一种检测凤仙花坏死斑病毒的实时荧光定量RTPCR方法及其引物、探针和试剂盒.pdf

本发明是一种检测凤仙花坏死斑病毒的实时荧光定量RT-PCR方法及其引物、探针和试剂盒，属植物病毒分子生物学检测鉴定技术领域。本发明的上游引物的序列如SEQ ID NO：1所示，下游引物的序列如SEQ ID NO：2所示，目标产物片段长度为182bp，TaqMan探针的序列如SEQ ID NO：3所示。本发明试剂盒和检测方法包括了上述引物和探针。应用本发明，可靠性和重复性好，样品三个重复所得的Ct值差值在0.01至1.7；稳定性良好，在不同寄主上检测的Ct平均值差值在0.25至0.34；能检测出INSV病毒含量6.99拷贝·μl-1，具有微量检测的效果；检测的特异性强，只有INSV有荧光信号。

1.  一种用于对凤仙花坏死斑病毒进行实时荧光定量RT-PCR检测的引物，所述的引物由上游引物和下游引物组成，所述的上游引物的碱基序列如序列表中SEQ ID NO：1所示，所述的下游引物的碱基序列如序列表中SEQ ID NO：2所示，目标产物片段长度为182bp。

2.  一种用于对凤仙花坏死斑病毒进行实时荧光定量RT-PCR检测的TaqMan探针，所述的TaqMan探针的碱基序列如序列表中SEQ ID NO：3所示，在所述的TaqMan探针的5’端标记有报告荧光基团，3’端标记有淬灭荧光基团，所述的TaqMan探针位于权利要求1所述的引物的上游引物和下游引物之间。

3.  根据权利要求2所述的TaqMan探针，其特征是：所述的报告荧光基团为FAM，所述的淬灭荧光基团为TAMRA。

4.  一种对凤仙花坏死斑病毒进行实时荧光定量RT-PCR检测的试剂盒，包括引物和TaqMan探针，所述的引物是权利要求1所述的引物，所述的TaqMan探针是权利要求2或3所述的TaqMan探针。

5.  根据权利要求4所述的试剂盒，包括阳性标准品，它是从阳性克隆菌液并提取质粒，用紫外光分光光度计测定D260nm和280nm的吸光度，并计算提取的质粒含量，将质粒用超纯水以10倍的梯度稀释，最后稀释到以10¹、10²、10³、10⁴、10⁵倍质粒制成的阳性标准品，每次使用量各为2μl/每反应。

6.  根据权利要求5所述的试剂盒，包括凤仙花坏死斑病毒免疫试纸条，M-MLV反转录酶，5x M-MLV Buffer，10Mm dNTP mixture，50μl随机引物六聚体，40U/μlRNA抑制剂，PCR quality water，Illustra RNAspin Mini RNA Isolation Kit试剂盒，百泰克生物公司的PCR产物回收纯化试剂盒，感受态细胞DH5@，SOC培养基和X-Gal，IPTG，Amp的LB蓝白斑培养基，所述的感受态细胞DH5@，SOC培养基和X-Gal，IPTG，Amp的LB蓝白斑培养基是按照TaKaRa公司常用试剂配制中X-Gal，IPTG，Amp的LB蓝白斑培养基的配制方法配置而成，质粒回收纯化试剂盒，TaKaRa公司Premix Ex TaqTM超混液和PMD19 simple-T Vector，灭菌超纯水。

7.  一种检测凤仙花坏死斑病毒的实时荧光定量RT-PCR方法，包括待测病毒RNA的提取及其cDNA的合成，TaqMan荧光定量RT-PCR反应体系，在TaqMan荧光定量RT-PCR反应体系进行TaqMan荧光定量RT-PCR反应，通过标准品的制备及标准曲线的建立，计算得出检测结果，其特征是：在合成和所述的反应中使用的引物是权利要求1所述的引物，在合成和所述的反应中使用的TaqMan探针是权利要求2或3所述的TaqMan探针。

