结合，制备磁性生物传感器，可以同时保持该生物传感器活性达到 99.95％ -99.97％，可保留原生物传感器对特定底物的定量响应强度和检测灵敏度，同时可以通过磁体回收的方法将磁性生物传感器从水体或土壤样品中分离，有效增强了生物传感器的使用范围，为生物传感器在环境检测与医药领域的应用提供了技术支持。
     为了更好地理解本发明，现在结合附图及具体实施例对本发明进行详细地说明。
     在此需要说明的是本发明所用的生物材料、试剂、仪器如无特别说明均属于本领域常规的生物材料、试剂、仪器，均可以通过商业途径购得。本发明中所使用的培养基及方法如无特别说明，均为本领域常规的培养基及方法。
     附图说明
     图 1 是本发明制得的磁性纳米颗粒溶液的透射电子显微镜 (TEM) 照片。
     图 2 是悬浮状态 ( 左图 ) 与磁体吸附状态 ( 右图 ) 的本发明制得的磁性生物传感器不动杆菌 (Acinetobacter sp.)ADPWH_lux。
     图 3 是本发明制得的磁性生物传感器不动杆菌 (Acinetobacter sp)ADPWH_lux 薄片法的透射电子显微镜 (TEM) 照片。
     图 4 是图 3 部分区域的放大图像。
     图 5 是本发明制得的磁性生物传感器不动杆菌 (Acinetobacter sp.)ADPWH_lux 的表面电子能谱 (EDX)。
     图 6 是在琼脂糖板上菌落计数磁性生物传感器不动杆菌 (Acinetobacter sp.) ADPWH_lux 数量的图示。
     图 7 是磁性生物传感器不动杆菌 (Acinetobacter sp.)ADPWH_lux 细胞的生长和分裂的图示。
     图 8 是磁性生物传感器不动杆菌 (Acinetobacter sp.)ADPWH_lux 对水中不同浓度水杨酸的响应。
     图 9A 和 9B 是磁性生物传感器不动杆菌 (Acinetobacter sp.)ADPWH_alk 对海水中不同浓度石油的响应。
     图 10 是磁性生物传感器不动杆菌 (Acinetobacter sp.)ADPWH_Tol 对水中不同浓度甲苯的响应。
     图 11 是磁性生物传感器不动杆菌 (Acinetobacter sp.)ADPWH_lux 对土壤不同水杨酸含量的响应。具体实施方式
     实施 1 ：磁性纳米颗粒溶液的制备
     将 2.0mL 浓度为 1.0M 的 FeCl3 溶液加入到试管中，缓慢加入 0.5mL 浓度为 2.0M 的 FeCl2 溶液，搅拌均匀。逐滴缓慢加入 25mL 浓度为 1.0M 的氯化铵溶液，同时 1000rpm 转速快速搅拌，直至出现黑色沉淀。使用磁体回收该沉淀，弃去上清液，加入等体积纯水。反复重复磁体回收过程，直至上清液 pH 值为 7.0，获得含有磁性纳米颗粒水溶液。
     取 100mg 聚烯丙基胺盐酸盐 (Poly(allylamine)Hydrochloride， PAH )，加入至 10.0mL 纯水中，配置浓度为 10.0g/L 的聚烯丙基胺盐酸盐水溶液。取 10mL 该聚烯丙基胺盐酸盐水溶液，加入 1.0mL 上述步骤中制备得到的磁性纳米颗粒水溶液， 40KHz 超声波条件下振荡 10 分钟， 3000rpm 条件下离心 10 分钟，弃去上清液。加入等体积纯水，重复上述超声、离心、弃去上清液过程。再次加入等体积纯水，获得磁性纳米颗粒溶液。实施 2 ：磁性纳米颗粒溶液的制备
     将 2.0mL 浓度为 1.0M 的 FeCl3 溶液加入到试管中，缓慢加入 0.5mL 浓度为 2.0M 的 FeCl2 溶液，搅拌均匀。逐滴缓慢加入 25mL 浓度为 1.0M 的氯化铵溶液，同时 1000rpm 转速快速搅拌，直至出现黑色沉淀。使用磁体回收该沉淀，弃去上清液，加入等体积纯水。反复重复磁体回收过程，直至上清液 pH 值为 7.0，获得含有磁性纳米颗粒的水溶液。
