技术领域
本发明涉及细胞免疫治疗技术领域，具体而言，涉及一种嵌合抗原受体NK细胞及其制备方法和应用。
背景技术
2017年7月，FDA肿瘤药物专家咨询委员会全票通过并批准诺华CAR-T疗法CTL-019上市，这无疑是人类在抗争肿瘤疾病路途中极具里程碑意义的事件，同时再一次将CAR-T推到“风口浪尖”。CTL019作为第一个被批准上市的嵌合抗原受体T细胞(CAR-T)产品，标志着肿瘤免疫疗法新时代的到来。
CAR-T给广大的肿瘤患者带来希望的同时也带来许多治疗风险。目前CAR-T治疗中的脱靶效应、细胞因子风暴、T细胞分离纯化困难以及感染效率低下、移植物抗宿主反应、制备周期长等问题还等待着我们去解决。
但目前，仅经CAR单一修饰的效应细胞其杀伤肿瘤细胞的效果仍然有待进一步提高。
鉴于此，特提出本发明。
发明内容
本发明的目的在于提供一种嵌合抗原受体NK细胞，该嵌合抗原受体NK细胞可同时表达IL-15和靶向CD19的嵌合抗原受体，对肿瘤细胞具有较好的杀伤效果，可用于制备抗肿瘤药物。
本发明的另一目的在于提供一种制备方法，采用该方法可以制备得到表达IL-15和靶向CD19的嵌合抗原受体的嵌合抗原受体NK细胞，用于治疗肿瘤。
本发明的目的在于提供上述嵌合抗原受体NK细胞的应用。
本发明是这样实现的：
一方面，本发明提供了一种嵌合抗原受体NK细胞，所述细胞表达IL-15和靶向CD19的嵌合抗原受体，其中，所述嵌合抗原受体具有靶向CD19的抗原结合结构域。
IL-15是一类重要的促炎症因子，在机体固有免疫中发挥着重要的调控作用。IL-15具有多种生物学功能，是机体重要的促炎症因子,主要表现为:1、对T细胞的作用：IL-15能够维持T细胞CTLL-2的生长、诱导细胞毒性T细胞活性、增强T细胞早期活化及增殖等；2、对B细胞的作用：IL-15对正常B细胞分化有一定作用、其与CD40L联合作用还可使B细胞分泌IgG；3、对NK细胞的作用IL-15可通过IL-2受体活化NK细胞，引起NK细胞扩增、抗体依赖细胞介导的细胞毒作用作用和产生细胞因子。
CD19表达于B系细胞(不包括成熟浆细胞)及滤泡树突状细胞上，CD19是一种重要的信号传导分子，调节B淋巴细胞的生长激活和活化，在调节B淋巴细胞抗原受体或其他表面受体的信号阈值中起重要作用，是与B淋巴细胞分化、活化、增殖及抗体产生有关的重要膜抗原，是诊断B淋巴细胞系肿瘤和鉴定B淋巴细胞的最好标志。
CD19是恶性B淋巴细胞特异性表面蛋白,在B细胞的发育、增殖和分化以及恶性转化中发挥重要作用。因CD19在B淋巴细胞表达的特异性和恶性肿瘤表达的广泛性,使其成为一个颇具潜力的B淋巴细胞恶性肿瘤免疫治疗的分子靶点。
本发明首次在表达靶向CD19的嵌合抗原受体的嵌合抗原受体NK细胞上，通过对嵌合抗原受体NK细胞进一步修饰，使其共表达出IL-15，进而增强其对肿瘤细胞的杀伤效果，提高其抗肿瘤活性，该嵌合抗原受体NK细胞可用于制备相关的抗肿瘤药物，或用于治疗肿瘤。该嵌合抗原受体NK细胞具有功能更强大、来源更方便、使用更安全、成本更低廉的特点。
进一步地，在本发明的一些实施方案中，所述嵌合抗原受体还具有如下元件：
CD8α跨膜结构域、4-1BB共刺激信号传导区和CD3ζ信号传导结构域；
所述靶向CD19的抗原结合结构域、所述CD8α跨膜结构域、所述4-1BB共刺激信号传导区和所述CD3ζ信号传导结构域依次连接。
当然，需要说明的是，针对本发明提供的嵌合抗原受体NK细胞所表达的靶向CD19的嵌合抗原受体，其跨膜结构域还可以是DAP10或PD1，共刺激信号传导区还可以是CD28、CD137或CD134。
进一步地，在本发明的一些实施方案中，所述靶向CD19的抗原结合结构域为靶向CD19的单链抗体scFv。
进一步地，在本发明的一些实施方案中，所述靶向CD19的单链抗体scFv的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
进一步地，在本发明的一些实施方案中，所述IL-15的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
进一步地，在本发明的一些实施方案中，所述CD8α跨膜结构域的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示；
优选的，所述4-1BB共刺激信号传导区的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示；
优选的，所述CD3ζ信号传导结构域的氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示。