8.  根据权利要求7所述的实时荧光定量RT-PCR方法，其特征是：所述的TaqMan荧光定量RT-PCR反应体系是采用25μl反应体系，其中Premix ExTaqTM(2x)12.5μl，上游引物和下游引物各0.5μl，TaqMan探针0.25μl，dH₂O9.25μl，cDNA 2μl；所有反应试剂都在冰上配制；实时荧光定量PCR反应程序是预变性温度94℃，5min；退火温度58℃，30s；58℃采集荧光信号15s。

9.  根据权利要求1所述的引物和权利要求2所述的TaqMan探针或权利要求1所述的引物和权利要求3所述的TaqMan探针在检测凤仙花坏死斑病毒中的应用。

10.  根据权利要求4所述的试剂盒或权利要求7所述的检测凤仙花坏死斑病毒的实时荧光定量RT-PCR方法在检测凤仙花坏死斑病毒中的应用。

一种检测凤仙花坏死斑病毒的实时荧光定量RT-PCR方法及其引物、探针和试剂盒
技术领域
本发明涉及植物病毒分子生物学检测和鉴定技术领域，具体涉及针对凤仙花坏死斑病毒的TaqMan探针荧光定量RT-PCR检测方法以及所用的引物和探针。
背景技术
凤仙花坏死斑病毒(Impatiens necrotic spot virus，INSV)是危害观赏植物的重要病害之一，也是国外花卉生产中最难解决的问题之一。1998年INSV被欧洲及地中海植物保护组织列入A2类检疫性有害生物。
凤仙花坏死斑病毒(Impatiens necrotic spot virus，INSV)属于布尼亚病毒科(Bunyaviridae)番茄斑萎病毒属(Tospovirus)。该病毒粒子为球形，直径80-120nm，病毒有包膜，其基因组由3个单链RNA分子构成。凤仙花坏死斑病毒最早从有症状的凤仙花上分离鉴定出来，可以侵染50科648种植物，其中观赏植物39个属、蔬菜6个属。INSV引起的症状多样，随寄主和侵染时期不同而变化，主要表现为矮化、环斑、叶片或茎部的褐色至紫色的斑点、茎部变褐(溃疡)、碎色花，病害严重发生时会造成许多观赏植物的矮化，甚至植株死亡，严重影响观赏植物的经济价值。
目前传统生物学测定、现代电镜技术、血清学技术、常规RT-PCR技术等已经广泛用于INSV病毒的诊断。然而传统生物学测定是通过观察鉴别寄主在接种后的症状反应，以及其他生物学指标作为病毒鉴定的标准；现代电镜技术是通过观察植物病毒颗粒形态、大小、结构、内含体组成和亚结构等方面的特征来确定病毒是否存在；常规PCR(聚合酶链反应，Polymerase Chain Reaction简称PCR)能在一个试管内将所要研究的目的基因或某一DNA片段于数小时内扩增至十万乃至百万倍，使肉眼能直接观察和判断。中国专利申请号为200810058612.0的“快速检测文心兰上的凤仙花坏死斑病毒的方法”(其公开号为CN101307366A，公开日为2008年11月19日)建立了凤仙花坏死斑病毒的RT-PCR和巢式PCR技术，其特异性和灵敏度均比常规方法优越，但是其仅能够定性检测凤仙花坏死斑病毒，不能实现对病毒样品的定量检测。
目前生物学中定量检测的方法有转磷光免疫层析技术、实时荧光定量PCR技术等，其中实时荧光定量PCR(Real-time fluorescence quantitative PCR，RTFQPCR)技术在目前定量检测技术中使用最广泛，精确度最高。普通PCR技术可对特定核苷酸片断进行指数级的扩增。在扩增反应结束之后，可以通过凝胶电泳的方法对扩增产物进行定性的分析，也可以通过放射性核素掺入标记后的光密度扫描来进行定量的分析。无论定性还是定量分析，分析的都是PCR终产物。