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一种间充质干细胞分化为胆管细胞的方法.pdf

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文档编号：8632349

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1、(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201810966454.2 (22)申请日 2018.08.23 (71)申请人中国人民解放军第二军医大学第二附属医院地址 201705 上海市黄浦区凤阳路415号申请人澳大利亚昆士兰大学迪亚曼蒂纳研究所 (72)发明人王昊陆李新星梁晓雯胡志前高文超 (74)专利代理机构上海泰能知识产权代理事务所 31233 代理人黄志达魏峯 (51)Int.Cl. C12N 5/071(2010.01) C12N 5/0775(2010.01) (54)发明名称一种间。

2、充质干细胞分化为胆管细胞的方法 (57)摘要本发明涉及一种间充质干细胞分化为胆管细胞的方法，包括将人间充质干细胞分化为内胚层干细胞(细胞分化培养)；第二步将内胚层干细胞进一步成熟分化为胆管细胞(细胞成熟培养)。本发明用特定培养条件诱导间充质干细胞分化的 “两步分化法” ，成功将人间充质干细胞分化为有功能的胆管细胞，不需要将干细胞和其他细胞共培养或基因重组，仅仅依靠特定培养条件诱导分化。此类胆管细胞容易获得、无免疫反应、体外增殖迅速、无成瘤性，有望用于临床药物筛选、人工胆道重建等方面。权利要求书1页说明书4页附图2页 CN 109182246 A。

3、 2019.01.11 CN 109182246 A 1.一种间充质干细胞分化为胆管细胞的方法，包括： (1)将人骨髓间质干细胞hMSC培养在hMSC培养液中，待细胞长满培养瓶壁时吸出上层液并冲洗，在培养瓶中加入相同体积的无血清培养液，继续培养； 2-3天后吸出上层液并冲洗，在培养瓶中加入相同体积的细胞分化培养液，继续培养7-8天，得到内胚层干细胞； (2)在培养有内胚层干细胞的培养瓶中加入相同体积的含白介素6的细胞成熟培养液； 2-3天后吸出上层液并冲洗，在培养瓶中加入相同体积的含牛磺胆酸的细胞成熟培养液； 2- 3天后吸出上层液并冲洗，在培养瓶中加入相同体积的含牛磺胆。

4、酸和丁酸钠的细胞成熟培养液， 2-3天后得到胆管细胞。 2.根据权利要求1所述的一种间充质干细胞分化为胆管细胞的方法，其特征在于：所述步骤(1)中人骨髓间质干细胞hMSC的培养密度为13,00014,000细胞/cm2。 3.根据权利要求1所述的一种间充质干细胞分化为胆管细胞的方法，其特征在于：所述步骤(1)中的hMSC培养液含有： 10FBS、 10ng/mL人成纤维细胞生长因子和5ug/mL肝素。 4.根据权利要求1所述的一种间充质干细胞分化为胆管细胞的方法，其特征在于：所述步骤(1)中的无血清培养液含有： 20ng/ml人表皮生长因子和10ng/ml人成纤维细胞生长因。

5、子。 5.根据权利要求1所述的一种间充质干细胞分化为胆管细胞的方法，其特征在于：所述步骤(1)中的细胞分化培养液含有： 20ng/ml人肝细胞生长因子、 10ng/ml人成纤维细胞生长因子和0.61g/l烟酰胺。 6.根据权利要求1所述的一种间充质干细胞分化为胆管细胞的方法，其特征在于：所述步骤(2)中的细胞成熟培养液含有： 2FBS、 1ug/ml胰岛素和1uM氢化可的松琥珀酸脂。 7.根据权利要求6所述的一种间充质干细胞分化为胆管细胞的方法，其特征在于：所述步骤(2)中的含白介素6的细胞成熟培养液还包括： 10ng/ml白介素6。 8.根据权利要求6所述的一种间充质干。

