一种高产纤维素酶的密丝明孢曲霉及其发酵方法与应用.pdf

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1、(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201811273756.8 (22)申请日 2018.10.30 (66)本国优先权数据 201810415546.1 2018.05.03 CN (83)生物保藏信息 CGMCC No.11991 2016.01.07 (71)申请人 西南交通大学 地址 610031 四川省成都市金牛区二环路 北一段111号 (72)发明人 刘洋邱忠平孟涛龚正君 王冬梅樊超李明星汤国雄 (74)专利代理机构 成都虹盛汇泉专利代理有限 公司 51268 代理人 王伟 (51)Int.Cl. C。

2、12N 1/14(2006.01) C12N 9/42(2006.01) C12P 7/10(2006.01) C12P 19/14(2006.01) C12P 19/02(2006.01) C12R 1/645(2006.01) C12R 1/865(2006.01) (54)发明名称 一种高产纤维素酶的密丝明孢曲霉及其发 酵方法与应用 (57)摘要 本发明公开了一种高产纤维素酶的密丝明 孢曲霉SartoryaVuillW-10， 保存编号为CGMCC No.11991。 本发明通过密丝明孢曲霉(Sartorya VuillW-10)发酵可以获得高产的纤维素粗酶 液， 其中纤维素酶的滤纸酶活。

3、力可达到1.26U/ ml； 将发酵得到的纤维素酶应用于生物乙醇制备 中， 可以有效提高秸秆残渣酶解率和乙醇产量， 具有一定的应用价值。 本发明不仅生产成本低， 乙醇得率高， 有利于生物乙醇的商业化应用与实 施， 同时也为废弃生物的综合利用提供了一条途 径。 权利要求书1页 说明书8页 附图1页 CN 109182150 A 2019.01.11 CN 109182150 A 1.一种高产纤维素酶的密丝明孢曲霉Sartorya Vuill W-10， 保存编号为CGMCC No.11991。 2.一种采用权利要求1所述的密丝明孢曲霉发酵产纤维素酶的方法， 其特征在于， 步骤 如下： (1)配制。

4、培养基： 按照硝酸钾4g、 乳糖或葡萄糖4g、 尿素0.2g、 磷酸氢二钾1.5g、 Mandel s营养液26ml、 麸皮412g、 硫酸镁0.5g、 氯化钙0.3g、 氢氧化钠预处理后的秸秆粉30g的 比例配制得到培养基， 用去离子水定容至1000mL， 并利用无机酸调节培养基的pH值为2.5 3.5； (2)接种密丝明孢曲霉种子液： 按照培养基体积的815， 将密丝明孢曲霉种子液接 种于步骤(1)制备的培养基中； (3)制备纤维素酶： 将接种密丝明孢曲霉的培养基于4555、 180r/m条件下发酵68 天即得含有纤维素酶的粗酶液。 3.根据权利要求2所述采用密丝明孢曲霉发酵产纤维素酶的方。

5、法， 其特征在于所述步 骤(1)中， 无机酸为盐酸、 硝酸或硫酸。 4.根据权利要求2所述采用密丝明孢曲霉发酵产纤维素酶的方法， 其特征在于所述步 骤(1)中， 按照4060ml/250ml的装瓶量， 将配制的培养基分装到发酵容器中。 5.权利要求2至4任一权利要求所述方法制备的纤维素酶在制备生物乙醇中的应用。 6.根据权利要求5所述纤维素酶在制备生物乙醇中的应用， 其特征在于所述生物乙醇 的制备过程为： 以秸秆残渣作为底物， 将底物、 含有纤维素酶的粗酶液加入到发酵容器中得 到底物浓度为40100g/L的混合液， 并利用无机酸和氢氧化钠溶液调节混合液的pH值为5 6， 于3050、 1201。

6、80r/min条件下添加吐温-80非离子型表面活性剂、 含有纤维素二 糖酶的粗酶液和酿酒酵母， 同步糖化发酵34天， 即得生物乙醇。 7.根据权利要求6所述纤维素酶在制备生物乙醇中的应用， 其特征在于每克底物中纤 维素酶的纸滤酶活力为515FPU、 纤维二糖酶酶活力为515CBU。 8.根据权利要求6所述纤维素酶在制备生物乙醇中的应用， 其特征在于所述吐温-80的 终浓度为110g/L。 9.根据权利要求6所述纤维素酶在制备生物乙醇中的应用， 其特征在于所述酿酒酵母 浓度为8g/L。 权利要求书 1/1 页 2 CN 109182150 A 2 一种高产纤维素酶的密丝明孢曲霉及其发酵方法与应用。