但是在许多情况下，人们所感兴趣的是未经PCR信号放大之前的起始模板量，例如，如果想知道某一转基因动植物转基因的拷贝数或者某一特定基因在特定组织中的表达量，在这种需求下本发明构建了实时荧光定量RT-PCR(RT-PCR即反转录聚合酶链反应，reverse transcription Polymerase Chain Reaction简称RT-PCR))，构建出适宜检测凤仙花坏死斑病毒的专用引物、探针和检测优化条件等，它是在常规PCR基础上把荧光共振能量转移与荧光标记探针结合，巧妙地把核酸扩增、杂交、光谱分析和实时检测技术融合在一起的一项创造性技术，迄今为止，没有发现公开发表的与本发明相类似检测凤仙花坏死斑病毒的发明专利。
发明内容
本发明要解决的技术问题是克服现有技术在对凤仙花坏死斑病毒定量检测方面的缺陷，其目的是提供一种基于TaqMan探针的检测凤仙花坏死斑病毒的实时荧光定量RT-PCR方法，同时，本发明还提供用于对凤仙花坏死斑病毒进行实时荧光定量RT-PCR检测的引物，以及对凤仙花坏死斑病毒进行实时荧光定量RT-PCR检测的TaqMan探针及其试剂盒与应用。
为解决上述技术问题，本发明有下列技术方案：
1、一种用于对凤仙花坏死斑病毒进行实时荧光定量RT-PCR检测的引物，所述的引物由上游引物和下游引物组成，所述的上游引物的碱基序列如序列表中SEQ ID NO：1所示，所述的下游引物的碱基序列如序列表中SEQ ID NO：2所示，目标产物片段长度为182bp。
2、一种用于对凤仙花坏死斑病毒进行实时荧光定量RT-PCR检测的TaqMan探针，所述的TaqMan探针的碱基序列如序列表中SEQ ID NO：3所示，在所述的TaqMan探针的5′端标记有报告荧光基团，3′端标记有淬灭荧光基团，所述的TaqMan探针位于上述第1技术方案所述的引物的上游引物和下游引物之间。
所述的报告荧光基团可采用一些常用的报告荧光基团，如FAM，所述的淬灭荧光基团可采用一些常用的淬灭荧光基团，如TAMRA。
3、一种对凤仙花坏死斑病毒进行实时荧光定量RT-PCR检测的试剂盒，包括引物和TaqMan探针；所述的引物是上述第1技术方案所述的引物，所述的TaqMan探针是上述第2技术方案所述的TaqMan探针。
上述试剂盒还包括阳性标准品，它是从阳性克隆菌液并提取质粒，用紫外光分光光度计测定D260nm和280nm的吸光度，并计算提取的质粒含量，将质粒用超纯水以10倍的梯度稀释，最后稀释到以10¹、10²、10³、10⁴、10⁵倍质粒制成的阳性标准品，每次使用量各为2μl/每反应。
上述试剂盒还包括凤仙花坏死斑病毒免疫试纸条，M-MLV反转录酶，5x M-MLV Buffer，10Mm dNTP mixture，50μl随机引物六聚体，40U/μl RNA抑制剂，PCR quality water，Illustra RNAspin Mini RNA Isolation Kit试剂盒，百泰克生物公司的PCR产物回收纯化试剂盒，感受态细胞DH5@，SOC培养基和X-Gal、IPTG、Amp的LB蓝白斑培养基，所述的感受态细胞DH5@，SOC培养基和X-Gal、IPTG、Amp的LB蓝白斑培养基是按照TaKaRa公司常用试剂配制中X-Gal、IPTG、Amp的LB蓝白斑培养基的配制方法配置而成，质粒回收纯化试剂盒(购于百泰克生物技术有限公司)，TaKaRa公司Premix Ex TaqTM超混液和PMD19 simple-T Vector，灭菌超纯水。
4、一种检测凤仙花坏死斑病毒的实时荧光定量RT-PCR方法，包括待测病毒RNA的提取及其cDNA的合成，TaqMan荧光定量RT-PCR反应体系，在TaqMan荧光定量RT-PCR反应体系进行TaqMan荧光定量RT-PCR反应，通过标准品的制备及标准曲线的建立，计算得出检测结果，在合成和所述的反应中使用的引物是上述第1技术方案所述的引物，在合成和所述的反应中使用的TaqMan探针是上述第2技术方案所述的TaqMan探针。