6、细胞分化为胆管细胞的方法，其特征在于：所述步骤(2)中的含牛磺胆酸的细胞成熟培养液还包括： 10nM牛磺胆酸。 9.根据权利要求6所述的一种间充质干细胞分化为胆管细胞的方法，其特征在于：所述步骤(2)中的含牛磺胆酸和丁酸钠的细胞成熟培养液还包括： 10nM牛磺胆酸和1.8uM丁酸。 10.根据权利要求1所述的一种间充质干细胞分化为胆管细胞的方法，其特征在于：所述步骤(2)中得到的胆管细胞用于培养有囊状和管状结构的胆管类器官。权利要求书 1/1 页 2 CN 109182246 A 2 一种间充质干细胞分化为胆管细胞的方法技术领域 0001 本发明属于分化细胞领域，特别涉。

7、及一种间充质干细胞分化为胆管细胞的方法。背景技术 0002 理想的可用于临床治疗或临床前研究的干细胞一般具有以下特性：容易获得、无免疫反应、体外增殖迅速、无成瘤性、移植后存活时间长。近年来，已有研究报道胚胎干细胞和诱导性多能干细胞可以体外分化为胆管细胞，缺点在于此类细胞移植后不可控的增殖性和成瘤性。另外诱导性多能干细胞的遗传学和表观遗传学方面存在一定程度上的特异性，因此此类细胞并不适合于涉及重新编程和转录机制的生物学和药理学研究。目前尚无其他种类干细胞分化为胆管细胞的研究发表。 0003 间充质干细胞最早在骨髓中发现，随后还发现存在于人体发生、发育过程的许多。

8、种组织中，具有分化为肌细胞、肝细胞、成骨细胞、脂肪细胞、软骨细胞、基质细胞等多种细胞的能力。与胚胎干细胞和诱导性多能干细胞相比，目前间充质干细胞的临床应用较多，此类细胞没有成瘤性，容易获得、增殖，无需转基因重新编程。目前已经有许多研究报道了间充质干细胞可以诱导分化为肝细胞，然而目前尚无间充质干细胞分化为胆管细胞的报道。发明内容 0004 本发明所要解决的技术问题是提供一种间充质干细胞分化为胆管细胞的方法，该方法填补了目前尚无其他种类干细胞分化为胆管细胞的空白。 0005 本发明提供了一种间充质干细胞分化为胆管细胞的方法，包括： 0006 (1)将人骨。

9、髓间质干细胞hMSC培养在hMSC培养液中，待细胞长满培养瓶壁时 (90-100)吸出上层液并冲洗，在培养瓶中加入相同体积的无血清培养液，继续培养； 2- 3天后吸出上层液并冲洗，在培养瓶中加入相同体积的细胞分化培养液，继续培养7-8天，得到内胚层干细胞； 0007 (2)在培养有内胚层干细胞的培养瓶中加入相同体积的含白介素6的细胞成熟培养液； 2-3天后吸出上层液并冲洗，在培养瓶中加入相同体积的含牛磺胆酸的细胞成熟培养液； 2-3天后吸出上层液并冲洗，在培养瓶中加入相同体积的含牛磺胆酸和丁酸钠的细胞成熟培养液， 2-3天后得到胆管细胞。 0008 所述步骤(1)中人骨。

10、髓间质干细胞hMSC的培养密度为13,00014,000细胞/cm2。 0009 所述步骤(1)中的hMSC培养液含有： 10FBS、 10ng/mL人成纤维细胞生长因子和 5ug/mL肝素。 0010 所述步骤(1)中的无血清培养液含有： 20ng/ml人表皮生长因子和10ng/ml人成纤维细胞生长因子。 0011 所述步骤(1)中的细胞分化培养液含有： 20ng/ml人肝细胞生长因子、 10ng/ml人成纤维细胞生长因子和0.61g/l烟酰胺。 0012 所述步骤(2)中的细胞成熟培养液含有： 2FBS、 1ug/ml胰岛素和1uM氢化可的松说明书 1/4 页 3 CN 109182。

