一种寡核苷酸介导的大肠杆菌基因敲除或点突变的方法.pdf

本发明涉及一种通过寡核苷酸介导的重组工程手段对大肠杆菌基因组进行基因敲除或点突变的方法。首先通过重组工程将含有同源臂的蔗糖6-果糖转移酶基因和卡那霉素抗性基因的基因盒整合至靶基因，再将含同源臂的寡核苷酸通过重组工程与基因组上的同源序列进行同源重组而将蔗糖6-果糖转移酶基因和卡那霉素抗性基因去除，从而实现无任何碱基冗余的基因敲除和点突变。基因敲除的寡核苷酸设计与靶基因两侧的碱基序列一致，点突变的寡核苷酸则在寡核苷酸中引入需要突变的碱基。本发明不需要在体外克隆及预先在体外实现某个碱基位点突变或将突变基因转到细菌体内。本发明所述方法能够为遗传学、分子生物学、生物化学等研究及工业化生产提供一个有效的前期操作平台。

1.  一种寡核苷酸介导的大肠杆菌基因敲除或点突变的方法，其特征在于：先通过重组工程将含有同源臂的sacB-neo基因盒整合至大肠杆菌基因组上的靶基因，再将含同源臂的寡核苷酸通过重组工程与基因组上的同源序列进行同源重组而将蔗糖6-果糖转移酶基因和卡那霉素抗性基因去除，从而实现基因敲除和点突变。

2.  如权利要求1所述的方法，其特征在于，是基因敲除的方法，其中sacB-neo基因盒的同源臂的设计原则是：插入位点两侧各50个碱基，插入位点保留靶基因的读码框。

3.  如权利要求2所述的方法，其特征在于，所说的用于基因敲除的含同源臂寡核苷酸为84个碱基，前42个碱基和后42个碱基分别与整合至大肠杆菌基因组上的sacB-neo基因盒前面的42个碱基和后面的42个碱基相同。

4.  如权利要求1所述的，其特征在于，是点突变的方法，其中sacB-neo基因盒的同源臂的设计原则是：插入位点两侧各50个碱基，紧邻插入位点前面的第一个碱基为待突变位点。

5.  如权利要求4所述的方法，其特征在于，所说的用于点突变的含同源臂寡核苷酸为85个碱基，前42个碱基分别为整合至大肠杆菌基因组上的sacB-neo基因盒前面的第2-43个碱基相同，第43个碱基为突变碱基即与紧邻sacB-neo基因盒第一个的碱基不同，点突变的后42个碱基与整合至大肠杆菌基因组上的sacB-neo基因盒后面的42个碱基相同。

6.  如权利要求1所说的方法，其特征在于，以7.5％蔗糖进行寡核苷酸介导的同源重组突变株的筛选。

7.  如权利要求1所说的方法，其特征在于，是使用重组酶表达载体pSC101-BAD-gbaA。

一种寡核苷酸介导的大肠杆菌基因敲除或点突变的方法
技术领域
本发明涉及基因工程领域，具体是涉及一种由寡核苷酸介导的大肠杆菌基因敲除或点突变的方法。
背景技术
大肠杆菌是遗传学、分子生物学、生物化学等研究的重要工具。其典型特征是：生长迅速(倍增时间17分钟)、遗传背景清晰、遗传操作手段多样、多种大肠杆菌的基因组已被解析等等。大肠杆菌也是生产多种活性蛋白、代谢产物(如氨基酸、色素和生物碱)以及次级代谢产物(如生理活性物质)等工业化生产的最重要的菌株之一。鉴于大肠杆菌的重要性，发展快速和简便的对大肠杆菌的基因进行修饰的遗传操作手段非常重要，基因敲除和点突变是其中两个关键的技术。基因敲除的意义在于：大肠杆菌基因组中含有许多对生长或者某特定需要(如表达蛋白或产生特定物质)所不必要甚至不利的基因，将它们去除有利于大肠杆菌的生长以及提高特定目的。点突变的意义在于：一个基因某个或某些位点的改变可能导致期功能的改变或缺失，在基因组上实现点突变将有助于在整体水平上对基因以及其表达的蛋白进行研究。
最初的大肠杆菌基因组修饰是通过大肠杆菌体内重组蛋白RecA所介导的同源重组来实现的。由于大肠杆菌中还存在着能降解线性双链DNA的外切核酸酶RecBCD，因此不能直接转化DNA片段，而必须首先构建环状质粒打靶载体再进行转化。其过程包括：体外用PCR(聚合酶链式反应)、限制酶酶切、连接酶连接等方式将长度为1000个碱基对左右的同源臂装载在质粒载体上，再将筛选标记基因(通常选用抗生素基因)插在两个同源臂中间，最后将打靶载体引入宿主。可见RecA蛋白介导的同源重组反应是一个费时费力的过程。另外RecA系统的重组功能总是处在激活状态，可能会导致一些异常的重组的发生。尽管利用大肠杆菌RecBCD缺陷型菌株可以介导线性打靶载体的体内同源重组，但重组效率十分低。
重组工程的兴起改变了依赖RecA蛋白的历史。重组工程是指由重组酶催化的DNA片段之间的同源重组而在大肠杆菌中进行基因克隆或DNA改造的一种基因工程技术。重组工程在常规基因克隆方法难以进行或效率极低(如待克隆或修饰的DNA片段过大、合适的酶切位点难以寻找、凝胶回收难以进行等等，此时常规基因克隆方法难以进行或效率极低)时有着极大的优势。而且PCR扩增也可能引入错配碱基、DNA片段经紫外线照射等操作也可能基因发生突变。重组工程则避免了这些烦琐操作步骤，可实现高效的基因克隆和修饰，已逐渐成为常规的克隆手段。
重组工程中的重组酶主要是来源自λ噬菌体三个基因，其中exo(redα)编码DNA5′端至3′端的外切酶Exo，其作用于双链DNA分子而产生3′端突出的分子；bet(redβ)编码单链结合蛋白，其结合在由Exo作用而形成的DNA分子的3′突出端，同时还行使重组酶活性，即促进两个单链、同源DNA分子之间的退火；gam基因编码的Gam蛋白的作用是抑制大肠杆菌RecBCD对外源DNA的降解，这三个基因也就是通常意义上的重组酶基因。recA基因可增加重组的效率。
