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产河豚毒素的堀越氏芽孢杆菌及其分离方法与应用 
    【技术领域】

    本发明涉及一种堀越氏芽孢杆菌，尤其是涉及一种产河豚毒素的堀越氏芽孢杆菌及其分离方法与应用。 

    背景技术

    河豚毒素是一种毒性很强的海洋生物活性物质，最初从豚科鱼(Tetrodontidae)中发现，因此被命名为Tetrodotoxin(TTX)。TTX为非蛋白类神经毒素，其分子中胍氨基是TTX的活性部位，胍氨基在生理条件下通过质子化形成正电活性区域，与神经和肌肉细胞膜表面的Na⁺通道上的专一性受体蛋白的负电性羟基结合，其周围羟基以氢键形式与受体结合，这样Na⁺通道被阻滞，从而影响神经肌肉间兴奋性的传导(参考文献Narahashi T.Pharmacology oftetrodotoxin.J Toxicol‑Toxin Rev，2001，20：67‑84)。它是神经生物学和生理学研究无可替代的工具药，并已投入临床使用。除此之外，TTX在降血压、抗心律失常、缓解痉挛、预防肾功能衰竭、镇痛、局部麻醉等方面具有广泛的应用前景。它在用于抑制癌症剧痛和戒毒时，具有用量少、持效时间长且用后不成瘾等优点，因而具有很大的开发利用价值。 

    基于TTX广阔的医药用途，有必要解决TTX药用开发至关重要的药源问题。TTX在河豚内脏中的分布具有明显的个体、器官、组织差异，其中以肝脏和卵巢含毒素量最高，因此国内外所用的TTX大多是从河豚卵巢等内脏中提取的。随着对河豚的大量捕捞，天然资源逐渐稀少，药源供应受到限制，其价格昂贵，大大增加了生产成本。而人工养殖的河豚含TTX量极低，甚至无毒，难以形成药源资源。河豚毒素不仅存在于河豚体内，而且在其它多种脊椎动物(鱼类)、无脊椎动物(涡虫类、纽虫动物、腹足类和头足类、节肢动物、棘皮动物)体内及海洋沉积物中也广泛存在。有许多研究者认为河豚毒素是由动物体内的共生细菌所产生的(参考文献Yasumoto T，Nagai H，Yasumura D，Michishita T，Endo A，Yotsu M，Kotaki Y.Interspeciesdistribution and possible origin of tetrodotoxin.Ann New York Acad Sci，1986，479：44‑51)。 

    国外早在上世纪80年代就已对微生物生产TTX开展了研究，并取得了一定的成果。河豚毒素产生菌广泛存在于温带、热带海水及海洋动物中。这些微生物主要可归类于弧菌属(Vibrio)、假单胞菌属(Pseudomonas)、气单胞菌属(Aeromonas)、邻单胞菌属(Plesionmanas)、芽孢杆菌属(Bacillus)、微球菌属(Micrococcus)、交替单胞菌属(Alteromonas)等，放线菌主要是 链霉菌(Streptomyces)。这些都初步证实了TTX的微生物起源学说，这也使得微生物产TTX成为现今TTX的研究热点。 

    但迄今为止，微生物产TTX的量都很少，很难实现产业化。如果能解决产TTX的微生物发酵问题，无疑对于开辟TTX药源新资源，进而广泛应用于临床将是河豚毒素研究领域一项重大的技术跨越。这不仅可以解决大量捕杀河豚鱼受到资源、时空限制且产量低这一瓶颈难题，而且还可避免破坏河豚鱼资源及破坏生态平衡等问题，这将成为国际上研究开发TTX的一条主要途径和发展趋势。 

    【发明内容】

    本发明的目的在于提供一种产河豚毒素的堀越氏芽孢杆菌及其分离方法。 

    本发明的另一目的在于提供堀越氏芽孢杆菌用于合成河豚毒素的用途。 

    本发明所述产河豚毒素的堀越氏芽孢杆菌命名为堀越氏芽孢杆菌(Bacillus horikoshii)S184(以下简称菌株S184)，已于2009年09月07日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(地址为北京市朝阳区大屯路，中国科学院微生物研究所，邮政编码100101)，登记入册编号为CGMCC No.3266。 

    本发明所述堀越氏芽孢杆菌Bacillus horikoshii S184从河豚鱼分离得到，其在Zobell2216E固体培养基上呈圆形、奶油状微黄色菌落，边缘整齐，表面光滑湿润；S184可以利用淀粉和麦芽糖，不利用木糖、L‑阿拉伯糖、D‑半乳糖、L‑鼠李糖、D‑山梨醇、α‑乳糖、D‑果糖、D‑葡萄糖、蔗糖、甘油、肌醇，不可以还原硝酸盐，在甘露醇存在时可产酸，可以水解淀粉、吐温80，能液化明胶，可在10～40℃生长，在百分数浓度为0～10％的氯化钠中均能生长，最适生长的pH为8；将菌株S184的部分16S rDNA序列，与GeneBank中的相关菌株Blastn比较，结果显示菌株S184与堀越氏芽孢杆菌Bacillus horikoshii(DSM 8719)的同源性最高，达到100％(815/815)。 