11、246 A 3 琥珀酸脂。 0013 所述步骤(2)中的含白介素6的细胞成熟培养液还包括： 10ng/ml白介素6。 0014 所述步骤(2)中的含牛磺胆酸的细胞成熟培养液还包括： 10nM牛磺胆酸。 0015 所述步骤(2)中的含牛磺胆酸和丁酸钠的细胞成熟培养液还包括： 10nM牛磺胆酸和1.8uM丁酸。 0016 所述步骤(2)中得到的胆管细胞用于培养有囊状和管状结构的胆管类器官。 0017 有益效果 0018 本发明用特定培养条件诱导间充质干细胞分化的 “两步分化法” ，成功将人间充质干细胞分化为有功能的胆管细胞，不需要将干细胞和其他细胞共培养或基因重组，仅仅依靠特定培养条件。

12、诱导分化。此类胆管细胞容易获得、无免疫反应、体外增殖迅速、无成瘤性，有望用于临床药物筛选、人工胆道重建等方面。附图说明 0019 图1为人间充质干细胞分化成胆管细胞；其中， (A)分化的过程和形态改变； (B)胆管细胞标志物的Real-time PCR测试结果； (C)胆管细胞药物转运蛋白MDR1的功能性测试结果。 0020 图2为胆管结构的类器官免疫荧光染色(RNA)； 0021 图3A-D为胆管结构的类器官免疫荧光染色(蛋白)。具体实施方式 0022 下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解。

13、，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。 0023 实施例1 0024 1.试剂 0025 1.1细胞培养液 0026 1.DMEM培养液(Invitrogen/GIBCO,#11995065) 0027 2.胎牛血清(FBS) 0028 3.IMDM培养液(Invitrogen/GIBCO,#12440053) 0029 4.William s E培养液(不含谷氨酰胺)(Invitrogen/GIBCO,#12551-032) 0030 5.1磷酸盐缓冲液(PBS)(不含Ca2+or Mg2+。

14、)(Invitrogen/GIBCO,#10010031) 0031 6.0.25胰蛋白酶-EDTA消化液(Invitrogen/GIBCO,#25200056) 0032 7.基质胶(Matrigel， Corning,#356234) 0033 8.1型人源胶原蛋白(Corning,#354265) 0034 1.2细胞分化培养液 0035 1.人骨髓间质干细胞(hMSC)培养液： 0036 50ml DMEM培养液，含10FBS， 10ng/mL人成纤维细胞生长因子(Peprotech,#100- 18B-100ug)， 5ug/mL肝素。说明书 2/4 页 4 CN 1091822。

15、46 A 4 0037 2.无血清培养液: 0038 49.985ml IMDM培养液，含20ng/ml人表皮生长因子(Gibco,#PHG0311)(将100ug人表皮生长因子溶解于2ml含0.1BSA的IMDM培养液中以配制50ug/ml原液；配制培养液时，取10ul的100ug/ml原液)和10ng/ml人成纤维细胞生长因子(Peprotech,#100-18B-100ug) (将100ug人成纤维细胞生长因子溶解于1ml含0.1BSA的1PBS中以配制100ug/ml原液)。 0039 3.细胞分化培养液： 0040 49.934ml IMDM培养液，含20ng/ml人肝细胞。

16、生长因子(Peprotech,#100-39H- 25ug)(从溶解于含0.1BSA的1PBS的100ug/ml人肝细胞生长因子原液中取10ul)， 10ng/ ml人成纤维细胞生长因子(从溶解于含0.1BSA的1PBS的100ug/ml人成纤维细胞生长因子原液中取5ul)和0.61g/l烟酰胺(Sigma,#N-3376)(从溶解于无菌过滤水的600mg/ml烟酰胺原液中取50.85ul)。 0041 4.细胞成熟培养液： 0042 43.5ml William s E培养液，含2FBS， 1ug/ml胰岛素(Actrapid)(从溶解于注射水的100ug/ml原液中取500ul)，。

17、 1uM氢化可的松琥珀酸脂(Stemcell Technology,#7904) (从溶解于无菌过滤William s E培养液的0.001M/5ml氢化可的松琥珀酸脂原液中取5ml)。 0043 5.细胞成熟培养液(含白介素6)： 0044 50ml还原型培养液，含10ng/ml白介素6(Peprotech,#200-06)(将白介素6溶解于含0.1BSA的1PBS中以配制100ug/ml原液)。 0045 6.细胞成熟培养液(含牛磺胆酸)： 0046 50ml还原型培养液，含10nM牛磺胆酸(Fisher Scientific,#AAA1834603)(将牛磺胆酸溶解于无菌过滤注射。