7、 技术领域 0001 本发明属于微生物发酵工程技术领域， 涉及一种能够实现纤维素酶高产的密丝明 孢曲霉以及采用该密丝明孢曲霉进行发酵生产纤维素酶的方法。 背景技术 0002 秸秆等木质纤维素废弃物的资源化利用不仅能够降低其对环境的负面影响， 还能 成为可再生、 可持续能源的有效来源。 对于第二代生物乙醇生产， 木质纤维素已成为最可行 的技术选择(Belal,E.B.Bioethanol production from rice straw residues.Braz J Microbiol.2013,44(1):225-234)。 木质纤维素乙醇化过程中， 利用纤维素酶对木质纤维素 进行水解，。

8、 并将水解产物发酵制备生物乙醇； 其中， 纤维素酶的生产直接影响到木质纤维素 的水解以及后续发酵过程， 是乙醇化技术大规模应用的主要限制环节(Novy V,Longus K, Nidetzky B.2015)。 0003 纤维素由一千个左右的葡萄糖分子聚合而成， 而纤维素酶能水解纤维素生成小分 子的葡萄糖(周俊强邱忠平韩云平等， 纤维素降解菌的筛选及其产酶特性.环境工程学报, 2010,(03):705-708)。 目前， 生产纤维素酶的菌种主要有真菌和细菌两大类， 其中真菌所产 纤维素酶具有较高的催化效率(谢占玲， 吴润,纤维素酶的研究进展.草业科学， 2004,21 (4):72-76)，。

9、 和细菌不同的是， 绝大多数真菌所产纤维素酶都是胞外酶， 这又使得低成本分 离活性液态酶变为可能(韩学易陈惠吴琦,等.产纤维素酶枯草芽孢杆菌C-36的产酶条件研 究.四川农业大学学报,2006,(02):178-181)。 利用真菌产纤维素酶正被广泛地应用于发酵 产糖和生物乙醇的工业生产中(F.Talebnia,D.Karakashev,I.Angelidaki,Production of bioethanol from wheat straw:an overview on pretreatment,hydrolysis and fermentation.Bioresour Technol,2。

10、010,101:4744-4753)。 已分离筛选的多种产纤维素酶 的真菌菌种包括孢霉属、 毛壳霉属、 绿色木霉、 康氏木霉、 青霉、 白腐菌、 镰刀菌和根霉等 (Murashima K ,Nishimura T ,Nakamura Y ,et al .， 2002Purification and characterization of new endo-1,4- -d-glucanases from Rhizopus oryzae.Enzyme Microb Tech 30:319326； 兰时乐陈娴李慧， 2003产纤维素酶菌种TP1202的选育及产酶条 件研究, 生物技术 2003,13。

11、(2):12-13； Kovacs K,Marcelli S,Szakacs G et al.， 2009Enzymatic hydrolysis of steam-pretreated lignocellulosic materials with Trichoderma atroviride enzymes produced in-house，Biotechnology for Biofuels ,2009,2(1):14)。 0004 然而现有生产纤维素酶的真菌多以复合菌剂为主， 其生产过程中有时仍需增添纤 维素酶以提升对木质纤维素的酶解率， 从而提高最终的乙醇得率， 这必将增加生产成本，。

12、 影 响企业经济效益。 0005 因此， 研究一种可以实现纤维素酶高产的单一真菌菌株是很有意义的。 说明书 1/8 页 3 CN 109182150 A 3 发明内容 0006 本发明的目的旨在， 针对目前缺少制备纤维素酶单一菌株的技术现状， 提供一种 可以实现高纤维素酶高产的密丝明孢曲霉Sartorya sp.Vuill W-10。 0007 上述密丝明孢曲霉， 已于2016年1月7日提交保藏， 保藏单位为中国微生物菌种保 藏管理委员会普通微生物中心(Chnia General Microbiological Culture Collection Center,CGMCC)， 保藏地址为北京。