    本发明所述从河豚鱼分离产河豚毒素的堀越氏芽孢杆菌的方法包括以下步骤： 

    1)去除河豚鱼表面脏物，解剖河豚鱼，取出各器官并分别称重，分开放入无菌的容器中； 

    2)在无菌条件下，分别在盛有各器官的容器中加入生理盐水，研磨，即获得了浓度为10⁰的各器官匀浆液，然后分别对各器官匀浆液，用无菌海水稀释，得悬液，再均匀涂布于培养基上培养； 

    3)每天观察菌落形态、大小及颜色差异，挑取形态不一致的菌落并在新的培养基上划线纯化，直到长出形态单一的菌落为止。 

    在步骤1)中，所述去除河豚鱼表面脏物可用无菌海水冲洗至少1次；所述解剖河豚鱼最好在无菌条件下解剖河豚鱼；所述各器官包括卵巢、肝脏、肠道、胆囊等。 

    在步骤2)中，所述分别在盛有各器官的容器中加入生理盐水，最好是按照每1克器官加入1ml生理盐水；所述用无菌海水稀释，最好用无菌海水以10倍稀释法进行系列稀释，得到浓度为10^‑1、10^‑2、10^‑3的悬液；所述均匀涂布于培养基上，最好是各吸取浓度为10^‑1、10^‑2、10^‑3的悬液150μl均匀涂布于Zobell 2216E平板培养基上；所述Zobell 2216E平板培养基为琼脂培养基，琼脂培养基的组成为蛋白胨5g，酵母膏1g，柠檬酸铁0.1g，NaCl 19.45g，MgCl₂5.9g，Na₂SO₄ 3.24g，CaCl₂ 1.8g，KCl 0.55g，NaHCO₃ 0.16g，KBr 0.08g，SrCl₂ 0.034g，H₃BO₃ 0.022g，Na₂SiO₃ 0.004g，NaF 0.0024g，NH₄NO₃ 0.0016g，Na₂HPO₄ 0.008g，水1000ml，琼脂15g，pH7.6±0.2。 

    在步骤3)中，所述新的培养基可采用Zobell 2216E平板培养基；所述Zobell 2216E平板培养基为琼脂培养基，琼脂培养基的组成为蛋白胨5g，酵母膏1g，柠檬酸铁0.1g，NaCl19.45g，MgCl₂ 5.9g，Na₂SO₄ 3.24g，CaCl₂ 1.8g，KCl 0.55g，NaHCO₃ 0.16g，KBr 0.08g，SrCl₂ 0.034g，H₃BO₃ 0.022g，Na₂SiO₃ 0.004g，NaF 0.0024g，NH₄NO₃ 0.0016g，Na₂HPO₄ 0.008g，水1000ml，琼脂15g，pH7.6±0.2。 

    所述堀越氏芽孢杆菌Bacillus horikoshii S184可用于合成河豚毒素，具体步骤如下： 

    将堀越氏芽孢杆菌Bacillus horikoshii S184经琼脂培养基活化后，接于种子培养基，培养后，接种于新的发酵培养基，摇床培养，即得到含河豚毒素的发酵液。 

    所述种子培养基最好采用Zobell 2216E种子培养基，所述培养的时间最好为20～30h，所述接种于新的种子培养基，摇床培养，最好以体积百分比为1％～10％的接种量接种于Zobell2216E发酵培养基，转速为150～200r/min，在20～30℃下摇床培养20～30h。 

    所述Zobell 2216E种子培养基组成为：蛋白胨5g，酵母膏1g，柠檬酸铁0.1g，NaCl 19.45g，MgCl₂ 5.9g，Na₂SO₄ 3.24g，CaCl₂ 1.8g，KCl 0.55g，NaHCO₃ 0.16g，KBr 0.08g，SrCl₂0.034g，H₃BO₃ 0.022g，Na₂SiO₃ 0.004g，NaF 0.0024g，NH₄NO₃ 0.0016g，Na₂HPO₄ 0.008g，水1000ml，pH7.6±0.2。 

    所述Zobell 2216E发酵培养基的组成为：蛋白胨0.5～10g，酵母膏0.5～1g，磷酸盐0～0.1g，柠檬酸铁0.1g，NaCl 10～50g，MgCl₂ 5.9g，Na₂SO₄ 3.24g，CaCl₂ 1.8g，KCl 0.55g，NaHCO₃ 0.16g，KBr 0.08g，SrCl₂ 0.034g，H₃BO₃ 0.022g，Na₂SiO₃ 0.004g，NaF 0.0024g，NH₄NO₃ 0.0016g，Na₂HPO₄ 0.008g，水1000ml，pH5～8。 

    本发明从河豚鱼体内分离可以产河豚毒素的微生物，操作简单，分离效果好，能得到所需的菌株；使用微生物发酵产生河豚毒素，不受季节和河豚鱼原料限制，还可避免破坏生态平衡，而且成本低，反应条件温和、环境污染小、周期短、生产效率高。 