另一方面，本发明提供了上述的嵌合抗原受体NK细胞的制备方法，其包括：将表达靶向CD19的嵌合抗原受体和IL-15的表达盒转入宿主细胞；所述宿主细胞为NK细胞。
其中，所述嵌合抗原受体具有靶向CD19的抗原结合结构域。
当然，需要说明的是，在其他的一些实施例中，宿主细胞也可以是T细胞、巨噬细胞、B细胞、NKT细胞、CIK细胞或DC-CIK细胞。
进一步地，在本发明的一些实施方案中，所述表达盒中，表达靶向CD19的嵌合抗原受体的核苷酸序列与表达IL-15的核苷酸序列之间通过IRES序列连接。
再一方面，本发明提供了上述的嵌合抗原受体NK细胞在制备用于治疗肿瘤的药物中的应用。
进一步地，在本发明的一些实施方案中，所述肿瘤为B细胞淋巴瘤。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。
图1为共表达IL-15和靶向CD19胞外段的嵌合抗原受体的各表达原件的结构示意图。
图2为流式细胞仪检测阳性细胞百分比的结果。
图3为不同效靶比的阳性CD19-CAR-IL15-NK92细胞对B细胞淋巴瘤Raji细胞的杀伤效果。
图4为CD19-CAR-IL15-NK92细胞的颗粒酶B的检测结果。
图5为pCDH载体的结构示意图。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
以下结合实施例对本发明的特征和性能作进一步的详细描述。
实施例
制备共表达IL-15的靶向CD19胞外段的嵌合抗原受体NK细胞
1慢病毒包装质粒的构建
具有靶向CD19胞外段的单链抗体scFv氨基序列如SEQ ID NO.1所示。
将靶向CD19胞外段的嵌合抗原受体的核苷酸序列通过IRES与IL-15的核苷酸序列相连，得到共表达核酸序列SEQ ID NO.7，将SEQ ID NO.7克隆至pCDH载体(结构见图5)，酶切位点是SalI和XbaI上。各表达元件的结构位置关系如图1所示。
靶向CD19胞外段的嵌合抗原受体的核苷酸序列依次包括：单链抗体scFv、CD8α跨膜结构域、4-1BB共刺激信号传导区和CD3ζ信号传导结构域。
其中，IL-15为人的IL-15，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，相应的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示。
采用用PCR方法从cDNA中扩增出IL-15基因；用Xbal单酶切实验室质粒PCDH-CD19-CAR2；接着用一步克隆法连接IL-15和载体，得到质粒PCDH-CD19-CAR2-IRES-IL15。得到的包装质粒命名为PCDH-CD19-CAR2-IRES-IL15。
按相同的方法构建不含过IRES和IL-15核苷酸序列，仅含靶向CD19胞外段的嵌合抗原受体的核苷酸序列的包装质粒，命名为PCDH-CD19-CAR。
2.慢病毒包装
方法如下：
2.1质粒转染
2.1.1转染前24h内传代293T细胞，根据细胞生长密度和状态调整细胞密度，转染时细胞需完全贴壁且贴壁均匀，生长密度达60～90％，并确保细胞状态良好，培养时间不超过24h；
2.1.2根据转染细胞数量，按如下比例配置三质粒
辅助质粒PS:辅助质粒PM：PCDH-CD19-CAR(或者是PCDH-CD19-CAR2-IRES-IL15)＝8μg：4μg：12μg混合液，短暂涡旋5次，室温静置5min；
2.1.3根据转染细胞数量，按64μL/mL/皿配制转染试剂聚乙烯亚胺(PEI)稀释液，短暂涡旋5次，室温静置5min；
2.1.4使用1.5mL EP管混合质粒混合液和PEI稀释液:先向管中加入500μL质粒混合液，再沿管壁缓慢加入500μL PEI稀释液，立即涡旋震荡使溶液充分混合，短暂涡旋2s，连续涡旋10次；
2.1.5室温静置聚合20min；
2.1.6一边前后轻轻摇晃培养皿，一边将混合液滴加至细胞培养上清，滴加时，需近液面、轻柔缓慢滴加，防止滴加速度过快或用力过大导致细胞漂浮；
2.1.7轻晃培养皿使转染液与培养上清混合均匀，37℃ 5％二氧化碳培养箱转染6～10h；
2.1.8弃去全部培养上清，加入10mL1640完全培养基，继续培养至72h；
2.1.9换液后24h，48h，72h，使用倒置相差荧光显微镜，跟踪观察细胞生长状态和转染效率；
2.1.10通常分别收集48h和72h的培养上清，若细胞增殖速度快、培养上清变黄，可及时收取培养上清再更换新鲜培养液继续培养，上清即为目的病毒溶液，可于4℃短时保存数天。
2.2超速离心法浓缩病毒
2.2.1由于浓缩使用的超速离心管不能高温高压灭菌，因此，浓缩前，需将超速离心管在75％乙醇中浸泡72h以上，保证离心管无菌；