     取 100mg 聚烯丙基胺盐酸盐 (Poly(allylamine)Hydrochloride， PAH)，加入至 10.0mL 纯水中，配置浓度为 10.0g/L 的聚烯丙基胺盐酸盐水溶液。取 10mL 该聚烯丙基胺盐酸盐水溶液，加入 1.0mL 上述步骤中制备得到的磁性纳米颗粒水溶液， 20KHz 超声波条件下振荡 5 分钟， 2000rpm 条件下离心 5 分钟，弃去上清液。加入等体积纯水，重复上述超声、离心、弃去上清液过程。再次加入等体积纯水，获得磁性纳米颗粒溶液。
     实施 3 ：磁性纳米颗粒溶液的制备
     将 2.0mL 浓度为 1.0M 的 FeCl3 溶液加入到试管中，缓慢加入 0.5mL 浓度为 2.0M 的 FeCl2 溶液，搅拌均匀。逐滴缓慢加入 25mL 浓度为 1.0M 的氯化铵溶液，同时 1000rpm 转速快速搅拌，直至出现黑色沉淀。使用磁体回收该沉淀，弃去上清液，加入等体积纯水。反复重复磁体回收过程，直至上清液 pH 值为 7.0，获得含有磁性纳米颗粒的水溶液。
     取 100mg 聚烯丙基胺盐酸盐 (Poly(allylamine)Hydrochloride， PAH)，加入至 10.0mL 纯水中，配置浓度为 10.0g/L 的聚烯丙基胺盐酸盐水溶液。取 10mL 该聚烯丙基胺盐酸盐水溶液，加入 1.0mL 上述步骤中制备得到的磁性纳米颗粒水溶液， 120KHz 超声波条件下振荡 20 分钟， 6000rpm 条件下离心 20 分钟，弃去上清液。加入等体积纯水，重复上述超声、离心、弃去上清液过程。再次加入等体积纯水，获得磁性纳米颗粒溶液。
     参考图 1，实施例 1-3 中所制得的磁性纳米颗粒溶液的透射电子显微镜 (TEM) 照片显示该磁性纳米颗粒几乎都是球形形状并且氧化铁颗粒的大小分布是 15-21nm 之间，包括端值。
     实施 4 ：磁性生物传感器不动杆菌 (Acinetobacter sp.)ADPWH_lux 的制备
     1) 细胞培养
     生物传感器不动杆菌 (Acinetobacter sp.)ADPWH_lux( 购自惟馨雨生物技术有限公司或根据现有技术公开的文献 Huang W.E.et al.Chromosomally located genefusions constructed in Acinetobacter sp.ADP1 for the environmental detection of salicylate.Environ.Microbiol.7， 1339-1348， 2005 所述方法构建 ) 单菌落接种至 LB 液体培养基 (LB)， 30℃培养过夜后，取 10mL 菌液 (CFU ＝ 5×108cells/mL)， 3000rpm 离心 10 分钟，弃去上清液，加入等体积纯水。使用涡旋振荡器使细胞混合均匀，再次 3000rpm 离心 10 9 分钟，弃去上清液，加入 1mL 纯水浓缩，该细胞悬浮液浓度约为 5×10 cells/mL。
     2) 磁性纳米颗粒溶液制备
     如实施例 1 所述。
     另取 10mL 聚烯丙基胺盐酸盐水溶液，加入 1.0mL 纯水， 40KHz 超声波条件下振荡 10 分钟， 3000rpm 条件下离心 10 分钟，弃去上清液。加入等体积纯水，重复上述超声、离心、弃去上清液过程。再次加入等体积纯水，获得聚烯丙基胺盐酸盐水溶液阴性对照。 3) 磁性生物传感器构建
     取 500μL 步骤 1) 中制备的细胞悬浮液，加入 4.5mL 步骤 2) 中制备的磁性纳米颗粒溶液。30℃条件下震荡培养 30 分钟。使用磁体置于试管侧壁 10 分钟，回收已结合磁性纳米颗粒的生物传感器，弃去上清液，加入等体积纯水，使用漩涡振荡器是细胞混合均匀。上述磁体回收步骤重复三次，最后将所获得磁性物质溶解于等体积液体矿质培养基 (1 升液体矿物质培养基含有 2.5g Na2HPO4、 2.5g KH2PO4、 1.0gNH4Cl、 0.1gMgSO4· 7H2O、 10μL 饱和 CaCl2 溶液、 10μL 饱和 FeSO4 溶液和 1mL Bauchop & Elsden 溶液 ) 中，获得磁性生物传感器不动杆菌 (Acinetobacter sp.)ADPWH_lux。