13、市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所， 保 存编号为CGMCC No.11991， 分类命名为密丝明孢曲霉Sartorya sp.Vuill W-10。 0008 上述密丝明孢曲霉， 可以本领域常规手段确定其种属。 0009 经研究发现， 上述密丝明孢曲霉在种子(PDA， Potato Dextrose Agar)培养基上生 长较快， 在30条件下恒温培养2-3天， 菌落直径达3-4cm。 菌丝层较薄， 初生菌丝为白色， 后 期菌落呈灰褐色， 菌落背面无色； 密丝明孢曲霉具有双层小梗的分生孢子头， 分生孢子呈长 链状， 子囊果呈菌核状， 子囊孢子呈扁球形或球形， 子囊孢子无色。 0。

14、010 本发明采用的种子培养基的制备过程为： 蛋白胨20g、 葡萄糖20g、 酵母膏10g、 氯化 钠0.5g， 七水硫酸亚铁0.005g、 氯化钙0.3g、 硫酸镁0.5g、 磷酸氢二钾2g的比例配制得到种 子培养基预混物， 用去离子水定容到1000mL， 并利用1mol/L的盐酸和1mol/L的氢氧化钠溶 液调节种子培养基预混物的pH值为7， 然后于121灭菌20min， 冷却后即得种子培养基； 获 得的种子培养基可以放置于4进行贮存备用。 0011 本发明的另一目的在于提供一种采用上述密丝明孢曲霉发酵产纤维素酶的方法， 具体步骤如下： 0012 (1)配制培养基： 按照硝酸钾4g、 乳糖。

15、或葡萄糖4g、 尿素0.2g、 磷酸氢二钾1.5g、 Mandel s营养液26ml、 麸皮412g、 硫酸镁0.5g、 氯化钙0.3g、 氢氧化钠预处理后的秸秆 粉30g的比例配制得到培养基， 用去离子水定容至1000mL， 并利用无机酸调节培养基的pH值 为2.53.5； 0013 (2)接种密丝明孢曲霉种子液： 按照培养基体积的815， 将密丝明孢曲霉种子 液接种于步骤(1)制备的培养基中； 0014 (3)制备纤维素酶： 将接种密丝明孢曲霉的培养基于4555、 180r/m条件下发酵 68天即得含有纤维素酶的粗酶液。 0015 上述采用密丝明孢曲霉发酵产纤维素酶的方法， 以硝酸钾、 尿。

16、素为氮源， 以乳糖或 葡萄糖、 麸皮、 秸秆粉为碳源， 以磷酸二氢钾为磷源， 以磷酸二氢钾、 硫酸镁、 氯化钙作为无 机盐来源。 0016 上述采用密丝明孢曲霉发酵产纤维素酶的方法， 可以采用本领域已经披露的常规 手段获得Mandel s营养液(参考文献糖蜜酒精废液诱导康氏木霉产纤维素酶的研究， 林元 山， 广西大学， 硕士学位论文， 2004)。 0017 上述采用密丝明孢曲霉发酵产纤维素酶的方法， 可以采用本领域已经披露的常规 手段获得氢氧化钠预处理后的秸秆粉(参考文献Y Liu， Z Qiu， G WangOptimized Alkaline Pretreatment Technolog。

17、y of Rice Straw for Ethanol ProductionJAdvances in Engineering Research 2015， 1169-1173)。 0018 上述采用密丝明孢曲霉发酵产纤维素酶的方法， 所述无机酸为盐酸、 硝酸或硫酸， 其浓度为1mol/L5mol/L。 说明书 2/8 页 4 CN 109182150 A 4 0019 上述采用密丝明孢曲霉发酵产纤维素酶的方法， 所述步骤(1)中， 按照4060ml/ 250ml的装瓶量， 将配制的培养基分装到发酵容器中。 0020 上述采用密丝明孢曲霉发酵产纤维素酶的方法， 所述步骤(2)中， 可以采用本领域。