2.2.2取出浸泡72h以上的超速离心管，加入5mL DMEM培养液，将离心管润洗一次，弃去润洗液，将离心管在无菌吸水纸上扣干；
2.2.3向离心管中加满病毒溶液，拧紧离心管盖，此时离心管中应没有或仅有极少量气泡；
2.2.4严格配平后，40,000rpm、4℃低温超速离心3h；
2.2.5弃上清，若病毒原液体积较大，不能一次离完，可向同一离心管中再加入相应病毒原液，按上述方法重复离心；若病毒原液体积不足以灌满一支离心管，可加入适量DMEM培养液补满；
2.2.6病毒液全部离心结束后，弃去最后一管废液，根据病毒原液体积差异，向超离管中加入0.5～3mL DEME完全培养液，将病毒浓缩25～100倍，吹打直至管中沉淀完全溶解，200μL/管分装至无菌EP管，于-80℃保存。使用时，注意避免浓缩病毒液反复冻融。
根据上述方法，将PCDH-CD19-CAR、PCDH-CD19-CAR2-IRES-IL15两种质粒包装的慢病毒分别命名为lenti-PCDH-CD19-CAR、lenti-PCDH-CD19-CAR-IRES-IL15。
2.3慢病毒滴度测定
2.3.1取生长状态良好的HEK-293T细胞，消化后计数，按2x105细胞/孔将细胞均匀铺至24孔细胞培养板，培养6～10h至细胞贴壁；
2.3.2向24孔板中细胞培养上清中加入不同浓度的浓缩病毒液，轻轻拍打24孔板边缘，使病毒液与培养液混合均匀，于培养箱中感染48h；
2.3.3感染48h后，消化并收集细胞，流式细胞术检测阳性细胞百分比，并根据
以下公式计算病毒滴度:
结果如下：
lenti-PCDH-CD19-CAR lenti-PCDH-CD19-CAR-IRES-IL15 Titer(滴度) 5.92×106U/ml 4.38×106U/ml
2.4嵌合抗原受体细胞的制备
2.4.1将上一步制备的浓缩病毒液lenti-PCDH-CD19-CAR、lenti-PCDH-CD19-CAR-IRES-IL15分别按MOI＝50感染NK92细胞，同时向感染体系中加入1μg/mL polybrene以提高感染效率。
2.4.2感染24h后离心换液，继续培养48h，阳性感染的细胞即为目的CAR-NK92细胞。
病毒lenti-PCDH-CD19-CAR和lenti-PCDH-CD19-CAR-IRES-IL15感染制得的嵌合抗原受体NK细胞分别命名为CD19-CAR-NK92和CD19-CAR-IL15-NK92。
2.4.3收集细胞，流式细胞仪检测阳性细胞百分比。
结果见图2，两种病毒的感染效率较高，所得两种目的细胞CD19-CAR-NK92、CD19-CAR-IL15-NK92的阳性率分别为80.5％、85.5％。
2.5CD19-CAR-IL15-NK92细胞毒性相对于CD19-CAR-NK92显著提高。
2.5.1用上述阳性CD19-CAR-IL15-NK92细胞和CD19-CAR-NK92杀伤B细胞淋巴瘤Raji细胞。结果发现CD19-CAR-IL15-NK92对于Raji细胞的杀伤效果相对于CD19-CAR-NK92显著提高。当效靶比(E：T)为0.4：1时，CD19-CAR-IL15-NK92杀伤率达到72％，CD19-CAR-NK92杀伤率只有43％，但是NK92细胞对Raji细胞也有25％的杀伤率。当效靶比只有0.8：1时，CD19-CAR-IL15-NK92杀伤率就达到93％(图3)。
2.5.2颗粒酶B检测：将靶细胞与CD19-CAR-IL15-NK92和CD19-CAR-NK92效应细胞按照效靶比E：T＝0.4：1分别共孵育3h后，破膜固定检测胞内颗粒酶B的含量。CD19-CAR-IL15-NK92胞内颗粒酶B是鉴定活化的细胞毒性细胞的免疫标志物，可作为NK/T细胞淋巴瘤的诊断性标志物。图4结果显示CD19-CAR-IL15-NK92的颗粒酶B含量相对于CD19-CAR-NK92显著提高。
综上实验结果可以看出，将表达靶向CD19的嵌合抗原受体和IL15共表达可以明显提高NK细胞对B细胞淋巴瘤细胞的杀伤效果，此外二者的共表达还具有协同作用，其效果优于单一的靶向CD19的嵌合抗原受体的NK细胞或单独使用IL15的效果，且用表达靶向CD19的嵌合抗原受体得NK细胞共表达IL15，可以更持续的表达IL15，作用时间表现的更持久。
以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
SEQUENCE LISTING
<110> 华东师范大学、上海邦耀生物科技有限公司
<120> 一种嵌合抗原受体NK细胞及其制备方法和应用
<160> 7