     另取 500μL 步骤 1) 中获得的生物传感器细胞悬浮液，加入 4.5mL 步骤 2) 中制备的聚烯丙基胺盐酸盐水溶液阴性对照。30℃条件下震荡培养 30 分钟。使用 3000rpm 离心 10 分钟，加入等体积纯水，使用漩涡振荡器是细胞混合均匀。上述离心回收步骤重复三次，最后将所获得沉淀溶解于等体积液体矿质培养基中，获得无磁性纳米颗粒的生物传感器不动杆菌 (Acinetobacter sp.)ADPWH_lux 阴性对照。
     实施 5 ：磁性生物传感器不动杆菌 (Acinetobacter sp.)ADPWH_alk 的制备
     1) 细胞培养
     生物传感器不动杆菌 (Acinetobacter sp.)ADPWH_alk( 购自惟馨雨生物技术有限公司 ) 单菌落接种至含有 10mg/L 卡那霉素的 LB 液体培养基 (LBK)， 30℃培养过夜后，取 8 10mL 菌液 (CFU ＝ 5×10 cells/mL)， 3000rpm 离心 10 分钟，弃去上清液，加入等体积纯水。使用涡旋振荡器使细胞混合均匀，再次 3000rpm 离心 10 分钟，弃去上清液，加入 1mL 纯水浓 9 缩，该细胞悬浮液浓度约为 5×10 cells/mL。
     2) 磁性纳米颗粒溶液制备
     如实施例 2 所述。
     3) 磁性生物传感器构建
     取 500μL 步骤 1) 中获得的生物传感器细胞悬浮液，加入 4.5mL 步骤 2) 制备的磁性纳米颗粒溶液。 30℃条件下震荡培养 30 分钟。使用磁体置于试管侧壁 10 分钟，回收已结合磁性纳米颗粒的生物传感器，弃去上清液，加入等体积纯水，使用漩涡振荡器是细胞混合均匀。上述磁体回收步骤重复三次，最后将所获得磁性物质溶解于等体积液体矿质培养基 (1 升液体矿物质培养基含有 2.5g Na2HPO4、 2.5gKH2PO4、 1.0gNH4Cl、 0.1gMgSO4·7H2O、 10μL 饱和 CaCl2 溶液、 10μL 饱和 FeSO4 溶液和 1mL Bauchop & Elsden 溶液 ) 中，获得磁性生物传感器不动杆菌 (Acinetobacter sp.)ADPWH alk。
     另取 500μL 步骤 1) 中获得的生物传感器细胞悬浮液，加入 4.5mL 实施例 4 步骤 2) 中制备的聚烯丙基胺盐酸盐水溶液阴性对照。30℃条件下震荡培养 30 分钟。使用 3000rpm 离心 10 分钟，加入等体积纯水，使用漩涡振荡器是细胞混合均匀。上述离心回收步骤重复三次，最后将所获得沉淀溶解于等体积液体矿质培养基 (1 升液体矿物质培养基含有 2.5g Na2HPO4、 2.5g KH2PO4、 1.0g NH4Cl、 0.1g MgSO4·7H2O、 10μL 饱和 CaCl2 溶液、 10μL 饱和 FeSO4 溶液和 1mLBauchop&Elsden 溶液 ) 中，获得无磁性纳米颗粒的生物传感器不动杆菌 (Acinetobacter sp.)ADPWH_alk 阴性对照。
     实施例 6 ：磁性生物传感器不动杆菌 (Acinetobacter sp.)ADPWH_Tol 的制备
     1) 细胞培养
     磁性生物传感器不动杆菌 (Acinetobacter sp.)ADPWH_Tol( 购自惟馨雨生物技术有限公司或根据现有技术公开的文献 Huang W.E.et al.Characterizing the regulationof the Pu promoter in Acinetobacter baylyi ADP1.Environ. Microbiol.10， 1668-1680， 2008 所述方法构建 ) 单菌落接种至含有 10mg/L 卡那霉素的 LB 液体培养基 (LBK)， 30℃培养过夜后，取 10mL 菌液 (CFU ＝ 5×108cells/mL)， 3000rpm 离心 10 分钟，弃去上清液，加入等体积纯水。使用涡旋振荡器使细胞混合均匀，再次 3000rpm 离心 10 分钟，弃去上清液，加入 1mL 纯水浓缩，该细胞悬浮液浓度约为 5×109cells/mL。