上述一种检测凤仙花坏死斑病毒的实时荧光定量RT-PCR方法中所述的TaqMan荧光定量RT-PCR反应体系还可以根据TaKaRa公司Premix Ex TaqTM的说明书，对试剂的用量进行了调配，使之达到更好的效果，所调配后的TaqMan荧光定量RT-PCR反应体系是：采用25μl反应体系，其中Premix Ex TaqTM(2x)12.5μl，上游引物和下游引物各0.5μl，TaqMan探针0.25μl，dH₂O(灭菌水)9.25μl，cDNA 2μl；所有反应试剂都在冰上配制；实时荧光定量PCR反应程序是预变性温度94℃，5min；退火温度58℃，30s；58℃采集荧光信号15s。
5、用本发明所述的引物和本发明所述的TaqMan探针、用本发明所述的试剂盒或用本发明所述的检测凤仙花坏死斑病毒的实时荧光定量RT-PCR方法在检测凤仙花坏死斑病毒中的应用。
所述的应用包括在检测蝴蝶兰、蜘蛛兰或一点红上凤仙花坏死斑病毒的应用。
与现有技术相比，本发现具有以下优点和效果：
1.操作简单，稳定性好，灵敏度高，特异性强；实施例中表明：每个样品三个重复所得到的循环数(Ct)值差值在0.01至1.7，说明本发明可靠性，重复性好；同时三个不同寄主上检测得到的Ct平均值差值在0.25至0.34，说明该发明的稳定性良好。图4中表明：本方法能检测出INSV病毒含量6.99拷贝·μl^-1，表明本发明具有微量检测的效果；图6中在INSV、马蹄莲褪绿斑病毒(Calla LilyChlorotic Spot Virus，CCSV)、番茄环斑病毒(Tomato Zonate Spot Virus，TZSV)和番茄斑萎病毒(Tomato spotted wilt tospovirus，TSWV)这四种病毒中只有INSV有荧光信号，其余CCSV、TSWV和TZSV三种病毒都没有发现明显的荧光扩增曲线，表明本发明对INSV检测的特异性强。
2.检测时间短，从RNA提取到检测出最终结果只需要3h；
3.适用范围广泛，经过试验，应用本发明可以分别从相应的植物中检测出凤仙花坏死斑病毒，而且效果明显。
4.本发明既可定性检测，又能定量检测凤仙花坏死斑病毒，可以代替传统定性检测凤仙花坏死斑病毒的方法。
序列表中SEQ ID NO：1所示的是本发明的引物的上游引物的碱基序列；
序列表中SEQ ID NO：2所示的是本发明的引物的下游引物的碱基序列；
序列表中SEQ ID NO：3所示的是本发明的TaqMan探针的碱基序列，在所述的TaqMan探针的5′端标记有报告荧光基团，3′端标记有淬灭荧光基团。
附图说明
图1是本发明引物的特异性检测琼脂糖凝胶电泳图，它是以碱基序列如序列表中SEQ ID NO：1所示的上游引物和碱基序列如序列表中SEQ ID NO：2所示的下游引物RT-PCR扩增得到的INSV特定核酸片段。M为Marker；1和2是INSV经所述上下游引物PCR后的两个重复结果片段(即目的片段)。
图2是对凤仙花坏死斑病毒的实时荧光定量RT-PCR检测的标准品的扩增曲线，其相关系数为：0.997，PCR扩增效率为：100.3％。从左到右设置5个连续的浓度相差10倍的标准质粒，每个相应的浓度设置了3个重复。
图3是对凤仙花坏死斑病毒的实时荧光定量RT-PCR检测的标准品的标准曲线，其斜率：-3.315，截距49.300。图中A、B、C、D、E五个点从左到右斜下来分别是标准品质粒稀释度：10⁵、10⁴、10³、10²、10¹。可以看出：所采集的荧光强度达到一预定值所经过的循环数越高，其拷贝数越低。