由于重组工程可以短至36个碱基对的同源区域之间实现同源重组，就使得转化线性双链DNA至大肠杆菌而对其基因进行修饰成为可能。此线性双链DNA而通过一步的PCR手段而一步获得。Datsenko等于2000年首先报道了利用重组工程来实现大肠杆菌基因敲除的研究(Datsenko，K.A.and B.L.Wanner，One-step inactivation of chromosomal genes inEscherichia coli K-12 using PCR products.Proc Natl Acad Sci U S A，2000.97(12)：6640-5)。他们将由PCR获得的、两侧含有同源臂(即与靶基因5′端或3′端序列一致的一段碱基序列)和34个碱基的FRT位点序列的抗性基因电转化至重组酶经诱导表达的大肠杆菌中，通过抗性筛选而直接得到了基因敲除的大肠杆菌突变株。此抗性基因可通过Flp酶催化两个FRT序列之间的同源重组而去除。然而最终所得到的菌株仍然含有一个34个碱基的FRT位点序列。冗余序列的存在可能干扰基因组的总体结构、影响其他基因的表达，如极性效应(及处于相同转录方向的、下游基因的表达收到影响)，也给后续的基因修饰带来困难。
为实现不含任何冗余碱基的大肠杆菌基因修饰，Yu等首先将用于基因修饰的同源片段、抗性基因、I-SceI酶和大肠杆菌基因组中所不含有的I-SceI酶切位点序列引入至大肠杆菌基因组中，再通过由失活的氯四环素诱导的I-SceI酶催化I-SceI酶切位点两侧的同源片段的同源重组而将包含抗性基因在内的冗余序列去除(Yu，B.J.，et al.，Rapid and efficientconstruction of markerless deletions in the Escherichia coli genome.Nucleic Acids Res，2008.36(14)：e84.)本方法的优点在于实现了冗余序列的去除和大片段的基因敲除，缺点在于仍需要通过PCR、限制酶酶切、连接酶介导的DNA片段连接等步骤构建400-500bp的用于基因修饰的同源片段，这就增加了时间和难度。
发明内容
针对上述问题，本发明提供了一种通过寡核苷酸介导的重组工程手段来实现大肠杆菌的基因敲除和基因点突变的方法。首先是通过重组工程将含有同源臂的蔗糖6-果糖转移酶基因(sacB)和卡那霉素抗性基因(neo)的基因盒整合至待修饰的基因，含同源臂的sacB-neo基因盒由PCR获得。再将含同源臂的寡核苷酸通过重组工程与基因组上的同源序列进行同源重组而将蔗糖6-果糖转移酶基因和卡那霉素抗性基因去除，从而实现无任何碱基冗余的基因敲除和点突变。基因敲除的寡核苷酸设计与靶基因两侧的碱基序列一致，点突变的寡核苷酸则在寡核苷酸中引入需要突变的碱基。此发明方法用来实现LacZ基因的敲除、LacZ基因的点突变和rhaSR基因的敲除。
本发明优选的起始大肠杆菌为基因组序列已知的、几乎未经修饰的菌株大肠杆菌MG1655；优选的重组酶基因表达载体是pSC101-BAD-gbaA。本发明的重组工程是指，exo、bet、gam和recA基因受araC基因所调节的pBAD启动子所驱动，araC基因由L-阿拉伯糖所激活。exo、bet、gam和recA基因在诱导表达后，催化DNA同源片段之间的同源重组。
本发明的重组工程方法中，neo为卡那霉素抗性基因，作为第一步整合至靶基因时的选择性标记来使用；sacB基因编码蔗糖6-果糖转移酶，其催化蔗糖转化为对大肠杆菌有毒害的果聚糖。sacB在本发明的寡核苷酸介导的同源重组步骤中作为负筛选标记来使用，即sacB基因表达的菌株不能生存。sacB-neo基因盒克隆在R6K复制子的质粒中，宿主菌为含有pir基因的大肠杆菌BW25141，含R6K复制子的质粒在大肠杆菌MG1655中不能复制，这就去除了质粒做PCR模板时的背景干扰。基因敲除中sacB-neo基因盒的同源臂的设计原则是：插入位点两侧各50个碱基，插入位点保留靶基因的读码框。点突变中的sacB-neo基因盒的同源臂的设计原则是：插入位点两侧各50个碱基，紧邻插入位点前面的第一个碱基为待突变位点。
本发明中的去除sacB-neo基因盒的寡核苷酸的设计原则如下：用于基因敲除的寡核苷酸为84个碱基，前42个碱基和后42个碱基分别与整合至大肠杆菌基因组上的sacB-neo基因盒前面的42个碱基和后面的42个碱基相同；用于点突变寡核苷酸为85个碱基，前42个碱基分别为整合至大肠杆菌基因组上的sacB-neo基因盒前面的第2-43个碱基相同，第43个碱基为突变碱基即与紧邻sacB-neo基因盒第一个的碱基不同，点突变的后42个碱基与整合至大肠杆菌基因组上的sacB-neo基因盒后面的42个碱基相同。
寡核苷酸由两部分的同源臂所组成(点突变中的寡核苷酸是在两部分的同源臂之间加入目的突变的碱基)。同源臂的碱基长度可以不限于上述sacB-neo基因盒设计中的50个碱基以及寡核苷酸介导的基因敲除和点突变中的42个碱基，实际上更长的寡核苷酸也是可以的，而且效率会更好，但伴随的是成本的增加和发生突变的几率增加(寡核苷酸越长则其中的碱基越容易突变)。较短的寡核苷酸原则上也可能，但效率会有所下降。鉴于此，就不可能对碱基的数目进行限定，寡核苷酸的长短可以涵盖从下限36个碱基到上限约150个碱基数目(即为DNA碱基合成的上限)。