     2) 磁性纳米颗粒溶液制备
     如实施例 3 所述。
     3) 磁性生物传感器构建
     取 500μL 步骤 1) 中获得的生物传感器悬浮液，加入 4.5mL 步骤 2) 中制备的磁性纳米颗粒溶液。30℃条件下震荡培养 30 分钟。使用磁体置于试管侧壁 10 分钟，回收已结合磁性纳米颗粒的生物传感器，弃去上清液，加入等体积纯水，使用漩涡振荡器是细胞混合均匀。上述磁体回收步骤重复三次，最后将所获得磁性物质溶解于等体积液体矿质培养基中，获得磁性生物传感器不动杆菌 (Acinetobacter sp.)ADPWH_Tol。
     另取 500μL 步骤 1) 中获得的生物传感器悬浮液，加入 4.5mL 实施例 4 步骤 2) 中制备的聚烯丙基胺盐酸盐水溶液阴性对照。30℃条件下震荡培养 30 分钟。使用 3000rpm 离心 10 分钟，加入等体积纯水，使用漩涡振荡器是细胞混合均匀。上述离心回收步骤重复三次，最后将所获得沉淀溶解于等体积液体矿质培养基 (1 升液体矿物质培养基含有 2.5g Na2HPO4、 2.5g KH2PO4、 1.0g NH4Cl、 0.1g MgSO4·7H2O、 10μL 饱和 CaCl2 溶液、 10μL 饱和 FeSO4 溶液和 1mLBauchop&Elsden 溶液 ) 中，获得无磁性纳米颗粒的生物传感器不动杆菌 (Acinetobacter sp.)ADPWH_Tol 阴性对照。实施例 7 ：磁性生物传感器不动杆菌 (Acinetobacter sp.)ADPWH_lux 的特性
     对实施例 4 的磁性生物传感器不动杆菌 (Acinetobacter sp.)ADPWH_lux 做如下实验，实验过程及结果如下：
     磁性生物传感器不动杆菌 (Acinetobacter sp.)ADPWH_lux 悬浮状态 ( 图 2 左图 ) 与普通细胞悬浊液无显著差异，在磁体吸附状态 ( 图 2 右图 ) 下，磁性生物传感器不动杆菌 (Acinetobacter sp.)ADPWH_lux 可被有效富集和回收。证明了磁性纳米颗粒溶液使得生物传感器不动杆菌 (Acinetobacter sp.)ADPWH_lux 具有了磁性。
     如图 3 所示，薄片法的磁性生物传感器不动杆菌 (Acinetobacter sp)ADPWH_lux 的透射电子显微镜照片显示：磁性纳米颗粒粘附于细胞表面。如图 4 所示，图 3 中部分放大的图像显示：磁性纳米颗粒都粘附于细胞外壁上，在胞质中没有发现磁性纳米颗粒。此外，如图 5 所示，磁性生物传感器不动杆菌 (Acinetobacter sp.)ADPWH_lux 的表面电子能谱 (EDX) 证实了细胞壁上氧化铁纳米颗粒的存在。
     然后用磁性和非磁性的生物传感器不动杆菌 (Acinetobacter sp.)ADPWH_lux 的平板计数来估测该磁性生物传感器不动杆菌 (Acinetobacter sp.)ADPWH_lux 的效率。
     计数结果是磁性生物传感器不动杆菌 (Acinetobacter sp.)ADPWH_lux 的数量是 2.22±0.10×108CUF/ml，非磁性生物传感器不动杆菌 (Acinetobacter sp.)ADPWH_lux 细胞数量是 8.00±0.51×104CUF/ml( 图 6)，表明磁性化生物传感器不动杆菌 (Acinetobacter sp.)ADPWH_lux 的效率是 99.96±0.01％。因为，通过在琼脂糖板上菌落计数来计数磁性生物传感器不动杆菌 (Acinetobacter sp.)ADPWH_lux 的数量，因此，该实验也表明磁性化的细菌细胞还是活的，因此该磁性生物传感器是生物相容性的。在 PAH 中分散的磁性纳米颗粒不能进入胞质解释了高水平存活率的原因。并且我们也检查了磁性化细胞的生长和分裂，图 7 表明在 30℃温育 120 分钟期间，非磁性化的细胞数量从 0 增加到 12％，这证明了磁性化的细胞能够正常分裂和生长。