图4是对凤仙花坏死斑病毒的实时荧光定量PCR灵敏度信号检测的扩增曲线，曲线从左到右，曲线1是6.99×10⁹拷贝·μl^-1、曲线2是6.99×10⁸拷贝·μl^-1、曲线3是6.99×10⁷拷贝·μl^-1、曲线4是6.99×10⁶拷贝·μl^-1、曲线5是6.99×10⁵拷贝·μl^-1、曲线6是6.99×10⁴拷贝·μl^-1、曲线7是6.99×10³拷贝·μl^-1、曲线8是699拷贝·μl^-1、曲线9是69.9拷贝·μl^-1、曲线10是6.99拷贝·μl^-1，其余曲线为阴性对照。
图5是呈贡蝴蝶兰、云安会都蜘蛛兰和农大一点红INSV病毒的TaqMan荧光定量PCR扩增曲线图，图中曲线1、曲线6和曲线9为农大一点红上INSV病毒的3个重复扩增曲线；曲线2、曲线5和曲线7为呈贡蝴蝶兰上INSV病毒的3个重复扩增曲线；曲线3、曲线4和曲线8为云安会都蜘蛛兰上INSV病毒的3个重复扩增曲线。其余三条曲线的为阴性对照扩增曲线。
图6是TaqMan荧光定量RT-PCR的特异性扩增曲线图，图中只有凤仙花坏死斑病毒(Impatiens necrotic spot virus，INSV)采集到荧光信号扩增，而其余样品：马蹄莲褪绿斑病毒(Calla Lily Chlorotic Spot Virus，CCSV)、番茄环斑病毒(Tomato Zonate Spot Virus，TZSV)和番茄斑萎病毒(Tomato spotted wilttospovirus，TSWV)均无明显荧光信号发生。
具体实施方式
以下结合具体实施例对本发明作进一步的说明，但不构成对本发明保护范围的限制。
实施例1  用于对凤仙花坏死斑病毒进行实时荧光定量RT-PCR检测的引物及其设计与合成。
所述的引物由上游引物和下游引物组成，所述的上游引物的碱基序列如序列表中SEQ ID NO：1所示，所述的下游引物的碱基序列如序列表中SEQ ID NO：2所示。
所述的引物是根据Genbank报道的INSV SRNA链上的NSs基因序列(登录号：NC_003624)，使用DNAman序列比对软件来选择保守区域和引物设计在线软件Primer 3.0和Primer 5.0在保守区域上设计的引物。该引物对INSV阳性样品(经INSV免疫试纸条和RT-PCR检测呈阳性)检测的特异性结果如图1所示，目标条带清晰明亮，而且无杂带，说明这对引物对INSV cDNA特异性显著。
所述的引物由博迈德生物公司合成。
实施例2  用于对凤仙花坏死斑病毒进行实时荧光定量RT-PCR检测的TaqMan探针及其设计与合成
所述的TaqMan探针是根据Genbank报道的INSV SRNA链上的NSs基因序列(登录号：NC_003624)，使用DNAman序列比对软件来选择保守区域和引物设计在线软件Primer 3.0和Primer 5.0在保守区域上设计的探针，所述的TaqMan探针的碱基序列如序列表中SEQ ID NO：3所示。所述的TaqMan探针在实施例1所述的上游引物和下游引物之间，所述的TaqMan探针的5端标记有报告荧光基团，3端标记有淬灭荧光基团，所述的报告荧光基团为FAM，所述的淬灭荧光基团为TAMRA，所述的TaqMan探针由上海宝信生物公司合成。
实施例3  用于对凤仙花坏死斑病毒进行实时荧光定量RT-PCR检测的试剂盒及其制备
所述的试剂盒包括引物和TaqMan探针；所述的引物是实施例1所述的引物；所述的TaqMan探针是实施例2所述的TaqMan探针；其引物和探针的设计分别按实施例1和实施例2所述的方法进行；
所述的试剂盒还包括阳性标准品，它是从阳性克隆菌液并提取质粒，用紫外光分光光度计测定D260nm和280nm的吸光度，并计算提取的质粒含量。将质粒用超纯水以10倍的梯度稀释，最后稀释到以10¹、10²、10³、10⁴、10⁵倍质粒制成阳性标准品，每次使用量各为2μl/每反应。