本发明中优选的用于基因敲除的基因为LacZ基因和RhaSR基因。LacZ基因是大肠杆菌乳糖操纵子中的β半乳糖苷酶基因，其可被IPTG(异丙基硫代-β-D半乳糖苷)诱导而高表达，此时能分解生色底物X-gal(5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷)产生蓝色，从而使菌落变蓝。当LacZ基因发生突变(插入失活、基因敲除或点终止突变)，则基因不能分解X-gal，此时菌落呈白色。此肉眼可观察到的现象有助于突变株的筛选。实验设计是将LacZ基因中间的2931个碱基敲除，在5′端和3′端各保留72个核苷酸，这样读码框不变。RhaSR基因是鼠李糖代谢调节操纵子。实验设计是将RhaS基因3′端的828个碱基、RhaS基因和RhaT基因之间的73个碱基以及RhaT基因3′端840个碱基敲除，保留RhaS基因5′端和RhaT基因5′端各9个核苷酸，这样读码框不变。LacZ基因和RhaSR基因的基因修饰不影响大肠杆菌的生长和代谢。
本发明中优选的用于点突变的基因为LacZ基因。实验设计是将LacZ基因第70位的C(胞嘧啶)突变为T(胸腺嘧啶)，即LacZ基因第14位的编码谷氨酰胺的密码子CAA突变为编码终止密码子的TAA，造成基因失活。
从实施例中由寡核苷酸介导的大肠杆菌基因敲除和点突变可得出如下结论：PCR产物通过重组工程发生同源重组的效率为可达60％，而寡核苷酸介导的    同源重组的效率可达54％，可以满足大肠杆菌基因突变的要求。
本发明的优点在于：1.无任何碱基的冗余，避免了极性效应；2.由寡核苷酸介导，操作简便易行，重组效率高。本发明可成为大肠杆菌基因组修饰的通用方法。
附图说明
图1是本专利申请实验过程的示意图。
图中各个名词和图形的含义如下：sacB是编码蔗糖6-果糖转移酶基因；neo是卡那霉素抗性基因；HA表示基因重组的同源臂，两侧分别以竖线和填充的黑体显示；靶基因表示待敲除或点突变的基因；下三角表示基因敲除；圆圈表示基因点突变；λ-Red表示重组工程。
图2是LacZ基因敲除实验中sacB-neo与LacZ区域发生重组后所获得的菌株的菌落PCR的电泳图。
M1：DL2000分子量标准，2.0，1.0，0.75，0.5，0.25，0.1kb；
1-5：引物ZDE3与ZDE4的菌落PCR产物，大小为500bp；
6-10：引物ZDE5与ZDE6的菌落PCR产物，大小为500bp。
1、6泳道；2、7泳道；3、8泳道；4、9泳道以及5、10泳道菌落PCR产物分别对应五个菌。
图3是LacZ基因敲除实验中寡核苷酸与sacB-neo区域发生重组后所获得的菌株的菌落PCR的电泳图。
M1：DL2000分子量标准：2.0，1.0，0.75，0.5，0.25，0.1kb；
1-10：引物ZDE3与ZDE6的菌落PCR产物，大小为549bp。
由图可见：2、4、5、7、8、9、10泳道有正确的PCR产物。
图4是LacZ基因点突变实验中sacB-neo与LacZ区域发生重组后所获得的菌株的菌落PCR的电泳图。
M1：DL2000分子量标准，2.0，1.0，0.75，0.5，0.25，0.1kb；
1-5：引物ZDE3与ZDE4的菌落PCR产物，大小为500bp；
6-10：引物ZDE5与ZPM4的菌落PCR产物，大小为438bp。
1、6泳道；2、7泳道；3、8泳道；4、9泳道以及5、10泳道菌落PCR产物分别对应五个菌。
图5是LacZ基因点突变实验中寡核苷酸与sacB-neo区域发生重组后所获得的菌株的菌落PCR的电泳图。
M1：DL2000分子量标准，2.0，1.0，0.75，0.5，0.25，0.1kb；
1-10：引物ZDE3与ZPM4的菌落PCR产物，大小为486bp。
由图可见：2、5、7、8、10泳道有正确的PCR产物。
图6是Rha基因敲除实验中sacB-neo与Rha区域发生重组后所获得的菌株的菌落PCR的电泳图。
M1：DL2000分子量标准：2.0，1.0，0.75，0.5，0.25，0.1kb；
1-5：引物RSD3与ZDE4的菌落PCR产物，大小为500bp；
6-10：引物ZDE5与RSD4的菌落PCR产物，大小为500bp。
1、2泳道；3、4泳道；5、6泳道；7、8泳道以及9、10泳道菌落PCR产物分别对应五个菌。由图可见：1、2泳道；5、6泳道和7、8泳道有正确的PCR产物。
图7是Rha基因敲除实验中寡核苷酸与sacB-neo区域发生重组后所获得的菌株的菌落PCR的电泳图。
M1：DL2000分子量标准，2.0，1.0，0.75，0.5，0.25，0.1kb；
1-10：引物RSD3与RSD4的菌落PCR产物，大小为550bp。
由图可见：2、3、4、6、8、9、10泳道有正确的PCR产物。
具体实施方式
在本发明中所使用的术语，除非有另外说明，一般具有本领域普通技术人员通常理解的含义。
下面结合具体的实施例，并参照数据进一步详细地描述本发明。应理解，这些实施例只是为了举例说明本发明，而非以任何方式限制本发明的范围。
