技术领域
本发明属于生物防治植物病害领域。具体而言，本发明涉及一株蜡样芽孢杆菌及其在防治甜瓜枯萎病中的应用，以及采用该蜡样芽孢杆菌制备的生物防治制剂。
背景技术
甜瓜枯萎病是由尖镰孢菌所引起的土传病害，在甜瓜全生育期都可发生。苗期染病，病苗叶色变浅，逐步萎蔫，最后枯死，拨开茎部可见维管束变色。成株期发病，植株叶片由下向上萎蔫下垂，部分叶片叶缘变褐或产生褐色坏死斑，最后全株枯死。发病初期，病株下部叶片及茎基表皮变黄，以后逐渐由下往上萎蔫，似缺水状，早晚可恢复正常，午间又出现萎垂，如此反复数次，整株叶片枯萎下垂、死亡，对瓜农造成严重的经济损失。
目前对于甜瓜枯萎病的防治，常规采用的方法包括：1.培育抗病品种，但抗病品种培育周期长，抗性较为单一且种质资源比较缺乏；2.轮作或嫁接，但工作量大，品质会受到一定影响，降低瓜农的经济收益；3.化学防治，如甲基立枯磷乳油、双效灵等，但易造成农药残留，污染环境，对人畜有伤害；4.生物防治，效果好，对人畜安全无毒，不污染环境。生物防治主要是利用有益的微生物，通过生物间的竞争作用、抗菌作用、重寄生作用、交叉保护作用及诱发抗病性等来抑制某些病原菌的存活和活动，具有无毒、无污染、不产生抗药性、高效的优点，表现出广阔的应用前景。
蜡样芽孢杆菌(Bacillus.cereus)在自然界广泛存在的，具有很高的抗逆能力和抗菌防病作用，许多性状优良的天然分离株已成功的应用于植物病害的生物防治。蜡样芽孢杆菌通过成功定殖至植物根际，体表或体内，同病原菌竞争植物周围的营养、分泌抗菌物质抑制病原菌生长，同时诱导植物防御系统抵御病原菌入侵，从而达到生防的目的。利用蜡样芽孢杆菌防治甜瓜枯萎病具有高效、低残留、与环境友好等优点。
发明内容
本发明的目的是提供一株用于高效防治甜瓜枯萎病的新的微生物——蜡样芽孢杆菌菌株LK0201。本发明的蜡样芽孢杆菌菌株具有高效安全、适应性强，在低营养下即可快速生长繁殖等特点，因此具有良好的应用前景。
本发明所提供的菌株为蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus)LK0201，是从山东省龙口市清汶村甜瓜大棚中分离获得的，已于2017年9月26日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所)，保藏编号为CGMCC No.14669。
本发明的蜡样芽孢杆菌菌株LK0201的培养方法或繁殖方法包括：
(1)普通培养保存采用LB培养基，配方为：胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，氯化钠10g，琼脂15-20g，蒸馏水1000mL，pH调至7.1-7.4；
(2)实验室液体培养采用LB液体培养基，配方为：胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，氯化钠10g，蒸馏水1000mL，pH调至7.1-7.4；
(3)种子液培养基配方：同(2)中LB液体培养基。
(4)大量发酵培养基配方：按质量百分比计，豆饼粉3.00％，玉米粉4.00％，葡萄糖0.40％，鱼粉0.50％，磷酸二氢钾0.03％，轻质碳酸钙1.20％，硫酸铵0.30％，氯化钠0.10％，剩余为水，pH调至7.0-7.2。
本发明还提供了一种生物防治制剂，包含所述的蜡样芽孢杆菌菌株LK0201。
上述生物防治制剂的制备方法，包括以下步骤：
(1)制备蜡样芽孢杆菌菌株LK0201的种子液：将蜡样芽孢杆菌菌株LK0201从试管斜面中挑取少量细菌，移至种子液培养基中，26～30℃摇床振荡培养20～28h，此为种子液；
(2)将步骤(1)制备的种子液在无菌环境下接种到含已灭菌的大量发酵培养基的发酵罐中，26～30℃下恒温培养28～32h；
(3)将步骤(2)培养的发酵液中添加载体(凹凸棒土粉)，混合均匀，经喷雾干燥得到蜡样芽孢杆菌LK0201菌粉。