     对实施例 5 和 6 中制得的磁性生物传感器不动杆菌 (Acinetobacter sp.)ADPWH_ alk 和不动杆菌 (Acinetobacter sp.)ADPWH_Tol 做了相同的实验，实验过程及结果相同。
     实施例 8 ：磁性生物传感器不动杆菌 (Acinetobacter sp.)ADPWH_lux 对水中水杨酸含量的检测
     1) 样品准备
     称取 160.1mg 水杨酸钠，加入到 100mL 纯水中，得到浓度为 10mM 的水杨酸钠储备溶液。分别上述获得的水杨酸钠溶液按比例用纯水稀释，配置浓度为 50nM、 100nM、 1μM、 10μM 和 100μM 的水杨酸钠溶液。
     称取 27.02g 六水合丁二酸钠，加入到 100mL 纯水中，使用 0.22μm 滤膜 (Millipore) 过滤，得到无菌丁二酸钠储备溶液，该溶液丁二酸钠浓度为 1M。
     2) 样品测试
     取 176μL 实施例 4 中获得的磁性生物传感器和无磁性阴性对照的生物传感器，加入黑色底透的 96 孔酶标板 ( 美国 Corning Costar 公司 ) 孔内。每孔内分别加入 4μL 丁二酸那储备溶液和 20μL 上述系列水杨酸钠溶液，使用纯水作为阴性对照 (control)，每组测试包括三个平行样。
     使用多功能酶标仪 ( 型号 Synergy 2，美国 BioTek 公司 ) 对 96 孔酶标板内生物发光强度进行测量。培养温度为 30℃，每 10 分钟进行一次测量，每次测量前振荡 1 分钟以保证细胞混合均匀。
     3) 数据处理
     计算步骤 2) 中测试过程所获得的每种生物传感器三组平行样均值，获得每种生物传感器阴性对照与诱导组不同时刻生物发光强度。每种生物传感器诱导组不同时刻生物发光强度除以对应时刻阴性对照组生物发光强度，获得每种生物传感器诱导组不同时刻生物发光相对倍数。取每种生物传感器诱导组不同时刻生物发光相对倍数峰值及其前后各 2 个时间点生物发光相对倍数，计算平均值，获得该生物传感器生物发光响应倍数。
     磁性生物传感器不动杆菌 (Acinetobacter sp.)ADPWH_lux 对水中不同浓度水杨酸的响应如图 8 所示。测试结果表明，磁性生物传感器不动杆菌 (Acinetobactersp.) ADPWH_lux 与原生物传感器均对水杨酸有显著响应，生物发光响应倍数随水杨酸浓度增加而增强。两种生物传感器对相同浓度水杨酸溶液的响应无显著差异，表明磁性生物传感器不动杆菌 (Acinetobacter sp.)ADPWH_lux 可以有效识别并对水溶液中水杨酸产生定量响应。
     实施例 8 ：磁性生物传感器不动杆菌 (Acinetobacter sp.)ADP_alk 对海水中石油含量的检测。 1) 样品准备
     分别 12.5μL 英国北海布伦特原油和伊朗锡里岛原油，溶解于 100mL 海水中，使用 40K-Hz 超声波振荡 30 秒，摇匀，该乳浊液含有石油浓度为 100mg/L。将该乳浊液按不同比例使用海水稀释，配制浓度为 0.1、 0.2、 1、 2、 10、 20、 100mg/L 的系列石油海水溶液。
     称取 27.02g 六水合丁二酸钠，加入到 100mL 纯水中，使用 0.22μm 滤膜 (Millipore) 过滤，得到无菌丁二酸钠储备溶液，该溶液丁二酸钠浓度为 1M。
     2) 样品测试