在以下的实施例中，未详细描述的各种过程和方法是本领域中公知的常规方法。所用试剂的来源、商品名以及有必要列出其组成成分者，均在首次出现时标明，其后所用相同试剂如无特殊说明，均以首次标明的内容相同。
实施例中所用到的菌株和质粒，均为已公开的菌株和质粒：
1.大肠杆菌MG155。原始大肠杆菌基因组测序菌株，基因型F^-，LAM^-，rph^-。文献：Blattner FR，Plunkett G，3rd，Bloch CA et al.The complete genome sequence of Escherichia coliK-12.Science 1997；277(5331)：1453-62.
2.大肠杆菌DH10B。基因型F-mcrAΔ(mrr-hsdRMS-mcrBC)φ80dlacZΔM15 ΔlacX74 deoR recA 1araD139Δ(ara，leu)7697 galU galK rpsL endA1 nupG.。文献：Life Technologies，Inc.Focus(1990)12，19。购自美国Invitrogen公司。
3.大肠杆菌BW25141。文献：Datsenko，K.A.and Wanner，B.L.(2000)One-stepinactivation of chromosomal genes in Escherichia coli K-12 using PCR products.Proc Natl AcadSci U S A，97，6640-6645。来自美国Purdue大学Barry Wanner的教授。
4.pEXT100Tlink。文献：Quenee，L.，Lamotte，D.，and Polack，B.(2005)CombinedsacB-based negaive selection and cre-lox antibiotic marker recycling for efficient gene deletionin pseudomonas aeruginosa.Biotechniques 38：63-67.来自法国Centre Hospitalier Universitairede Grenoble，Benoit Polack教授。
5.pBluescript KS(-)。文献：Alting-Mees，M.A.and Short，J.M.(1989)pBluescript II：genemapping vectors.Nucleic Acids Res，17，9494。购自美国Novagen公司。
6.pKD4。文献和来源同3。
7.pSC101-BAD-gbaA。文献：Wang，J.，Sarov，M.，Rientjes，J.，Fu，J.，Hollak，H.，Kranz，H.，Xie，W.，Stewart，A.F.and Zhang，Y.(2006)An improved recombineering approach by addingRecA to lambda Red recombination.Mol Biotechnol，32，43-53。来自德国Dresden大学的Youming Zhang博士
8.pGEM-T easy。购自美国Promega公司。
实施例
实施例1.含sacB-neo基因盒的质粒pSNR的构建
1.大肠杆菌MG1655，DH10B和大肠杆菌BW25141电转化感受态细胞的制备和DNA转化
自平板上接种新鲜划线培养的单菌落至2ml LB液体培养基中37℃振荡过夜，以1/50体积转至50ml LB，振荡培养至菌体OD₆₀₀约为0.6。将菌液倒入预冷的离心管，冰浴10分钟，4℃，5000rpm离心5分钟，弃上清。以10％的甘油洗涤沉淀两次，最后悬浮于200μl的10％甘油中，每管50μl分装。
制备含质粒的大肠杆菌感受态细胞则在菌株的培养时则在LB液体培养基中加入相应的抗生素。
将DNA加至50μl冰上融化的电转化感受态细胞中，轻弹混匀。将混合液转移至冰上预冷的1mm电转杯中，电击转化。电转化条件：1mm电转杯，200Ω，1800V，Bio-Rad公司Gene Pulser II电转化仪。加1ml LB液体培养基至电转杯，吹打混匀，将溶液转移至一个无菌的1.5ml eppendorf管中，37℃振荡培养60分钟后，转化液涂布抗性平板上，37℃培养。
温度敏感性质粒如pSC101-BAD-gabA的转化以及含此质粒的菌株的培养则在30℃进行。
2.PCR(聚合酶链式反应)、产物检测和产物溶解
PCR扩增的体系为：50μl反应体系。
37.7μl dd H₂O；
5μl 10×PCR反应缓冲液；
4μl 25mM MgCl₂；
1μl 10mM dNTP；
0.5μl上游引物(终浓度0.5mM)；
0.5μl下游引物(终浓度0.5mM)；
1μl模板(质粒50ng，基因组DNA 200ng)；
0.3μl Ex-Taq聚合酶(5U/μl)。
PCR反应：首先在97℃变性处理5分钟，循环的条件为：97℃45秒，60℃1分钟，72℃1-2分钟(视目的产物大小而定)，共30个循环。最后在72℃延伸10分钟。使用仪器为Bio-rad公司的PTC-200型号的PCR仪。