    【附图说明】

    图1为河豚毒素标准品的高效液相图谱。在图1中，横坐标为时间(min)，纵坐标为吸收强度。 

    图2为菌株S184发酵产物的高效液相图谱。在图2中，横坐标为时间(min)，纵坐标为吸收强度。 

    【具体实施方式】

    将捕自台湾海峡的新鲜河豚鱼，立即运回实验室；用无菌海水冲洗3次，以去除河豚鱼表面脏物，在无菌条件下解剖河豚鱼，取出卵巢、肝脏、肠道、胆囊并分别称重，分开放入无菌的研钵中；按照每1克器官加入1ml生理盐水的量分别在放有卵巢、肝脏、肠道、胆囊的研钵中加入生理盐水，研磨，即获得了浓度为10⁰的卵巢、肝脏、肠道、胆囊匀浆液，然后分别对卵巢、肝脏、肠道、胆囊匀浆液，用无菌海水以10倍稀释法进行系列稀释，得到浓度为10^‑1、10^‑2、10^‑3的悬液，各吸取150μl均匀涂布于Zobell 2216E平板培养基上，放置于25℃恒温培养箱内培养；每天观察菌落形态、大小及颜色差异，挑取形态不一致的菌落并在新的Zobell 2216E平板培养基上划线纯化，直到长出形态单一的菌落为止；将分离到的单菌落接种于Zobell 2216E液体培养基，28℃，200r/min摇床培养1～3天，培养结束后，发酵液进行离心处理，用活性炭和C18小柱进行纯化，得到的样品用于高效液相色谱和小鼠生物检测，筛选得到产河豚毒素的菌株S184。 

    从琼脂培养基上挑取S184，接于Zobell 2216E种子培养基，培养20～30h后，以体积百分比为1％～10％的接种量接种于Zobell 2216E发酵培养基，150～200r/min，在20～30℃下摇床培养20～30h，即得到了含河豚毒素的发酵液。 

    实施例1 

    从琼脂培养基上挑取菌株S184，转接于Zobell 2216E种子培养基，200r/min，28℃下摇床培养24h，将种子液以体积百分比5％的接种量接种于Zobell 2216E发酵培养基，其中蛋白胨含量为0.5％(m/v)，氯化钠浓度为1％(m/v)，并加入0.01％(m/v)的磷酸盐，pH7.5，装液量为20％(100ml/500ml)，20℃下，200r/min摇床培养24h，即得到了含河豚毒素的发酵液。发酵液经生化分离，经高效液相色谱分析得，河豚毒素含量为666.65ng/L。 

    实施例2 

    从琼脂培养基上挑取菌株S184，转接于Zobell 2216E种子培养基，200r/min，28℃下摇床培养24h，将种子液以5％(v/v)的接种量接种于Zobell 2216E发酵培养基，其中蛋白胨含量为0.5％(m/v)，酵母提取物浓度为0.05％(m/v)，氯化钠浓度为1％(m/v)，不加磷酸盐，pH5.5， 装液量为30％(150ml/500ml)，28℃下，200r/min摇床培养24h，即得到了含河豚毒素的发酵液。发酵液经生化分离，高效液相色谱分析得，河豚毒素含量为357.20ng/L。 

    实施例3 

    从琼脂培养基上挑取菌株S184，转接于Zobell 2216E种子培养基，200r/min，28℃下摇床培养24h，将种子液以1.1454％(v/v)的接种量接种于Zobell 2216E发酵培养基，其中蛋白胨含量为0.75％(m/v)，氯化钠浓度为1％(m/v)，并加入0.006％(m/v)的磷酸盐，pH7.5，装液量为20％(100ml/500ml)，20℃下，200r/min摇床培养24h，即得到了含河豚毒素的发酵液。发酵液经生化分离，高效液相色谱分析得，河豚毒素含量为1900.60ng/L。 

    实施例4 

    从琼脂培养基上挑取菌株S184，转接于Zobell 2216E种子培养基，200r/min，28℃下摇床培养24h，将种子液以10％(v/v)的接种量接种于Zobell 2216E发酵培养基，其中氯化钠浓度为1％(m/v)，并加入0.01％(m/v)的磷酸盐，pH7.5，装液量为20％(100ml/500ml)，20℃下，200r/min摇床培养24h，即得到了含河豚毒素的发酵液。发酵液经生化分离，高效液相色谱分析得，河豚毒素含量为2168.04ng/L。 

    实施例5 

    从琼脂培养基上挑取菌株S184，转接于Zobell 2216E种子培养基，200r/min，28℃下摇床培养24h，将种子液以10％(v/v)的接种量接种于Zobell 2216E发酵培养基，不加入磷酸盐，pH7.5，装液量为20％(100ml/500ml)，28℃下，200r/min摇床培养24h，即得到了含河豚毒素的发酵液。发酵液经生化分离，进行高效液相色谱分析，结果如图1和图2所示。