半滑舌鳎hepcidin抗菌肽.pdf

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1、(10)申请公布号 CN 102219845 A (43)申请公布日 2011.10.19 CN 102219845 A *CN102219845A* (21)申请号 201110100736.2 (22)申请日 2011.04.21 C07K 14/46(2006.01) C12N 15/12(2006.01) A61P 31/04(2006.01) (71)申请人 中国海洋大学 地址 266100 山东省青岛市崂山区松岭路 238 号 (72)发明人 王亚楠 张全启 刘旭东 王旭波 齐洁 王志刚 于海洋 王兴莲 (74)专利代理机构 青岛海昊知识产权事务所有 限公司 37201 代理人 张。

2、中南 (54) 发明名称 半滑舌鳎 hepcidin 抗菌肽 (57) 摘要 本发明涉及一种半滑舌鳎 hepcidin 抗菌肽， 该抗菌肽的序列为SEQ IDNO ： 3。 本发明的半滑舌 鳎 hepcidin 抗菌肽的前体肽和成熟肽均可以是 通过化学合成、 基因重组表达获得的产物。本发 明获得的半滑舌鳎抗菌肽 hepcidin 经原核表达 后得到的重组蛋白具有明显的抑制金黄色葡萄球 菌、 鳗弧菌、 迟缓爱德华氏菌生长的作用， 相对于 其他抗菌肽， 本发明的抗菌肽对海洋病原菌的抑 制作用更为明显， 可应用于水产养殖业。因此， 本 发明的半滑舌鳎抗菌肽可应用于制备抗病菌类产 品， 抗病菌类产品包。

3、括饲料添加剂、 兽药、 防腐剂、 医药产品如抗菌药物等。 (51)Int.Cl. (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书 1 页 说明书 4 页 序列表 2 页 附图 1 页 CN 102219854 A1/1 页 2 1. 一种半滑舌鳎 hepcidin 抗菌肽的前体多肽， 其序列为 SEQ ID NO ： 2。 2. 一种半滑舌鳎 hepcidin 抗菌肽， 该抗菌肽是 ： a、 序列为 SEQ ID NO ： 3 的多肽 b、 与 a 中的序列具有 70或以上同源性的多肽， 该多肽的功能与 a 中的多肽功能相同 或相似。 3. 如权利要求 2 所述的抗菌肽。

4、， 其特征在于上述 b 的多肽与上述 a 的多肽具有 90的 同源性。 4. 一种多肽片段， 包括有序列为 SEQ ID NO ： 3 的多肽或其同源性的多肽， 上述的多肽 片段与序列为 SEQ ID NO ： 3 的抗菌肽功能相同或相似。 5. 一种多肽衍生物， 所述的多肽的序列为 SEQ ID NO ： 3。 6. 一种多核苷酸， 所述的多核苷酸是 ： a、 编码序列为 SEQ ID NO ： 3 抗菌肽的核苷酸 b、 编码与 a 中的抗菌肽具有 70或以上同源性多肽的核苷酸， 所编码的多肽的功能与 a 中的抗菌肽功能相同或相似 ； c、 与 a 或 b 中的多核苷酸互补的多核苷酸。 7.。

5、如权利要求6所述的多核苷酸， 其特征在于所述的多核苷酸的序列为SEQ ID NO ： 1。 权 利 要 求 书 CN 102219845 A CN 102219854 A1/4 页 3 半滑舌鳎 hepcidin 抗菌肽 技术领域 0001 本发明属于抗菌肽筛选技术领域， 具体涉及一种半滑舌鳎 hepcidin 抗菌肽。 背景技术 0002 半滑舌鳎(英文名half-smooth tongue sole， 拉丁名Cynoglossus semilaevis)， 是我国近海底层型名贵经济鱼类之一， 因其生长速度快， 肉味鲜美， 深受广大消费者的喜 爱。近年来， 半滑舌鳎的养殖迅速兴起， 其育苗和。

6、养殖技术已逐渐成熟且进入了产业化阶 段。但随着养殖规模的不断扩大， 其病害种类、 发病频率及其危害性亦逐年增加， 给整个舌 鳎养殖业造成了巨大的经济损失。同时海水养殖业中抗生素的大量应用， 不但造成水产品 中含有过量违禁的抗生素药品， 使产品质量下降 ； 而且引起致病菌的抗药性， 严重影响到水 产业的健康发展。 0003 海水养殖品种生活于富含各种微生物的水环境中， 长期的生存适应使其形成了有 效的防卫功能， 而其中抗菌肽(antimicrobial peptides)作为鱼、 虾、 贝类等动物非特异性 免疫防御系统的重要成分之一， 在防御海洋性细菌和病毒入侵方面起着重要作用。抗菌肽 是一类具。