反应结束后，以加入20μg/ml的溴化乙锭的1％的琼脂糖凝胶电泳检测。PCR产物沉淀回收：加1/10体积3M pH 5.2醋酸钠及2倍体积冰乙醇，混匀，-80℃冷冻5min，13200rpm离心10分钟，弃上清，加500μl 70％乙醇洗涤，13200rpm离心5分钟，弃上清，室温至干，加适量体积的无菌水溶解，调整DNA浓度为200ng/μl。
3.pSNR的构建
本发明含sacB-neo基因盒的质粒pSNR的构建过程如下：
设计引物：SA1：5′-GGGTCTAGAATCCTTTTATGATTTTCTATC-3′(SEQ ID NO.1)；SA2：5′-GGGGGATCCTTATTTGTTAACTGTTAATTG-3′(SEQ ID NO.2)。以pEXT100Tlink为模板，扩增出1.7kb的sacB基因，将PCR产物以XbaI和BamHI酶切后，克隆至pBluescript KS(-)的相同位点，筛选得到重组克隆，命名为pKsacB，经酶切和测序验证正确。将pKsacB以XbaI和BamHI酶切，回收1.7kb的sacB基因；将pKD4以XbaI和BglII酶切，回收1.0kb和1.8kb两个片段。将1.7kb、1.0kb和1.8kb三个片段以T4连接酶进行连接，转化大肠杆菌BW25141的电转化感受态细胞，以30μg/ml的卡那霉素进行筛选，所得克隆命名为pSNR，酶切验证正确。
实施例2.LacZ基因敲除
1.带同源臂的sacB-neo基因盒的扩增
设计引物ZDE1：5′-TGGCCGTCGTTTTACAACGTCG TGACTGGGAAAACCCTGGCGTTACCCAAATCCTTTTATGATTTTCTATC-3′(SEQ ID NO.3)，引物前面50个碱基是LacZ基因开放阅读框的23-72位的同源臂(下划线表示)，后面的碱基是pSNR质粒上sacB基因前端部分；ZDE2：5′-TGGTAATGGTAGCGACCGGCGCTCAGCTGGAATTCCGCCGATACTGACGGTCAGAAGAACTCGTCAAGAAG-3′(SEQ ID NO.4)，引物前面50个碱基是LacZ基因开放阅读框的反方向23-72位的同源臂(下划线表示)，后面的碱基是pSNR质粒上neo基因后端部分。PCR扩增得到2.7kb的产物，PCR扩增的体系、反应条件及回收方法同上。
2.带有同源臂的sacB-neoPCR产物通过重组工程与目的基因发生交换
首先将pSC101-BAD-gabA转化至大肠杆菌MG1655，于30℃，在含四环素10μg/ml的LB抗性平板上筛选得到菌株MG1655/pSC101-BAD-gabA。随后制备MG1655/pSC101-BAD-gabA的电转化感受态细胞：当30℃扩大培养的菌液的OD₆₀₀为0.2时，加入终浓度为0.15％的L-阿拉伯糖，37℃振荡培养约1小时，至OD₆₀₀约为0.3～0.4。菌体4℃，5000rpm离心5分钟，弃上清。以10％的甘油洗涤沉淀两次，最后悬浮于100μl的10％甘油中，每管50μl分装。
将300ng的2.7kb PCR产物转化MG1655/pSC101-BAD-gbaA的电转化感受态细胞，转化液涂布于含30μg/ml的卡那霉素及10μg/ml四环素的抗性平板上，30℃培养24小时，平板上长出155个菌落。
蔗糖敏感性验证：随机挑取50个菌落至含7.5％蔗糖而不加氯化钠的LB平板上，以MG1655作为对照；将此50个菌落同时划线至含30μg/ml的卡那霉素和10μg/ml四环素的平板上。37℃培养16小时后，大肠杆菌MG1655在7.5％蔗糖平板上不长，挑取的50个菌落有15个在7.5％蔗糖平板上不生长，而在卡那霉素的和四环素的平板上全部生长。这15个菌落为表型正确的克隆，即含同源臂的sacB-neo基因盒与大肠杆菌基因组上的LacZ基因发生同源重组后，表现卡那霉素的抗性和sacB的负筛选功能即含sacB的菌株不能在含蔗糖的平板上生长(蔗糖敏感性)。此时的重组效率为30％。
菌落PCR验证：从四环素和卡那霉素抗性的平板上随机挑取5个对应的表型正确的克隆分别以ZDE3和ZDE4为引物以及ZDE5和ZDE6为引物做菌落PCR分析。5个菌都得到了条带大小正确的PCR产物，将这些PCR产物克隆到pGEM-T easy，测序。序列全部正确，效率为100％。
计算PCR产物同源重组的效率为30％×100％＝30％。
PCR产物同源重组的效率计算公式：acB-neo基因盒重组后中表现蔗糖敏感的菌落占总菌落数的百分比×蔗糖敏感菌落中发生正确重组的百分比
菌落PCR引物设计如下。
ZDE3：5′-AACCGCCTCTCCCCGCGCGTTG-3′，(SEQ ID NO.5)
ZDE4：5′-GCCCTCCTGTTTGAAGATGGC-3，(SEQ ID NO.6)
ZDE5：5′-TGCTTGCCGAATATCATGGTG-3′，(SEQ ID NO.7)
ZDE6：5′-TAGCGGCAAAAATAATACCCG-3′，(SEQ ID NO.8)
ZDE3是lacZ基因读码框上游第188-200位的序列；
ZDE4是sacB基因读码框上游第50-71位的序列的反向互补序列；
ZDE5是neo基因读码框内第574-594位序列；
ZDE6是lacZ基因读码框下游第185-205位的序列的反向互补序列。