试剂盒还包括市场上可以现买得到的试剂或可以现配的材料：它们是INSV免疫试纸条，M-MLV反转录酶、5x M-MLV Buffer、10Mm dNTP mixture、50μl随机引物六聚体、40U/μl RNA抑制剂、PCR quality water，Illustra RNAspin MiniRNA Isolation Kit试剂盒，百泰克生物公司的PCR产物回收纯化试剂盒，感受态细胞DH5@，SOC培养基和X-Gal、IPTG、Amp的LB蓝白斑培养基，所述的感受态细胞DH5@，SOC培养基和X-Gal、IPTG、Amp的LB蓝白斑培养基是按照TaKaRa公司常用试剂配制中X-Gal、IPTG、Amp的LB蓝白斑培养基的配制方法配置而成，质粒回收纯化试剂盒(购于百泰克Bioteke生物技术有限公司)，TaKaRa公司Premix Ex TaqTM超混液和PMD19 simple-T Vector，灭菌超纯水。
实施例4  用本发明的引物和TaqMan探针、试剂盒或用本发明检测凤仙花坏死斑病毒的方法，对蝴蝶兰(Phalaenopsis sp.)上凤仙花坏死斑病毒进行实时荧光定量RT-PCR检测。
以下所用试剂和试剂盒中所用试剂无说明，均为市售产品。
其检测步骤如下：
(1)合成如下引物和TaqMan探针
所述的引物由上游引物和下游引物组成，所述的上游引物的碱基序列如序列表中SEQ ID NO：1所示，所述的下游引物的碱基序列如序列表中SEQ ID NO：2所示。
所述的TaqMan探针的碱基序列如序列表中SEQ ID NO：3所示，所述的TaqMan探针在上述上下游引物之间，所述的TaqMan探针的5端标记有报告荧光基团，3端标记有淬灭荧光基团，所述的报告荧光基团为FAM，所述的淬灭荧光基团为TAMRA。
所述的引物由博迈德生物公司合成，所述的TaqMan探针由上海宝信生物公司合成。
(2)病毒RNA的提取及cDNA的合成
1)蝴蝶兰体内病毒RNA采集和提取：病毒采集自云南省昆明市呈贡县斗南花卉市场中，用INSV免疫试纸条检测呈阳性的病叶；病毒提取按照应用IllustraRNAspin Mini RNA分离试剂盒(即Illustra RNAspin Mini RNA Isolation Kit，购于GE Healthcare公司，GE Healthcare公司是现在的通用电气有限公司，原安玛西亚生物科技有限公司)从蝴蝶兰病叶上提取RNA，操作步骤根据该分离试剂盒所提供的使用说明书进行；
2)cDNA的合成：采用20μl体系，将PCR quality water 3.5μl，5xM-MLVBuffer 2.0μl，10Mm dNTP mixture 2.0μl，50μl随机引物六聚体2.0μl，40U/μl RNA抑制剂1.0μl，M-MLV反转录酶0.5μl和RNA 5.0μl混合后，放置于冰上静置9分钟，后进行RT反应合成cDNA，RT反应程序：42℃，30min；99℃，5min；5℃，5min；4℃，保存，合成的cDNA置于-20℃保存备用；
(3)标准品的制备及标准曲线的建立
以经INSV免疫试纸条和RT-PCR检测为阳性的INSV样品的cDNA为模板，加入步骤(1)所述的引物进行PCR，PCR反应条件和温度设置如下：TakaRa ExTaq(5U/μl)0.25μl，10×Ex Taq Buffer 5μl，dNTP Mixture(各2.5mM)4μl，模板cDNA 2μl，上游引物(20μM)2μl，下游引物(20μM)2μl，灭菌蒸馏水up to 50μl
反应条件：