(4)上述蜡样芽孢杆菌LK0201菌粉可以进一步加入农业上常用的助剂如湿润剂、填充剂等制成生物防治制剂。
本发明还公开了上述的蜡样芽孢杆菌LK0201菌株或者生物防治制剂在防治甜瓜枯萎病中的用途。
并且，本发明还提供了一种用于防治甜瓜枯萎病的生物防治方法，包括向具有枯萎病的甜瓜施用上述蜡样芽孢杆菌菌株LK0201或者上述生物防治制剂。
实验表明，本发明的蜡样芽孢杆菌菌株LK0201具有高效安全、适应性强，在低营养下即可快速生长繁殖等特点，因此具有良好的应用前景。由该蜡样芽孢杆菌菌株LK0201制备的生物防治制剂，不仅能够高效的防治甜瓜枯萎病，还能有效提高甜瓜产量，是一种极具应用前景的生物防治制剂，其防治甜瓜枯萎病的防效高达80％以上。
具体实施方式
实施例1
1、蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus)菌株LK0201的分离与纯化
本发明的蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus)菌株LK0201是从山东省龙口市清汶村甜瓜大棚中采用稀释平板法和平板划线法分离获得的，分离方法为：
⑴蜡样芽孢杆菌的分离：土样的采集，在山东省龙口市清汶村甜瓜大棚中，采用5点取样法，分别采集地块四周和中央深度在10-20cm范围内的甜瓜根际土壤适量，等量混匀。标明采集地点、时间和采集人。称取1g土样于100mL无菌水中，置于30℃摇床中150rpm震荡10min，然后置于60℃水浴锅中孵育30min，取100μL 10-2、10-3、10-4稀释液涂布于LB培养基平板上，每个梯度涂布三个平行，在30℃培养2d后挑取LB培养基上的不同形态的微生物菌落于LB培养基平板上进行划线，定时观察菌落生长情况。然后采用平板划线法，纯化芽孢杆菌菌株，分别编号保存。
⑵甜瓜枯萎病高效拮抗菌株的筛选
①初筛：采用对峙培养法，制备LB平板，用打孔器在芽孢杆菌菌株、甜瓜枯萎病边缘打取直径为5mm的菌饼，分别移植在平板相对的两侧中央，25℃恒温培养，逐日观察芽孢杆菌菌株对病原菌的抑制作用。
②复筛：将筛选到的具有高效拮抗活性的芽孢杆菌菌株进行复筛，主要是经过耐温性、耐酸碱性、耐药性试验，筛选到耐性较好的芽孢杆菌菌株，进行盆栽防治试验。
本发明人通过大量筛选工作得到一株能够高效防治甜瓜枯萎病的蜡样芽孢杆菌菌株LK0201。实验证明，含该蜡样芽孢杆菌原粉的生防制剂在防治甜瓜枯萎病显示出非常高效的防治效果，使其显著增产。因而，本发明的蜡样芽孢杆菌LK0201是具有广泛应用前景的蜡样芽孢杆菌新菌株，可以用于制备防治甜瓜枯萎病的生物防治制剂。
2、菌株鉴定
(1)微生物学特性：在牛肉膏蛋白胨琼脂培养基或LB培养基上菌落大，表面粗糙，扁平，不规则，稍有光泽的白色。在牛肉膏蛋白胨琼脂培养基上，28℃下培养两天后，镜检，菌体细胞呈杆状，末端方，成短或长链，能运动。经革兰氏染色呈阳性(以大肠杆菌为对照)。
(2)分子生物学特性
该菌株的16s rDNA基因序列测定结果如下(SEQ-1)：
GCAGTCGAGCGAATGGATTAAGAGCTTGCTCTTATGAAGTTAGCGGCGGACGGGTGAGTAACACGTGGGTAACCTGCCCATAAGACTGGGATAACTCCGGGAAACCGGGGCTAATACCGGATAACATTTTGAACCGCATGGTTCGAAATTGAAAGGCGGCTTCGGCTGTCACTTATGGATGGACCCGCGTCGCATTAGCTAGTTGGTGAGGTAACGGCTCACCAAGGCAACGATGCGTAGCCGACCTGAGAGGGTGATCGGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTAGGGAATCTTCCGCAATGGACGAAAGTCTGACGGAGCAACGCCGCGTGAGTGATGAAGGCTTTCGGGTCGTAAAACTCTGTTGTTAGGGAAGAACAAGTGCTAGTTGAATAAGCTGGCACCTTGACGGTACCTAACCAGAAAGCCACGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGTGGCAAGCGTTATCCGGAATTATTGGGCGTAAAGCGCGCGCAGGTGGTTTCTTAAGTCTGATGTGAAAGCCCACGGCTCAACCGTGGAGGGTCATTGGAAACTGGGAGACTTGAGTGCAGAAGAGGAAAGTGGAATTCCATGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGAGATATGGAGGAACACCAGTGGCGAAGGCGACTTTCTGGTCTGTAACTGACACTGAGGCGCGAAAGCGTGGGGAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGATGAGTGCTAAGTGTTAGAGGGTTTCCGCCCTTTAGTGCTGAAGTTAACGCATTAAGCACTCCGCCTGGGGAGTACGGCCGCAAGGCTGAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGAAGCAACGCGAAGAACCTTACCAGGTCTTGACATCCTCTGACAACCCTAGAGATAGGGCTTCTCCTTCGGGAGCAGAGTGACAGGTGGTGCATGGTTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTGATCTTAGTTGCCATCATTCAGTTGGGCACTCTAAGGTGACTGCCGGTGACAAACCGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAATCATCATGCCCCTTATGACCTGGGCTACACACGTGCTACAATGGACGGTACAAAGAGCTGCAAGACCGCGAGGTGGAGCTAATCTCATAAAACCGTTCTCAGTTCGGATTGTAGGCTGCAACTCGCCTACATGAAGCTGGAATCGCTAGTAATCGCGGATCAGCATGCCGCGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACACCACGAGAGTTTGTAACACCCGAAGTCGGTGGGGTAACCTTTTTGGAGC。
该菌株为蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus)，已于2017年9月26日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所)，保藏编号为CGMCC No.14669。
实施例2
1、蜡样芽孢杆菌菌株LK0201发酵过程及其生物防治制剂制备过程
种子液培养基配方：胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，氯化钠10g，蒸馏水1000mL，pH调至7.1-7.4；
大量发酵培养基配方：按质量百分比计，豆饼粉3.00％，玉米粉4.00％，葡萄糖0.40％，鱼粉0.50％，磷酸二氢钾0.03％，轻质碳酸钙1.20％，硫酸铵0.30％，氯化钠0.10％，剩余为水pH调至7.0-7.2。
具体过程：
①菌种种子液培养：将蜡样芽孢杆菌菌株LK0201从试管斜面中挑取少量细菌，移至种子液培养基中，28℃摇床振荡培养24h，此为种子液；