18、水中以配制10uM原液)。 0047 7.细胞成熟培养液(含牛磺胆酸和丁酸钠)： 0048 50ml还原型培养液，含10nM牛磺胆酸(Fisher Scientific,#AAA1834603)(将牛磺胆酸溶解于无菌过滤注射水中以配制10uM原液)和1.8uM丁酸钠(Stemcell Technology,# 72242)(将丁酸钠溶解于无菌过滤1PBS中以配制1.8mM原液)。 0049 2.2D细胞培养实验步骤 0050 2.1.将hMSC以13,000细胞/cm2(每个75cm2培养瓶内含1106个细胞)的密度培养在hMSC培养液中。 0051 2.2.将培养瓶放置于37， 5CO。

19、2的加湿培养箱中培养。在细胞贴壁生长至90- 100之前，每2-3天更换一次培养液。 0052 2.3.当细胞长满培养瓶壁时(5-7天)，吸出上层液并用PBS冲洗培养瓶。在培养瓶中加入与之前培养液相同体积的无血清培养液，并将细胞培养两天。注意在培养过程中使用相差显微镜观察细胞形态。 0053 2.4.在第二天，吸出上层液并用PBS冲洗培养瓶。在培养瓶中加入与之前培养液相同体积的细胞分化培养液，并将细胞培养7天。每2-3天更换一次培养液。注意在培养过程中使用相差显微镜观察细胞形态。此时得到内胚层干细胞。 0054 2.5.在第九天，吸出上层液并用PBS冲洗培养瓶。

20、。在培养瓶中加入与之前培养液相同体积的细胞成熟培养液(含10ng/ml白介素6)，并将细胞培养2天。注意在培养过程中使用相差显微镜观察细胞形态。说明书 3/4 页 5 CN 109182246 A 5 0055 2.6.在第十一天，吸出上层液并用PBS冲洗培养瓶。在培养瓶中加入与之前培养液相同体积的细胞成熟培养液(含10nM牛磺胆酸)，并将细胞培养2天。注意在培养过程中使用相差显微镜观察细胞形态。 0056 2.7.在第十三天，吸出上层液并用PBS冲洗培养瓶。在培养瓶中加入与之前培养液相同体积的细胞成熟培养液(含10nM牛磺胆酸和1.8uM丁酸钠)，并将细胞培养。

21、2天。注意在培养过程中使用相差显微镜观察细胞形态。此时得到胆管细胞。 0057 3.1 3D细胞培养步骤 0058 3.1.根据下表的成分配制3D细胞培养液。 0059 0060 0061 3.2.将2x104的2.7步骤中得到的细胞培养在加入了250ul三维细胞培养液的8孔玻璃细胞盒中。 0062 3.3.将细胞盒放置于37， 5CO2的加湿培养箱中培养一个小时。 0063 3.4.在凝固的培养基中继续加入250ul三维细胞培养液。注意在培养过程中使用相差显微镜观察细胞形态。 0064 3.5.在第五天左右，胆管细胞将形成拥有囊泡结构的类器官，并在十四天分枝出管状结构(图1。

22、A)。 0065 如图1A所示，胆管细胞放入3D培养基Matrigel后，聚集形成了具有胆管结构的类器官，然而对照组间充质干细胞无法形成有类似结构的类器官。与其他干细胞分化的方法相比，本发明设计的 “两步分化法” 不需要将干细胞和其他细胞共培养或基因重组，仅仅依靠特定培养条件诱导分化。如图1B所示， Real-time PCR结果显示第6天时内胚层标志物 (HNF4、 FOXA2和GATA4)开始高表达；第27天胆管标志物明显高表达(CK7、 CK19、 TGR5、 CFTR和 AQP1)。通过罗丹明123实验进一步验证了分化得到的胆管细胞的功能。发现MDR1的底物罗。