18、 已经披露的常规手段获得密丝明孢曲霉种子液(参考文献王梅； 石璟； 谭德水， 等， 枯草芽孢 杆菌MSJ-5产 -甘露聚糖酶的性质研究J福建农业学报， 2015年第03期)。 0021 上述采用密丝明孢曲霉发酵产纤维素酶的方法， 所述步骤(3)中， 可以进一步对发 酵所得产物进行离心以去除固形物； 离心转速35004000r/min， 离心时间为510min。 0022 本发明进一步提供了上述方法制备的纤维素酶在制备生物乙醇中的应用， 并进一 步说明了采用上述纤维素酶制备生物乙醇的制备过程， 分别由密丝明孢曲霉(Sartorya sp.Vuill W-10)和黑曲霉(Aspergillus n。

19、iger)发酵分别得到含有纤维素酶和纤维二糖酶 的粗酶液； 再利用纤维素酶和纤维二糖酶共同酶解经2氢氧化钠预处理后的秸秆； 同时利 用酿酒酵母对秸秆进行同步糖化发酵， 即可制得生物乙醇。 具体的生物乙醇的制备过程为： 以秸秆残渣作为底物， 将底物、 含有纤维素酶的粗酶液加入到发酵容器中得到底物浓度为 40100g/L的混合液， 并利用无机酸(与前述一样)和氢氧化钠溶液调节混合液的pH值为5 6， 于3050、 120180r/min条件下添加吐温-80非离子型表面活性剂、 含有纤维素二 糖酶的粗酶液和酿酒酵母， 同步糖化发酵34天， 即得生物乙醇； 所述吐温-80的终浓度为1 10g/L； 每。

20、克底物中纤维素酶的纸滤酶活力为515FPU、 纤维二糖酶酶活力为515CBU； 所述酿酒酵母浓度为8g/L。 0023 上述生物乙醇的制备过程中， 所述氢氧化钠处理后的秸秆粉(也即秸秆残渣)是由 秸秆通过本领域已经披露的常规手段处理得到(参考文献Y Liu， Z Qiu， G WangOptimized Alkaline Pretreatment Technology of Rice Straw for Ethanol ProductionJ Advances in Engineering Research 2015， 1169-117)。 本发明采用的处理方法为： 先将秸 秆粉碎后过20目筛。

21、， 过筛后产物于60风干至恒重， 再用浓度为2的NaOH溶液于100条 件下预处理2h后分离出残渣， 即可。 0024 上述生物乙醇的制备过程中， 所述含有纤维素二糖酶的粗酶液是由黑曲霉发酵得 到， 其发酵过程可以采用本领域已经披露的常规手段(参考文献孟勇， 王忠彦， 苗艳芳， 胡承 关于黑曲霉生产纤维二糖酶发酵条件的研究，四川大学学报(自然科学版) ， 2002,39(5)； 938942)。 0025 本发明采用的秸秆为水稻秸秆或/和小麦秸秆。 0026 与现有技术相比， 本发明具有以下有益效果： 0027 1、 本发明通过提供的密丝明孢曲霉(Sartorya sp.Vuill W-10)。

22、单一菌株发酵便 可以获得纤维素酶， 不需要额外添加用于提升木质纤维素酶得率的纤维素酶， 有助于降低 生产成本， 提升企业经济效益； 0028 2、 本发明通过密丝明孢曲霉(Sartorya sp.Vuill W-10)发酵获得的粗酶液中纤 维素酶的滤纸酶活力可达到1.26U/ml， 具有较高的产酶效率； 0029 3、 本发明将通过密丝明孢曲霉(Sartorya sp.Vuill W-10)发酵得到的纤维素酶 应用于生物乙醇制备中， 促进酶解过程， 提升还原糖中葡萄糖的比例， 秸秆残渣酶解率可以 达到87， 乙醇产量可以高达0.43g/g DW， 不仅提高了秸秆残渣的酶解率， 而且提高了生物 。

23、乙醇产量， 具有一定的应用价值； 说明书 3/8 页 5 CN 109182150 A 5 0030 4、 本发明不仅生产成本低， 乙醇得率高， 有利于生物乙醇的商业化应用与实施， 同 时也为废弃生物的综合利用提供了一条途径。 附图说明 0031 图1为密丝明孢曲霉形貌示意图； 其中(a)为密丝明孢曲霉菌落特征， (b)为密丝明 孢曲霉培养的镜下形态1， (c)为密丝明孢曲霉培养的镜下形态2， (d)为密丝明孢曲霉孢子。 具体实施方式 0032 以下结合实施例对本发明作进一步解释。 0033 以下实施例13中采用的密丝明孢曲霉种子液的制备过程为： 将一环密丝明孢曲 霉孢子从斜面培养基中接种于5。