PCR及电泳分析方法同上。
3.寡核苷酸通过重组工程与sacB-neo区域发生交换
设计寡核苷酸ZDE7：5′-GTTTTACAACGTCGTGACTGGGAAAACCCTGGCGTTACCCAACCGTCAGTATCGGCGGAATTCCAGCTGAGCGCCGGTCGCTAC-3′(SEOID NO.9)，前42个碱基与ZDE1的第9-50个碱基相同，后42个碱基与ZDE2的第9-50个碱基反向互补。
如步骤2中方法制备电转感受态细胞，将50pmol的寡核苷酸转入新鲜制备的上述感受态中，电击转化，最后在30℃振荡培养70分钟，转化液稀释1000倍，涂布于含7.5％蔗糖平板上，30℃培养16小时，平板上长出269个菌落。
卡那霉素敏感性验证：随机挑取100个菌落分别到含30μg/ml的卡那霉素平板，37℃培养16小时。77个菌落对卡那霉素敏感，即效率为77％。
菌落PCR验证：随机挑取10个对应的表型正确的克隆以ZDE3和ZDE6为引物，做菌落PCR分析，得到了7个条带大小正确的PCR产物，PCR产物克隆到pGEM-T easy，测序。序列全部正确，即效率为100％。测序正确的PCR产物所对应的菌株即为基因敲除的菌株。
计算寡核苷酸介导的的同源重组的效率为77％×70％＝54％。
寡核苷酸的同源重组效率的计算公式：寡核苷酸的同源重组效率＝卡那霉素敏感的菌落占总菌落数的百分比×卡那霉素敏感的菌落中发生正确重组的百分比。
实施例3.LacZ基因点突变
1.带同源臂的sacB-neo基因盒的扩增
设计引物ZPM1：5′-ACTGGCCGTCGTTTTACAACGTCGTGACTGGGAA AACCCTGGCGTTACCCATCCTTTTATGATTTTCTATC-3′(SEQ ID NO.10)，引物前面50个碱基是LacZ基因开放阅读框的20-70位的同源臂(下划线表示，后面的22个碱基是pSNR质粒上sacB基因前端部分；ZPM2：5′-GCTATTACGCCAGCTGGCGAAAGGGGGATGTGCTGCAAGGCGATTAAGTTTCAGAAGAACTCGTCAAGAAG-3′，(SEQ ID NO.11)，引物前面50个碱基是LacZ基因开放阅读框的反方向20-70位的同源臂(下划线表示)，后面的碱基是pSNR质粒上neo基因后端部分。
PCR扩增得到2.7kb的产物，PCR扩增的体系、反应条件及回收方法同上。
2.带有同源臂的sacB-neoPCR产物通过重组工程与目的基因发生交换
将300ng的2.7kb PCR产物片段，转化大肠杆菌MG1655/pSC101-BAD-gbaA电转化感受态细胞，转化液涂布于含30μg/ml的卡那霉素及10μg/ml四环素的抗性平板上，30℃培养24小时，长出130个菌落。
如实施例2的蔗糖敏感性验证发现，随机挑取的50个卡那霉素和四环素抗性菌落有10个在7.5％蔗糖平板上不生长，表明此时的重组效率为20％。
菌落PCR验证：从四环素和卡那霉素抗性的平板上随机挑取5个对应的表型正确的克隆以分别ZDE3和ZDE4为引物以及ZDE5和ZPM4为引物做菌落PCR分析。5个菌都得到了条带大小正确的PCR产物将这些PCR产物克隆到pGEM-T easy，测序。序列全部正确，效率为100％。
计算PCR产物同源重组的效率为20％×100％＝20％。
菌落PCR引物设计如下。
ZDE3：5′-AACCGCCTCTCCCCGCGCGTTG-3′，(SEQ ID NO.5)
ZDE4：5′-GCCCTCCTGTTTGAAGATGGC-3，(SEQ ID NO.6)
ZDE5：5′-TGCTTGCCGAATATCATGGTG-3′，(SEQ ID NO.7)
ZPM4：5′-AACCGTGCATCTGCCAGTTTG-3′，(SEQ ID NO.12)
ZDE3是LacZ基因读码框上游第188-200位的序列；
ZDE4是sacB基因读码框上游第50-71位的序列的反向互补序列；
ZDE5是neo基因读码框内第574-594位序列；
ZPM4是LacZ基因读码框内第266-286的序列的反向互补序列。
PCR及电泳分析方法同上。
3.寡核苷酸通过重组工程与sacB-neo区域发生交换
设计寡核苷酸ZPM5：5′-GTCGTTTTACAACGTCGTGACTGGGAAAACCCTGGCGTTACCTAACTTAATCGCCTTGCAGCACATCCCCCTTTCGCCAGCTGGC-3′(SEQID NO.13)，前42个碱基与ZPM1的第8-49个碱基相同，后42个碱基与ZPM2的第9-50个碱基反向互补，中间一个碱基将原来的C设计为T。
如实施例2制备电转化感受态细胞的和寡核苷酸转化，得到136个菌落。随机挑取100个菌落发现16个菌落对卡那霉素敏感，即效率为16％。
菌落PCR验证：随机挑取10个的表型正确的克隆以ZDE3和ZPM4为引物做菌落PCR分析，得到了5个条带大小正确的PCR产物，PCR产物克隆到pGEM-T easy，测序。测序全部正确，即效率为100％。测序正确的PCR产物所对应的菌株即为基因敲除或点突变的菌株。
计算寡核苷酸的介导的同源重组的效率为16％×100％＝16％。
实施例4.RhaSR基因的基因敲除
1.带同源臂的sacB-neo基因盒的扩增