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 270
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 1
Met Leu Leu Leu Val Thr Ser Leu Leu Leu Cys Glu Leu Pro His Pro
1 5 10 15
Ala Phe Leu Leu Ile Pro Asp Ile Gln Met Thr Gln Thr Thr Ser Ser
20 25 30
Leu Ser Ala Ser Leu Gly Asp Arg Val Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser
35 40 45
Gln Asp Ile Ser Lys Tyr Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gly
50 55 60
Thr Val Lys Leu Leu Ile Tyr His Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Val
65 70 75 80
Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Ser Leu Thr
85 90 95
Ile Ser Asn Leu Glu Gln Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln
100 105 110
Gly Asn Thr Leu Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile
115 120 125
Thr Gly Ser Thr Ser Gly Ser Gly Lys Pro Gly Ser Gly Glu Gly Ser
130 135 140
Thr Lys Gly Glu Val Lys Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Ala
145 150 155 160
Pro Ser Gln Ser Leu Ser Val Thr Cys Thr Val Ser Gly Val Ser Leu
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Pro Asp Tyr Gly Val Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Arg Lys Gly Leu
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Glu Trp Leu Gly Val Ile Trp Gly Ser Glu Thr Thr Tyr Tyr Asn Ser
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Val Phe Leu Lys Met Asn Ser Leu Gln Thr Asp Asp Thr Ala Ile Tyr
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Tyr Cys Ala Lys His Tyr Tyr Tyr Gly Gly Ser Tyr Ala Met Asp Tyr
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catgatacag tagaaaatct gatcatccta gcaaacaaca gtttgtcttc taatgggaat 300
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ttgcagagtt ttgtacatat tgtccaaatg ttcatcaaca cttcttga 408
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<212> DNA
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<400> 7
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gaggaaaaaa atattaaaga atttttgcag agttttgtac atattgtcca aatgttcatc 2460
aacacttctt ga 2472