按照百泰克公司(Bioteke)DNA胶回收试剂盒说明书回收PCR扩增产物，Takara PMD19 simple-T Vector试剂盒连接，连接过程同实验说明书，并通过大肠杆菌DH5α转化，转化具体过程如下：
(a)10μl连接产物加入至100μl DH5α感受态细胞中，冰中放置30分钟。
(b)42℃加热45秒钟后，再在冰中放置1分钟。
(c)加入890μl SOC培养基，37℃振荡培养60分钟。
(d)取少量含感受态细胞的SOC培养基到X-Gal、IPTG、Amp的LB-琼脂平板
培养基上培养(37℃，12H～16H.恒温培养)，从长出白斑的对应区域，用牙签点一下，后点在另一块新的X-Gal、IPTG、Amp的LB-琼脂平板培养基上，再点到已配好PCR反应液的PCR离心管中进行PCR检测是否为目标片段长度。检测为阳性的菌液用紫外光分光光度计测定D260nm和280nm的吸光度，并计算提取的质粒含量。将质粒用超纯水以10倍的梯度稀释，最后稀释到以10¹、10²、10³、10⁴、10⁵倍质粒制成阳性标准品，并以制成的阳性标准品为模板，每个相应的浓度设置了3个重复，经实时荧光定量PCR反应后(反应体系具体见步骤4)制成相应的扩增曲线和标准曲线，如图2和图3，扩增相关系数为：0.997，PCR扩增效率为：100.3％。标准曲线，其斜率：-3.315，(-3.0～-4.0，其中-3.4最佳)截距49.300。
(4)TaqMan荧光定量RT-PCR反应体系
采用25μl反应体系，其中Premix Ex TaqTM(2x)12.5μl，上、下游引物各0.5μl，荧光探针0.25μl，dH₂O(灭菌水)9.25μl，cDNA 2μl(第(2)步中合成)；所有反应试剂都在冰上配制，其余操作按照宝生物工程(大连)有限公司(TaKaRa公司)的Premix Ex TaqTM的说明书进行；实时荧光定量PCR反应程序：预变性温度94℃，5min；退火温度58℃，30s；58℃采集荧光信号15s。结果见表2和图5，结果显示3个重复阳性样品采集到荧光信号产生的循环数分别是：27.74、27.15和27.75，其病毒含量分别是：8.11×10⁵拷贝·μl^-1，1.25×10⁶拷贝·μl^-1，8.08×10⁵拷贝·μl^-1；而阴性对照没有荧光信号的产生。
用试剂盒检测上述病毒是：首先从INSV检测为阳性的病叶中提取植物总RNA，病毒提取使用Illustra RNAspin Mini RNA Isolation Kit方法，操作步骤根据GE Healthcare公司提供的使用说明书进行，对所提的植物总RNA采用上述20μl体系cDNA的合成方法合成；使用本试剂盒中的引物和探针，并以合成的cDNA为模板，根据实施例4所述的步骤(3)标准品的制备、标准曲线的建立和步骤(4)TaqMan荧光定量RT-PCR反应，最终实现对病毒的含量的绝对定量检测。
实施例5  用本发明所述的引物和TaqMan探针、试剂盒或用本发明检测凤仙花坏死斑病毒的方法，对蜘蛛兰(Hymenocallis littoralis Salisb)上凤仙花坏死斑病毒进行实时荧光定量RT-PCR检测。
待检测样品为采自于云南省昆明市云安会都的蜘蛛兰(Hymenocallislittoralis Salisb)，实时荧光定量RT-PCR检测方法与实施例4相同，不再赘述。本实验设置了3个重复和3个阴性对照，结果见表2和图5，图中曲线3、曲线4和曲线8是云安会都蜘蛛兰上病毒的3个重复扩增曲线。结果显示3个重复阳性样品采集到荧光信号产生的循环数分别是：27.91、27.10和28.25，其病毒含量分别是：7.21×10⁵拷贝·μl^-1，1.30×10⁶拷贝·μl^-1，5.59×10⁵拷贝·μl^-1；而阴性对照没有荧光信号的产生。
实施例6  应用于本发明的引物和TaqMan探针、试剂盒或用本发明检测凤仙花坏死斑病毒的方法，对一点红(Emilia sonchifolia(linn.)DC)上凤仙花坏死斑病毒的实时荧光定量RT-PCR检测。
待检测样品为人工接种感染INSV的一点红(Emilia sonchifolia(linn.)DC)植株，该植株是本课题组在云南农业大学国家实验室工程中心温室中培育，并用摩擦接种的方法将采自云南省昆明市呈贡县的INSV病毒成功接种。实时荧光定量RT-PCR检测方法与实施例4相同，不再赘述。本实验设置了3个重复和3个阴性对照，结果见表2和图5，图中曲线1、曲线6和曲线9为农大一点红上病毒的3个重复扩增曲线；结果显示3个重复阳性样品采集到荧光信号产生的循环数分别是：27.86、27.05和28.75，其病毒含量分别是：7.45×10⁵拷贝·μl^-1，1.34×10⁶拷贝·μl^-1，3.89×10⁵拷贝·μl^-1；而阴性对照没有荧光信号的产生。
实施例7  本发明的特异性和重复性以及灵敏度的检测：
按照应用Illustra RNAspin Mini RNA Isolation Kit(购置于GE Healthcare公司，即现在的通用电气有限公司，原安玛西亚生物科技有限公司)提取RNA，操作步骤根据GE Healthcare公司提供的使用说明书从以下四种番茄斑萎病毒属病毒感染的植物中提取总RNA(目前在云南省发现四种番茄斑萎病毒属病毒)，它们分别是INSV(采自云南省昆明市呈贡县蝴蝶兰)、TSWV(来源于云南省昆明市呈贡县莴笋)、TZSV(来自云南省建水市番茄)、CCSV(采自云南农业大学试验农场大棚内蜘蛛兰)；RNA经RT反应合成cDNA后，用实时荧光定量来检测其特异性，结果如图6。对同一INSV阳性样品设置3个重复，用实时荧光定量PCR进行评价，如图5和表2。把阳性质粒用灭菌超纯水以10倍的梯度稀释，从10¹稀释至10²⁰，用实时荧光定量PCR来检测其最低的拷贝数，如图4；实验操作中病毒RNA的提取及cDNA的合成，标准品的制备和TaqMan荧光定量RT-PCR反应与实施例4相同。
表2  呈贡蝴蝶兰、云安会都蜘蛛兰和农大一点红植株上的
INSV病毒含量检测结果