设计引物：RSD1：5′-TGATTACTATTTCGCCGTGTTGACGACATCAGGAGGCCAGTATGACCGTAATCCTTTTATGATTTTCTATC-3′(SEQ ID NO.14)，引物前面50个碱基是rha基因的同源臂(下划线表示)，后面的碱基是pSNR质粒上sacB基因前端部分。
RSD2：5′-ATTATTGTCGCCGCTAACATCGTCGGCATCGGCATGGCGAATTAATCTTTTCAGAAGAACTCGTCAAGAAGG-3′，(SEQ ID NO.15)。引物前面50个碱基是rha基因的同源臂(下划线表示)，后面的碱基是pSNR质粒上neo基因后端部分。
PCR扩增得到2.7kb的产物。PCR扩增的体系、反应条件及回收方法如上所述。
2.带有同源臂的sacB-neoPCR产物通过重组工程与目的基因发生交换
将300ng的2.7kb PCR产物片段，转化大肠杆菌MG1655/pSC101-BAD-gbaA电转化感受态细胞，转化液涂布于含30μg/ml的卡那霉素及10μg/ml四环素的抗性平板上，30℃培养24小时，长出130个菌落。
如实施例2的蔗糖敏感性验证发现，随机挑取的10个卡那霉素和四环素抗性菌落均在7.5％蔗糖平板上不生长，表明此时的重组效率为100％。
菌落PCR验证：从四环素和卡那霉素抗性的平板上随机挑取5个对应的表型正确的克隆分别以RSD3和ZDE4为引物以及ZDE5和RSD4为引物做菌落PCR分析。其中3个菌得到了条带大小正确的PCR产物，将这些PCR产物克隆到pGEM-T easy，测序。测序全部正确，效率为60％。
计算PCR产物同源重组的效率为100％×60％＝60％。
菌落PCR引物设计如下。
RSD3：5′-CATTACGACCAGTCTAAAAAG-3′，(SEQ ID NO.16)
ZDE4：5′-GCCCTCCTGTTTGAAGATGGC-3，(SEQ ID NO.6)
ZDE5：5′-TGCTTGCCGAATATCATGGTG-3′，(SEQ ID NO.7)
RSD4：5′-GATCATTCACAATGTGTTACTC-3′，(SEQ ID NO.17)
RSD3是rhaS基因读码框上游第256-267位的序列；
ZDE4是sacB基因读码框上游第50-71位的序列的反向互补序列；
ZDE5是neo基因读码框内第574-594位序列；
RSD4是rhaT基因读码框下游第249-270位的序列的反向互补序列。
PCR及电泳分析方法同上。
3.寡核苷酸通过重组工程与sacB-neo区域发生交换
设计寡核苷酸RSD5：5′-ATTTCGCCGTGTTGACGACATCAGGAGGCCAGTATGACCGTAAAGATTAATTCGCCATGCCGATGCCGACGATGTTAGCGGCG-3′(SEQ IDNO.18)，前42个碱基与为RSD1的第9-50个碱基相同，后42个碱基与RSD2的第9-50个碱基反向互补。
如实施例2制备电转化感受态细胞的和寡核苷酸转化，得到226个菌落。随机挑取100个菌落发现28个菌落对卡那霉素敏感，即效率为28％。
菌落PCR验证：随机挑取10个的表型正确的克隆以RSD3和RSD4为引物做菌落PCR分析，得到了7个条带大小正确的PCR产物，PCR产物克隆到pGEM-T easy，测序。序列全部正确，即效率为70％。测序正确的PCR产物所对应的菌株即为基因敲除或点突变的菌株。
计算寡核苷酸的介导的同源重组的效率为28％×70％＝4.8％。
SEQUENCE LISTING
<110>南京师范大学
<120>一种寡核苷酸介导的大肠杆菌基因敲除或点突变的方法
<130>
<160>18
<170>PatentIn version 3.3
<210>1
<211>30
<212>DNA
<213>人工序列
<400>1
gggtctagaa tccttttatg attttctatc                                      30
<210>2
<211>30
<212>DNA
<213>人工序列
<400>2
gggggatcct tatttgttaa ctgttaattg                                      30
<210>3
<211>71
<212>DNA
<213>人工序列
<400>3
tggccgtcgt tttacaacgt cgtgactggg aaaaccctgg cgttacccaa atccttttat    60
gattttctat c                                                         71
<210>4
<211>71
<212>DNA
<213>人工序列
<400>4
tggtaatggt agcgaccggc gctcagctgg aattccgccg atactgacgg tcagaagaac    60
tcgtcaagaa g                                                         71
<210>5