23、丹明123可以在胆管细胞类器官的管腔内聚集，证明了胆管细胞中MDR1的功能(图1C)。 0066 如图2所示，可以发现中空的囊泡结构，胆管标志物(CK7、 CK19)高表达。 0067 如图3所示，第9天时82的细胞表达内胚层标志物CXCR4和FOXA2蛋白(A)，不表达胆管标志物CK7、 CK19和Sox9蛋白。第27天时，无论是2D培养基还是3D培养基中85以上的细胞均共表达胆管标志物CK7和CK19蛋白，不表达内胚层标志物(B、 C)。成功分化的胆管细胞注射进裸鼠肝脏两周以后，仍然共表达胆管标志物CK7和CK19蛋白(D)。说明书 4/4 页 6 CN 109182246 A 6 图1 图2 说明书附图 1/2 页 7 CN 109182246 A 7 图3 说明书附图 2/2 页 8 CN 109182246 A 8 。

摘要
申请专利号：	CN201810966454.2	申请日：	20180823
公开号：	CN109182246A	公开日：	20190111
当前法律状态：		有效性：	审查中
法律详情：
IPC分类号：	C12N5/071,C12N5/0775	主分类号：	C12N5/071,C12N5/0775
申请人：	中国人民解放军第二军医大学第二附属医院,澳大利亚昆士兰大学迪亚曼蒂纳研究所
发明人：	王昊陆,李新星,梁晓雯,胡志前,高文超
地址：	201705 上海市黄浦区凤阳路415号
优先权：	CN201810966454A
专利代理机构：	上海泰能知识产权代理事务所	代理人：	黄志达;魏峯
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内容摘要

本发明涉及一种间充质干细胞分化为胆管细胞的方法，包括将人间充质干细胞分化为内胚层干细胞(细胞分化培养)；第二步将内胚层干细胞进一步成熟分化为胆管细胞(细胞成熟培养)。本发明用特定培养条件诱导间充质干细胞分化的“两步分化法”，成功将人间充质干细胞分化为有功能的胆管细胞，不需要将干细胞和其他细胞共培养或基因重组，仅仅依靠特定培养条件诱导分化。此类胆管细胞容易获得、无免疫反应、体外增殖迅速、无成瘤性，有望用于临床药物筛选、人工胆道重建等方面。

权利要求书

1.一种间充质干细胞分化为胆管细胞的方法，包括：(1)将人骨髓间质干细胞hMSC培养在hMSC培养液中，待细胞长满培养瓶壁时吸出上层液并冲洗，在培养瓶中加入相同体积的无血清培养液，继续培养；2-3天后吸出上层液并冲洗，在培养瓶中加入相同体积的细胞分化培养液，继续培养7-8天，得到内胚层干细胞；(2)在培养有内胚层干细胞的培养瓶中加入相同体积的含白介素6的细胞成熟培养液；2-3天后吸出上层液并冲洗，在培养瓶中加入相同体积的含牛磺胆酸的细胞成熟培养液；2-3天后吸出上层液并冲洗，在培养瓶中加入相同体积的含牛磺胆酸和丁酸钠的细胞成熟培养液，2-3天后得到胆管细胞。 2.根据权利要求1所述的一种间充质干细胞分化为胆管细胞的方法，其特征在于：所述步骤(1)中人骨髓间质干细胞hMSC的培养密度为13,000～14,000细胞/cm。 3.根据权利要求1所述的一种间充质干细胞分化为胆管细胞的方法，其特征在于：所述步骤(1)中的hMSC培养液含有：10％FBS、10ng/mL人成纤维细胞生长因子和5ug/mL肝素。 4.根据权利要求1所述的一种间充质干细胞分化为胆管细胞的方法，其特征在于：所述步骤(1)中的无血清培养液含有：20ng/ml人表皮生长因子和10ng/ml人成纤维细胞生长因子。 5.根据权利要求1所述的一种间充质干细胞分化为胆管细胞的方法，其特征在于：所述步骤(1)中的细胞分化培养液含有：20ng/ml人肝细胞生长因子、10ng/ml人成纤维细胞生长因子和0.61g/l烟酰胺。 6.根据权利要求1所述的一种间充质干细胞分化为胆管细胞的方法，其特征在于：所述步骤(2)中的细胞成熟培养液含有：2％FBS、1ug/ml胰岛素和1uM氢化可的松琥珀酸脂。 7.根据权利要求6所述的一种间充质干细胞分化为胆管细胞的方法，其特征在于：所述步骤(2)中的含白介素6的细胞成熟培养液还包括：10ng/ml白介素6。 8.根据权利要求6所述的一种间充质干细胞分化为胆管细胞的方法，其特征在于：所述步骤(2)中的含牛磺胆酸的细胞成熟培养液还包括：10nM牛磺胆酸。 9.根据权利要求6所述的一种间充质干细胞分化为胆管细胞的方法，其特征在于：所述步骤(2)中的含牛磺胆酸和丁酸钠的细胞成熟培养液还包括：10nM牛磺胆酸和1.8uM丁酸。 10.根据权利要求1所述的一种间充质干细胞分化为胆管细胞的方法，其特征在于：所述步骤(2)中得到的胆管细胞用于培养有囊状和管状结构的胆管类器官。