     取 20μL 实施例 5 中制得的磁性生物传感器和无磁性阴性对照生物传感器的悬浮液，加入黑色底透的 96 孔酶标板 ( 美国 Corning Costar 公司 ) 孔内。每孔内分别加入 4μL 丁二酸那储备溶液和 176μL 上述系列石油水溶液，使用纯水作为阴性对照 (control)，每组测试包括三个平行样。
     使用多功能酶标仪 ( 型号 Synergy 2，美国 BioTek 公司 ) 对 96 孔酶标板内生物发光强度进行测量。培养温度为 30℃，每 10 分钟进行一次测量，每次测量前振荡 1 分钟以保证细胞混合均匀。
     3) 数据处理
     计算步骤 2) 中测试过程所获得的每种生物传感器三组平行样均值，获得每种生物传感器阴性对照与诱导组不同时刻生物发光强度。每种生物传感器诱导组不同时刻生物发光强度除以对应时刻阴性对照组生物发光强度，获得每种生物传感器诱导组不同时刻生物发光相对倍数。取每种生物传感器诱导组不同时刻生物发光相对倍数峰值及其前后各 2 个时间点生物发光相对倍数，计算平均值，获得该生物传感器生物发光响应倍数。
     磁性生物传感器不动杆菌 (Acinetobacter sp.)ADPWH_alk 对海水中不同浓度石油的响应如图 9A、 9B 所示。测试结果表明，磁性生物传感器不动杆菌 (Acinetobacter sp.) ADPWH_alk 与原生物传感器均对海水中不同浓度的原油有显著响应，生物发光响应倍数随
     原油浓度增加而增强。相同石油浓度条件下，磁性生物传感器生物发光响应倍数显著低于原生物传感器，这可能是由于磁性生物传感器表面聚丙烯基胺高分子膜对非极性分子传质的阳碍作用，但两种生物传感器对原油的检测限相同，表明磁性生物传感器 Acinetobacter sp.ADPWH_alk 可以有效识别并对海水中原油产生定量响应。
     实施例 9 ：磁性生物传感器 (Acinetobacter sp)ADPWH_Tol 对水中甲苯含量的检测
     1) 样品准备
     取甲苯 20μL 加入到 100mL 纯水中， 40K-Hz 超声波 30 秒，得到甲苯饱和储备溶液，浓度为 600μM。将该乳浊液按不同比例使用纯水稀释，配制浓度为 6、 60 和 600μM 的系列甲苯溶液。
     称取 27.02g 六水合丁二酸钠，加入到 100mL 纯水中，使用 0.22μm 滤膜 (Millipore) 过滤，得到无菌丁二酸钠储备溶液，该溶液丁二酸钠浓度为 1M。
     2) 样品测试
     取 20μL 实施例 6 中获得的磁性生物传感器和无磁性阴性对照生物传感器悬浮液，加入黑色底透的 96 孔酶标板 ( 美国 Corning Costar 公司 ) 孔内。每孔内分别加入 4μL 丁二酸那储备溶液和 176μL 上述系列甲苯水溶液，使用纯水作为阴性对照 (control)，每组测试包括三个平行样。使用多功能酶标仪 ( 型号 Synergy 2，美国 BioTek 公司 ) 对 96 孔酶标板内生物发光强度进行测量。培养温度为 30℃，每 10 分钟进行一次测量，每次测量前振荡 1 分钟以保证细胞混合均匀。
     3) 数据处理
     计算步骤 2) 中测试过程所获得的每种生物传感器三组平行样均值，获得每种生物传感器阴性对照与诱导组不同时刻生物发光强度。每种生物传感器诱导组不同时刻生物发光强度除以对应时刻阴性对照组生物发光强度，获得每种生物传感器诱导组不同时刻生物发光相对倍数。取每种生物传感器诱导组不同时刻生物发光相对倍数峰值及其前后各 2 个时间点生物发光相对倍数，计算平均值，获得该生物传感器生物发光响应倍数。
     磁性生物传感器不动杆菌 (Acinetobacter sp.)ADPWH_Tol 对水中不同浓度甲苯的响应如图 10 所示。测试结果表明，磁性生物传感器 Acinetobacter sp.ADPWH_Tol 与原生物传感器均对甲苯有显著响应，生物发光响应倍数随甲苯浓度增加而增强。两种生物传感器对相同浓度甲苯溶液的响应无显著差异，表明磁性生物传感器不动杆菌 (Acinetobacter sp.)ADPWH_lux 可以有效识别并对水溶液中甲苯产生定量相应。