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<400>5
aaccgcctct ccccgcgcgt tg                                             22
<210>6
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<400>6
gccctcctgt ttgaagatgg c                                              21
<210>7
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<400>7
tgcttgccga atatcatggt g                                              21
<210>8
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<400>8
tagcggcaaa aataataccc g                                            21
<210>9
<211>84
<212>DNA
<213>人工序列
<400>9
gttttacaac gtcgtgactg ggaaaaccct ggcgttaccc aaccgtcagt atcggcggaa  60
ttccagctga gcgccggtcg ctac                                         84
<210>10
<211>71
<212>DNA
<213>人工序列
<400>10
actggccgtc gttttacaac gtcgtgactg ggaaaaccct ggcgttaccc atccttttat  60
gattttctat c                                                       71
<210>11
<211>71
<212>DNA
<213>人工序列
<400>11
gctattacgc cagctggcga aagggggatg tgctgcaagg cgattaagtt tcagaagaac  60
tcgtcaagaa g                                                       71
<210>12
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<400>12
aaccgcctct ccccgcgcgt tg                                             22
<210>13
<211>85
<212>DNA
<213>人工序列
<400>13
gtcgttttac aacgtcgtga ctgggaaaac cctggcgtta cctaacttaa tcgccttgca    60
gcacatcccc ctttcgccag ctggc                                          85
<210>14
<211>71
<212>DNA
<213>人工序列
<400>14
tgattactat ttcgccgtgt tgacgacatc aggaggccag tatgaccgta atccttttat    60
gattttctat c                                                         71
<210>15
<211>72
<212>DNA
<213>人工序列
<400>15
attattgtcg ccgctaacat cgtcggcatc ggcatggcga attaatcttt tcagaagaac    60
tcgtcaagaa gg                                                        72
<210>16
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<400>16
cattacgacc agtctaaaaa g                                              21
<210>17
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<400>17
gatcattcac aatgtgttac tc                                             22
<210>18
<211>84
<212>DNA
<213>人工序列
<400>18
atttcgccgt gttgacgaca tcaggaggcc agtatgaccg taaaagatta attcgccatg    60
ccgatgccga cgatgttagc ggcg                                           84