②大量发酵培养：将大量发酵培养基物料在发酵罐中灭菌(温度121～124℃，30分钟)在无菌条件下，将培养好的种子液(接种体积比10％)倒入发酵罐中。培养温度28℃，发酵培养30h。转孢率达80％以上，菌数可达65～80亿/ml。
③发酵结束的发酵液中添加载体(凹凸棒土粉)，混合均匀，与载体的质量比：1:0.05，喷雾干燥装置进风温度178℃，出风温度170℃。发酵液经离心喷雾到原重量的10％，得到菌粉，其中蜡样芽孢杆菌LK0201含量≥600亿活菌/g；
④按下述重量比取各原料：步骤(3)所制蜡样芽孢杆菌LK0201菌粉25％；淀粉8％；葡萄糖10％；十二烷基硫酸钠8％；拉开粉2％；豆粕粉10％；剩余量用凹凸棒土粉填充；
⑤上述原料混合均匀，得到防治甜瓜枯萎病的生物防治制剂，其中蜡样芽孢杆菌LK0201含量≥150亿活菌/g。
实施例3田间药效试验
本实施例2提供了含蜡样芽孢杆菌菌株LK0201的生物防治制剂(150亿活菌/g)对甜瓜枯萎病防治效果的相关实验。
1)供试药剂
蜡样芽孢杆菌菌株LK0201生物防治制剂(实施例2提供)，50％菌多灵可湿性粉剂(四川国光农化股份有限公司，市售)；
2)供试作物与防治对象：
供试作物：甜瓜(参种购自莱西市马连庄镇)；
防治对象：枯萎病。
3)试验设计及安排
土壤处理：将土壤用干热法150℃灭菌12h。
病原菌孢子液的制备：将甜瓜枯萎病病菌接种在PDA平板上，在28℃恒温箱中培养7d，用清水洗下病原菌孢子，纱布过滤后制成107个/ml的孢子悬浮液，备用。
甜瓜种子处理：甜瓜种子用无菌水冲洗后置于28℃恒温箱中催芽36h，备用。
试验组A(灌根)：设含蜡样蜡样芽孢杆菌LK0201的生防制剂稀释500倍、750倍、1000倍，50％菌多灵可湿性粉剂500倍液，清水对照5个处理，每个处理4盆，每盆10株。将催芽后的甜瓜种子种于装有无菌土壤的塑料盆中，后加入上述液体，每盆20ml。1天后接种甜瓜枯萎病病菌孢子液，每株2ml。置于恒温培养箱中培养，15d时调查发病情况，计算病情指数及相对防治效果。
试验组B(浸种)：设含蜡样蜡样芽孢杆菌LK0201的生防制剂稀释500倍、750倍、1000倍，50％菌多灵可湿性粉剂500倍液，清水对照5个处理，每个处理4盆，每盆10株。将催芽后的甜瓜种子在每个处理液中拌种1h，后播种于无菌土壤的塑料盆中。1天后接种甜瓜枯萎病病菌孢子液，每株2ml。置于恒温培养箱中培养，15d时调查发病情况，计算病情指数及相对防治效果。
甜瓜枯萎病发病情况按标准划分为5级：
0级——全株无病；
1级——植株1/4以下叶面表现萎蔫症状；
2级——植株1/4到1/2叶面表现萎蔫症状；
3级——植株1/2以上叶面表现萎蔫症状；
4级——全株萎蔫死亡。
根据病理学病情指数，计算防治效果。
相对防效(％)＝[(对照病情指数-处理病情指数)÷对照病情指数]×100
4)结果与分析
表1各个处理后甜瓜枯萎病的病情指数及防治效果
从表1可以看出，由蜡样芽孢杆菌菌株LK0201生产的生物防治制剂稀释500倍后，灌根的防效达85.25％，比50％多菌灵500倍液高出4.87％，而浸种的防效达80.80％与多菌灵500液，二者差异不显著。
微生物活体制剂由于不存在残留问题对环境友好，且本发明的菌株具有生长速度快、产孢量大、防治效果好、抗逆性强，在植物根际能够快速大量定殖等特点。因此，该菌株的筛选及其制剂的研发成功，具有广阔的应用前景。
SEQUENCE LISTING
<110> 青岛秾贝尔生物工程有限公司
<120> 一株蜡样芽孢杆菌及其在防治甜瓜枯萎病中的应用
<130> 0
<160> 1
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 1411
<212> DNA
<213> 蜡样芽孢杆菌（Bacillus cereus）LK0201的16s rDNA基因序列
<400> 1
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