24、0ml种子培养基上， 于30、 180r/min条件下培养36h， 即得 密丝明孢曲霉种子液， 得到的种子液浓度为OD600 2.0(参考文献王梅； 石璟； 谭德水， 等， 枯 草芽孢杆菌MSJ-5产 -甘露聚糖酶的性质研究J福建农业学报， 2015年第03期)。 采用的种 子培养基的制备过程为： 将蛋白胨20g、 葡萄糖20g、 酵母膏10g、 氯化钠0.5g， 七水硫酸亚铁 0.005g、 氯化钙0.3g、 硫酸镁0.5g、 磷酸氢二钾2g的比例配制得到种子培养基预混物， 用去 离子水定容到1000mL， 并利用1mol/L的盐酸和1mol/L的氢氧化钠溶液调节种子培养基预混 物的pH值为。

25、7， 然后于121灭菌20min， 冷却后即得种子培养基； 获得的种子培养基可以放 置于4进行贮存备用。 0034 以下实施例13中采用的Mandel s营养液是按照 糖蜜酒精废液诱导康氏木霉产 纤维素酶的研究 (林元山， 广西大学， 硕士学位论文， 2004)中有关Mandel s营养液的制备 过程制备得到的。 0035 以下实施例13中采用的氢氧化钠预处理后的秸秆粉 【也即实施例418中底物 (秸秆残渣】 制备过程相同， 均是按照 Optimized Alkaline Pretreatment Technology of Rice Straw for Ethanol Production 。

26、(Y Liu， Z Qiu， G Wang， JAdvances in Engineering Research2015， 1169-1173)中有关氢氧化钠预处理秸秆粉的过程制备得到 的， 具体制备过程为： 先将水稻秸秆粉碎后过20目筛， 过筛后产物于60风干至恒重， 再用 浓度为2的NaOH溶液于100条件下预处理2h后分离出残渣， 即可。 0036 以下实施例818中采用的含有纤维二糖酶的粗酶液是按照 关于黑曲霉生产纤 维二糖酶发酵条件的研究 (孟勇， 王忠彦， 苗艳芳， 胡承，四川大学学报(自然科学版) ， 2002,39(5)； 938942)中有关纤维二糖酶的制备过程制备得到的。 。

27、0037 以下实施例13中纤维素酶活性测试方法为： 在试管中加入50mg的新华滤纸条， 加入1mL的柠檬酸缓冲液(pH4.8， 缓冲液中柠檬酸浓度为0.05mol/L)， 后加入0.5mL适当稀 释的粗酶液， 在50水浴的条件下反应30min， 反应结束后加入2mLDNS试剂， 沸水浴5min， 加 蒸馏水稀释至20mL后混匀， 在520nm条件下比色， 测得吸光度值经葡萄糖标曲计算出反应结 束后还原糖的量， 扣除酶液和底物还原糖(可以通过与酶空白及底物空白的对照实验组比 对获得)后计算酶活力。 0038 一个滤纸酶活力单位(FPU)定义为： 酶促反应中每分钟生成1 mol葡萄糖所需的酶 量。。

28、 说明书 4/8 页 6 CN 109182150 A 6 0039 0040 式中， 稀释倍数是指将实施例13中所得粗酶液稀释后体积与稀释前体积之比。 0041 本发明提供了一种可以实现高纤维素酶高产的密丝明孢曲霉Sartorya sp.Vuill W-10。 上述密丝明孢曲霉， 已于2016年1月7日提交保藏， 保藏单位为中国微生物菌种保藏管 理委员会普通微生物中心(Chnia General Microbiological Culture Collection Center,CGMCC)， 保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所， 保 存编号为CGMCC No.1。