说明书

技术领域

本发明属于分化细胞领域，特别涉及一种间充质干细胞分化为胆管细胞的方法。

背景技术

理想的可用于临床治疗或临床前研究的干细胞一般具有以下特性：容易获得、无免疫反应、体外增殖迅速、无成瘤性、移植后存活时间长。近年来，已有研究报道胚胎干细胞和诱导性多能干细胞可以体外分化为胆管细胞，缺点在于此类细胞移植后不可控的增殖性和成瘤性。另外诱导性多能干细胞的遗传学和表观遗传学方面存在一定程度上的特异性，因此此类细胞并不适合于涉及重新编程和转录机制的生物学和药理学研究。目前尚无其他种类干细胞分化为胆管细胞的研究发表。

间充质干细胞最早在骨髓中发现，随后还发现存在于人体发生、发育过程的许多种组织中，具有分化为肌细胞、肝细胞、成骨细胞、脂肪细胞、软骨细胞、基质细胞等多种细胞的能力。与胚胎干细胞和诱导性多能干细胞相比，目前间充质干细胞的临床应用较多，此类细胞没有成瘤性，容易获得、增殖，无需转基因重新编程。目前已经有许多研究报道了间充质干细胞可以诱导分化为肝细胞，然而目前尚无间充质干细胞分化为胆管细胞的报道。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种间充质干细胞分化为胆管细胞的方法，该方法填补了目前尚无其他种类干细胞分化为胆管细胞的空白。

本发明提供了一种间充质干细胞分化为胆管细胞的方法，包括：

(1)将人骨髓间质干细胞hMSC培养在hMSC培养液中，待细胞长满培养瓶壁时(90％-100％)吸出上层液并冲洗，在培养瓶中加入相同体积的无血清培养液，继续培养；2-3天后吸出上层液并冲洗，在培养瓶中加入相同体积的细胞分化培养液，继续培养7-8天，得到内胚层干细胞；

(2)在培养有内胚层干细胞的培养瓶中加入相同体积的含白介素6的细胞成熟培养液；2-3天后吸出上层液并冲洗，在培养瓶中加入相同体积的含牛磺胆酸的细胞成熟培养液；2-3天后吸出上层液并冲洗，在培养瓶中加入相同体积的含牛磺胆酸和丁酸钠的细胞成熟培养液，2-3天后得到胆管细胞。