注：重复1、重复2和重复3表示循环数Ct值，呈贡蝴蝶兰表示采集于云南省昆明市呈贡斗南花卉市场中的蝴蝶兰植株，经INSV免疫试纸条检测为INSV阳性；云安会都蜘蛛兰表示采自于云南省昆明市云安会都的蜘蛛兰植株，，经INSV免疫试纸条检测为INSV阳性；农大一点红表示本课题组在云南农业大学国家实验室工程中心温室中培育的一点红植株，并接种INSV病毒，经INSV免疫试纸条检测为INSV阳性。
从表1中可以清楚地发现每个样品三个重复所得到的Ct值差值在0.01至1.7，说明本发明可靠性，重复性好；同时三个不同寄主上检测得到的Ct平均值差值在0.25至0.34，说明该发明的稳定性良好。图4表明：本发明能检测出INSV病毒含量6.99拷贝·μl^-1，表明本发明具有微量检测的效果；图6中在INSV、TSWV、TZSV、CCSV这四种病毒中只有INSV有荧光信号，CCSV、TSWV和TZSV三种病毒都没有发现明显的荧光扩增曲线，表明本发明对INSV检测的特异性强。
序列表
<110>云南农业大学
 
<120>一种检测凤仙花坏死斑病毒的实时荧光定量RT-PCR方法及其引物、探针和试剂盒
 
<160>3
 
<170>PatentIn version 3.3
 
<210>1
<211>22
<212>DNA
<213>凤仙花坏死斑病毒(Impatiens necrotic spot virus)
 
<400>1
ccagaccaac aacaggacag ta                                      22
 
<210>2
<211>20
<212>DNA
<213>Impatiens necrotic spot virus
 
<400>2
tgaagaaccg gctgtatgtg                                         20
 
<210>3
<211>23
<212>DNA
<213>Impatiens necrotic spot virus
 
<400>3
tcactggcaa tgtctgcaac ttc                                     23