29、1991， 分类命名为密丝明孢曲霉Sartorya sp.Vuill W-10。 0042 如图1所示， 上述密丝明孢曲霉具有以下特点： 菌丝层较薄， 初生菌丝为白色， 后期 菌落呈灰褐色， 菌落背面无色； 密丝明孢曲霉具有双层小梗的分生孢子头， 分生孢子呈长链 状， 子囊果呈菌核状， 子囊孢子呈扁球形或球形， 子囊孢子无色。 0043 实施例1 0044 采用密丝明孢曲霉(Sartorya sp.Vuill W-10)制备纤维素酶的具体制备过程如 下： 0045 (1)配制培养基： 按照硝酸钾4g、 乳糖4g、 尿素0.2g、 磷酸氢二钾1.5g、 Mandel s营 养液3ml、 麸皮6g。

30、、 硫酸镁0.5g、 氯化钙0.3g、 氢氧化钠预处理后的秸秆粉30g的比例配制得 到培养基， 用去离子水定容至1000mL， 并利用1mol/L的盐酸调节培养基的pH值为3； 然后按 照43mL/250mL的装瓶量， 将配制的培养基分装到发酵容器中； 0046 (2)接种密丝明孢曲霉种子液： 按照培养基体积的10， 将密丝明孢曲霉种子液接 种于盛有培养基的发酵容器中； 0047 (3)制备纤维素酶： 将接种密丝明孢曲霉的培养基于50、 180r/m条件下发酵6天， 然后将发酵产物于4000r/min离心5min， 即得含有纤维素酶的粗酶液。 0048 对得到的粗酶液进行纤维素酶活性测试， 得。

31、到纤维素酶的滤纸酶活力为1.26FPU/ ml。 0049 实施例2 0050 采用密丝明孢曲霉(Sartorya sp.Vuill W-10)制备纤维素酶的具体制备过程如 下： 0051 (1)配制培养基： 按照硝酸钾4g、 乳糖4g、 尿素0.2g、 磷酸氢二钾1.5g、 Mandel s营 养液6ml、 麸皮12g、 硫酸镁0.5g、 氯化钙0.3g、 氢氧化钠预处理后的秸秆粉30g的比例配制得 到培养基， 用去离子水定容至1000mL， 并利用1mol/L的盐酸调节培养基的pH值为2.5； 然后 按照60mL/250mL的装瓶量， 将配制的培养基分装到发酵容器中； 0052 (2)接种。

32、密丝明孢曲霉种子液： 按照培养基体积的8， 将密丝明孢曲霉种子液接 种于盛有培养基的发酵容器中； 0053 (3)制备纤维素酶： 将接种密丝明孢曲霉的培养基于45、 180r/m条件下发酵7天， 然后将发酵产物于3500r/min离心10min， 即得含有纤维素酶的粗酶液。 0054 对得到的粗酶液进行纤维素酶活性测试， 得到纤维素酶的滤纸酶活力为0.92U/ ml。 0055 实施例3 说明书 5/8 页 7 CN 109182150 A 7 0056 采用密丝明孢曲霉(Sartorya sp.Vuill W-10)制备纤维素酶的具体制备过程如 下： 0057 (1)配制培养基： 按照硝酸钾。

33、4g、 乳糖4g、 尿素0.2g、 磷酸氢二钾1.5g、 Mandel s营 养液2ml、 麸皮4g、 硫酸镁0.5g、 氯化钙0.3g、 氢氧化钠预处理后的秸秆粉30g的比例配制得 到培养基， 用去离子水定容至1000mL， 并利用3mol/L的盐酸调节培养基的pH值为3.5； 然后 按照40mL/250mL的装瓶量， 将配制的培养基分装到发酵容器中； 0058 (2)接种密丝明孢曲霉种子液： 按照培养基体积的15， 将密丝明孢曲霉种子液接 种于盛有培养基的发酵容器中； 0059 (3)制备纤维素酶： 将接种密丝明孢曲霉的培养基于55、 180r/m条件下发酵8天， 然后将发酵产物于4000。

34、r/min离心5min， 即得含有纤维素酶的粗酶液。 0060 对得到的粗酶液进行纤维素酶活性测试， 得到纤维素酶的滤纸酶活力为1.15U/ ml。 0061 实施例4-7 0062 将实施例1制备的粗酶液加入到四个盛有底物的容器中进行不同底物浓度的糖化 实验： 常温下， 在摇床中以120r/min的速率酶解72小时。 配制的底物浓度及实验结果如表1 所示。 0063 表1实施例4-7不同底物浓度对应的糖化实验结果 0064 0065 从表1中可以看出， 随着底物浓度的增加， 酶解得率在不断下降； 为了保证后续发 酵所产的乙醇浓度， 还要求酶解液具有比较高的还原糖浓度， 因此综合考虑酶解得率和。