所述步骤(1)中人骨髓间质干细胞hMSC的培养密度为13,000～14,000细胞/cm2。

所述步骤(1)中的hMSC培养液含有：10％FBS、10ng/mL人成纤维细胞生长因子和5ug/mL肝素。

所述步骤(1)中的无血清培养液含有：20ng/ml人表皮生长因子和10ng/ml人成纤维细胞生长因子。

所述步骤(1)中的细胞分化培养液含有：20ng/ml人肝细胞生长因子、10ng/ml人成纤维细胞生长因子和0.61g/l烟酰胺。

所述步骤(2)中的细胞成熟培养液含有：2％FBS、1ug/ml胰岛素和1uM氢化可的松琥珀酸脂。

所述步骤(2)中的含白介素6的细胞成熟培养液还包括：10ng/ml白介素6。

所述步骤(2)中的含牛磺胆酸的细胞成熟培养液还包括：10nM牛磺胆酸。

所述步骤(2)中的含牛磺胆酸和丁酸钠的细胞成熟培养液还包括：10nM牛磺胆酸和1.8uM丁酸。

所述步骤(2)中得到的胆管细胞用于培养有囊状和管状结构的胆管类器官。

有益效果

本发明用特定培养条件诱导间充质干细胞分化的“两步分化法”，成功将人间充质干细胞分化为有功能的胆管细胞，不需要将干细胞和其他细胞共培养或基因重组，仅仅依靠特定培养条件诱导分化。此类胆管细胞容易获得、无免疫反应、体外增殖迅速、无成瘤性，有望用于临床药物筛选、人工胆道重建等方面。

附图说明

图1为人间充质干细胞分化成胆管细胞；其中，(A)分化的过程和形态改变；(B)胆管细胞标志物的Real-time PCR测试结果；(C)胆管细胞药物转运蛋白MDR1的功能性测试结果。

图2为胆管结构的类器官免疫荧光染色(RNA)；

图3A-D为胆管结构的类器官免疫荧光染色(蛋白)。

具体实施方式

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

实施例1

1.试剂

1.1细胞培养液

1.DMEM培养液(Invitrogen/GIBCO,#11995065)

2.胎牛血清(FBS)

3.IMDM培养液(Invitrogen/GIBCO,#12440053)

4.William’s E培养液(不含谷氨酰胺)(Invitrogen/GIBCO,#12551-032)

5.1×磷酸盐缓冲液(PBS)(不含Ca2+or Mg2+)(Invitrogen/GIBCO,#10010031)

6.0.25％胰蛋白酶-EDTA消化液(Invitrogen/GIBCO,#25200056)

7.基质胶(Matrigel，Corning,#356234)

8.1型人源胶原蛋白(Corning,#354265)

1.2细胞分化培养液

1.人骨髓间质干细胞(hMSC)培养液：

50ml DMEM培养液，含10％FBS，10ng/mL人成纤维细胞生长因子(Peprotech,#100-18B-100ug)，5ug/mL肝素。

2.无血清培养液:

49.985ml IMDM培养液，含20ng/ml人表皮生长因子(Gibco,#PHG0311)(将100ug人表皮生长因子溶解于2ml含0.1％BSA的IMDM培养液中以配制50ug/ml原液；配制培养液时，取10ul的100ug/ml原液)和10ng/ml人成纤维细胞生长因子(Peprotech,#100-18B-100ug)(将100ug人成纤维细胞生长因子溶解于1ml含0.1％BSA的1×PBS中以配制100ug/ml原液)。

3.细胞分化培养液：

49.934ml IMDM培养液，含20ng/ml人肝细胞生长因子(Peprotech,#100-39H-25ug)(从溶解于含0.1％BSA的1×PBS的100ug/ml人肝细胞生长因子原液中取10ul)，10ng/ml人成纤维细胞生长因子(从溶解于含0.1％BSA的1×PBS的100ug/ml人成纤维细胞生长因子原液中取5ul)和0.61g/l烟酰胺(Sigma,#N-3376)(从溶解于无菌过滤水的600mg/ml烟酰胺原液中取50.85ul)。

4.细胞成熟培养液：

43.5ml William’s E培养液，含2％FBS，1ug/ml胰岛素(Actrapid)(从溶解于注射水的100ug/ml原液中取500ul)，1uM氢化可的松琥珀酸脂(Stemcell Technology,#7904)(从溶解于无菌过滤William’s E培养液的0.001M/5ml氢化可的松琥珀酸脂原液中取5ml)。

5.细胞成熟培养液(含白介素6)：

50ml还原型培养液，含10ng/ml白介素6(Peprotech,#200-06)(将白介素6溶解于含0.1％BSA的1×PBS中以配制100ug/ml原液)。

6.细胞成熟培养液(含牛磺胆酸)：

50ml还原型培养液，含10nM牛磺胆酸(Fisher Scientific,#AAA1834603)(将牛磺胆酸溶解于无菌过滤注射水中以配制10uM原液)。

7.细胞成熟培养液(含牛磺胆酸和丁酸钠)：

50ml还原型培养液，含10nM牛磺胆酸(Fisher Scientific,#AAA1834603)(将牛磺胆酸溶解于无菌过滤注射水中以配制10uM原液)和1.8uM丁酸钠(Stemcell Technology,#72242)(将丁酸钠溶解于无菌过滤1×PBS中以配制1.8mM原液)。