     实施例 10 ：磁性生物传感器不动杆菌 (Acinetobacter sp.)ADPWH_lux 对土壤水杨酸含量的检测
     1) 细胞培养
     不动杆菌 (Acinetobacter sp.)ADPWH_lux 单菌落接种至 LB 液体培养基 (LB)， 30℃培养过夜后，取 10mL 菌液 (CFU ＝ 5×108cells/mL)， 3000rpm 离心 10 分钟，弃去上清液，加入等体积纯水。使用涡旋振荡器使细胞混合均匀，再次 3000rpm 离心 10 分钟，弃去上 9 清液，加入 1mL 纯水浓缩，该细胞悬浮液浓度约为 5×10 cells/mL。
     2) 磁性生物传感器构建
     取 500μL 步骤 1) 中获得的细胞悬浮液，加入 4.5mL 实施例 1 中制备的磁性纳米颗粒溶液。 30℃条件下震荡培养 30 分钟。使用磁体置于试管侧壁 10 分钟，回收已结合磁性纳米颗粒的生物传感器，弃去上清液，加入等体积纯水，使用漩涡振荡器是细胞混合均匀。上述磁体回收步骤重复三次，最后将所获得磁性物质溶解于 1/10 体积纯水中，获得磁性生物传感器不动杆菌 (Acinetobacter sp.)ADPWH_lux。
     3) 样品准备
     称取 160.1mg 水杨酸钠，加入到 100mL 纯水中，得到浓度为 10mM 的水杨酸钠储备溶液。分别上述获得的水杨酸钠溶液按比例用纯水稀释，配置浓度为 0、 0.1、 1、 10 和 100μM 的水杨酸钠溶液。分别取上述水杨酸钠溶液 2.0mL 加入到 2.0g 干净土壤中，室温条件下震动搅拌 24 小时以保证水杨酸与土壤混合均匀，该土壤水杨酸含量分别为 0.0、 0.14、 1.4、 14 和 140mg/g。上述土壤分别加入 8mL 纯水， 40K-Hz 超声波 300 秒后，加入 1mL 步骤 2) 中获得的磁性生物传感器不动杆菌 (Acinetobacter sp.)ADPWH_lux 和 1mL 液体 LB 培养基。该土壤 / 生物传感器混合液 30℃条件下培养 20 分钟，静置 2 分钟后取 2mL 上清液。使用磁体置于含上述上清液的试管侧壁 10 分钟，回收磁性生物传感器不动杆菌 (Acinetobacter sp.) ADPWH_lux，小心移去上清液和土壤颗粒沉淀，加入 1.8mL 纯水和 200μL 新鲜液体 LB 培养基，振荡摇匀。
     4) 样品测试
     取 200μL 步骤 2) 中获得的磁性生物传感器 Acinetobacter sp.ADPWH_lux 悬浮液，加入黑色底透的 96 孔酶标板 ( 美国 Corning Costar 公司 ) 孔内，每组测试包括三个平行样。
     使用多功能酶标仪 ( 型号 Synergy 2，美国 BioTek 公司 ) 对 96 孔酶标板内生物发光强度进行测量。培养温度为 30℃，每 10 分钟进行一次测量，每次测量前振荡 1 分钟以保证细胞混合均匀。
     5) 数据处理
     计算步骤 4) 中测试过程所获得的每种生物传感器三组平行样均值，获得每种生物传感器阴性对照与诱导组不同时刻生物发光强度。每种生物传感器诱导组不同时刻生物发光强度除以对应时刻阴性对照组生物发光强度，获得每种生物传感器诱导组不同时刻生物发光响应倍数。
     磁性生物传感器不动杆菌 (Acinetobacter sp.)ADPWH_lux 对土壤不同水杨酸含量的响应如图 11 所示。测试结果表明，经磁体回收的磁性生物传感器不动杆菌 (Acinetobacter sp.)ADPWH_lux 对土壤中水杨酸有显著响应，生物发光响应倍数随水杨酸含量增加而增强。磁性生物传感器不动杆菌 (Acinetobacter sp.)ADPWH_lux 对土壤不同水杨酸含量的响应峰值出现在 120 分钟左右，但与土壤混合培养后已对水杨酸产生响应，表现为多功能酶标仪 0 分钟时刻不同水杨酸含量土壤对应生物发光响应倍数不同。