35、还 原糖浓度， 在制备生物乙醇时， 优选选择80g/L底物浓度为宜。 0066 实施例8-12 0067 将实施例1制备的粗酶液加入到五个盛有底物的容器中， 配制成底物浓度为80g/L 的混合液,再向混合液中加入含有纤维二糖酶的粗酶液(用量以纤维二糖酶的酶活力计)和 吐温-80分别对底物进行酶解实验： 常温下， 在摇床中以120r/min酶解72小时。 实验原料配 比及实验结果如表2所示。 0068 表2实施例8-12酶解实验原料配比及实验结果 说明书 6/8 页 8 CN 109182150 A 8 0069 0070 注： 上述吐温-80浓度是以吐温-80在容器混合液中的浓度计。 0071。

36、 从表2中可以看出， 底物酶解率随着吐温-80的浓度增加而上升， 在吐温-80浓度达 到5g/L时稻草秸秆72h的酶解得率达到最大值， 为81.8； 但是， 当吐温-80浓度增加到10g/ L时， 酶解得率为81。 因此， 在制备生物乙醇时， 吐温-80添加量优选以5g/L为宜。 0072 实施例13-15 0073 将实施例1制备的粗酶液加入到三个盛有底物的容器中， 配制成底物浓度为80g/L 的混合液50ml,再向50ml混合液中加入含有纤维二糖酶的粗酶液(用量以纤维二糖酶的酶 活力计)和吐温-80分别对底物进行酶解实验： 常温下， 在摇床中以120r/min酶解72小时。 实 验原料配比。

37、及实验结果如表3所示。 0074 表3实施例13-15酶解实验原料配比及实验结果 0075 0076 0077 注： 上述吐温-80浓度是以吐温-80在容器混合液中的浓度计。 0078 从表3中可以看出， 底物酶解率随着纤维二糖酶活力增加而上升， 最大增幅达 2.3,但当纤维二糖酶活力超过10CBU/每克底物时,酶解得率的提升就不再十分明显,因 此， 在制备生物乙醇时， 综合考虑成本和酶解得率,采用酶活力为10CBU/每克底物的纤维二 糖酶为宜。 说明书 7/8 页 9 CN 109182150 A 9 0079 实施例16-18 0080 将实施例1制备的粗酶液加入到三个盛有底物的发酵容器中。

38、， 配制成底物浓度为 80g/L的混合液50ml,并利用1mol/L的盐酸和1mol/L的氢氧化钠溶液调节混合液的pH值为 5-6， 于3050、 120180r/min条件下添加吐温-80、 含有纤维素二糖酶的粗酶液和酿酒 酵母， 对上述物料进行同步糖化发酵3-4天， 即得生物乙醇。 乙醇浓度由气相色谱仪测得。 试 验原料配比及测试结果如表4所示。 0081 表4实施例16-18生物乙醇制备试验原料配比及测试结果 0082 0083 注： (1)上述吐温-80浓度是以吐温-80在容器混合液中的浓度计； 0084 (2)乙醇产量DW是指每1g干秸秆生产酒精的产率。 0085 从表4可以看出， 。

39、将本发明提供的密丝明孢曲霉发酵得到的纤维素酶应用于生物 乙醇制备中， 可以促进酶解过程， 提升还原糖中葡萄糖的比例， 且生产成本低， 制备的乙醇 得率高， 从而有助于生物乙醇的商业化应用和实施。 0086 本领域的普通技术人员将会意识到， 这里所述的实施例是为了帮助读者理解本发 明的原理， 应被理解为本发明的保护范围并不局限于这样的特别陈述和实施例。 本领域的 普通技术人员可以根据本发明公开的这些技术启示做出各种不脱离本发明实质的其它各 种具体变形和组合， 这些变形和组合仍然在本发明的保护范围内。 说明书 8/8 页 10 CN 109182150 A 10 图1 说明书附图 1/1 页 11 CN 109182150 A 11 。