2.2D细胞培养实验步骤

2.1.将hMSC以13,000细胞/cm2(每个75cm2培养瓶内含1×106个细胞)的密度培养在hMSC培养液中。

2.2.将培养瓶放置于37℃，5％CO2的加湿培养箱中培养。在细胞贴壁生长至90％-100％之前，每2-3天更换一次培养液。

2.3.当细胞长满培养瓶壁时(5-7天)，吸出上层液并用PBS冲洗培养瓶。在培养瓶中加入与之前培养液相同体积的无血清培养液，并将细胞培养两天。注意在培养过程中使用相差显微镜观察细胞形态。

2.4.在第二天，吸出上层液并用PBS冲洗培养瓶。在培养瓶中加入与之前培养液相同体积的细胞分化培养液，并将细胞培养7天。每2-3天更换一次培养液。注意在培养过程中使用相差显微镜观察细胞形态。此时得到内胚层干细胞。

2.5.在第九天，吸出上层液并用PBS冲洗培养瓶。在培养瓶中加入与之前培养液相同体积的细胞成熟培养液(含10ng/ml白介素6)，并将细胞培养2天。注意在培养过程中使用相差显微镜观察细胞形态。

2.6.在第十一天，吸出上层液并用PBS冲洗培养瓶。在培养瓶中加入与之前培养液相同体积的细胞成熟培养液(含10nM牛磺胆酸)，并将细胞培养2天。注意在培养过程中使用相差显微镜观察细胞形态。

2.7.在第十三天，吸出上层液并用PBS冲洗培养瓶。在培养瓶中加入与之前培养液相同体积的细胞成熟培养液(含10nM牛磺胆酸和1.8uM丁酸钠)，并将细胞培养2天。注意在培养过程中使用相差显微镜观察细胞形态。此时得到胆管细胞。

3.1 3D细胞培养步骤

3.1.根据下表的成分配制3D细胞培养液。

3.2.将2x104的2.7步骤中得到的细胞培养在加入了250ul三维细胞培养液的8孔玻璃细胞盒中。

3.3.将细胞盒放置于37℃，5％CO2的加湿培养箱中培养一个小时。

3.4.在凝固的培养基中继续加入250ul三维细胞培养液。注意在培养过程中使用相差显微镜观察细胞形态。

3.5.在第五天左右，胆管细胞将形成拥有囊泡结构的类器官，并在十四天分枝出管状结构(图1A)。

如图1A所示，胆管细胞放入3D培养基Matrigel后，聚集形成了具有胆管结构的类器官，然而对照组间充质干细胞无法形成有类似结构的类器官。与其他干细胞分化的方法相比，本发明设计的“两步分化法”不需要将干细胞和其他细胞共培养或基因重组，仅仅依靠特定培养条件诱导分化。如图1B所示，Real-time PCR结果显示第6天时内胚层标志物(HNF4、FOXA2和GATA4)开始高表达；第27天胆管标志物明显高表达(CK7、CK19、TGR5、CFTR和AQP1)。通过罗丹明123实验进一步验证了分化得到的胆管细胞的功能。发现MDR1的底物罗丹明123可以在胆管细胞类器官的管腔内聚集，证明了胆管细胞中MDR1的功能(图1C)。

如图2所示，可以发现中空的囊泡结构，胆管标志物(CK7、CK19)高表达。

如图3所示，第9天时82％的细胞表达内胚层标志物CXCR4和FOXA2蛋白(A)，不表达胆管标志物CK7、CK19和Sox9蛋白。第27天时，无论是2D培养基还是3D培养基中85％以上的细胞均共表达胆管标志物CK7和CK19蛋白，不表达内胚层标志物(B、C)。成功分化的胆管细胞注射进裸鼠肝脏两周以后，仍然共表达胆管标志物CK7和CK19蛋白(D)。