7、有很强的广谱抗菌的天然小肽类物质， 自1975年Boman等从蚕蛹身上分离得到第 一个抗菌肽天蚕素 (Cecropin) 以来， 人们又陆续在细菌、 真菌、 植物、 无脊椎动物以及脊椎 动物中发现了至少 900 余种抗菌肽。Hepcidin(HEPC， HAMP) 是近年来发现的一类由肝脏合 成的、 富含半胱氨酸的抗菌肽 (Verga F， et al， Gene.205， 364 ： 37-44)， 具有广谱杀菌抑菌 作用， 在体内参与宿主的天然防御。鱼类 hepcidin 的研究始于 2002 年， 目前已从多种鱼类 中分离克隆了该基因， 但对于半滑舌鳎抗菌肽的研究仍属于空白阶段。 000。

8、4 与抗生素不用的是， 抗菌肽的靶位点主要是病原体细胞膜， 不易产生抗性， 对真核 细胞几乎没有作用。 由于抗菌谱广、 杀菌活力高、 作用迅速、 不产生耐药性等优点， 抗菌肽在 海水养殖鱼类的疾病防治上将是一种应用前景广阔的抗菌药物。 通过研究海水养殖品种的 抗菌肽基因的结构和功能， 进而通过基因功能技术在体外进行重组表达， 生产具有高效杀 菌效果的抗菌肽， 并应用于水产养殖业以及各种禽畜动物的饲养中， 同时利用基因工程改 良出新型抗病性品种， 已成为我国水产养殖业和畜牧业的必然选择。鱼类抗菌肽必将在未 来新型饲料添加剂、 甚至新型抗菌类药物的研发中起到重要作用。 发明内容 0005 本发明的。

9、目的在于提供一种半滑舌鳎 hepcidin 抗菌肽， 并可将半滑舌鳎抗菌肽 应用于制备抗病菌类产品， 以弥补现有技术的不足。 0006 本发明从半滑舌鳎cDNA文库中筛选出一条编码半滑舌鳎抗菌肽hepcidin家族成 员的 EST 序列， 并结合该 EST 序列设计特异性引物来扩增半滑舌鳎 hepcidin 抗菌肽的核苷 酸序列， 并将 hepcidin 抗菌肽进行原核表达来验证功能。 0007 本发明的一个目的是提供一种半滑舌鳎hepcidin抗菌肽的前体， 其序列为SEQ ID NO ： 2。 说 明 书 CN 102219845 A CN 102219854 A2/4 页 4 0008 。

10、本发明的另一个目的是提供一种半滑舌鳎 hepcidin 抗菌肽， 该抗菌肽是 ： 0009 a、 序列为 SEQ ID NO ： 3 的多肽 ； 0010 b、 与 a 中的多肽具有 70或以上同源性的多肽， 该多肽的功能与 a 中的多肽功能 相同或相似。 0011 对于b中所述的多肽， 可以是与a中的任一条多肽具有75同源性(4个氨基酸的 不同 )、 80以上同源性 (3 个氨基酸的不同 ) 和 90以上同源性 (1 个氨基酸的不同 ) 的 多肽， 该多肽的功能与 a 中的多肽功能相同或相似。 0012 本发明的另一个目的是提供一种多肽片段， 包括有序列为 SEQ ID NO ： 3 的多肽。

11、或 其同源性的多肽， 该多肽片段与序列为 SEQ ID NO ： 3 的抗菌肽功能相同或相似。 0013 本发明的另一个目的是提供序列为 SEQ ID NO ： 3 的抗菌肽的活性衍生物。 0014 本发明还提供一种多核苷酸， 所述的多核苷酸是 ： 0015 a、 编码序列为 SEQ ID NO ： 3 抗菌肽的核苷酸 0016 b、 编码与 a 中的多肽具有 70或以上同源性的多肽的核苷酸， 所编码的多肽的功 能与 a 中的抗菌肽功能相同或相似 ； 0017 c、 与 a 或 b 中的多核苷酸互补的多核苷酸。 0018 所述的多核苷酸的序列为 SEQ ID NO ： 1。 0019 本发明的。

12、半滑舌鳎 hepcidin 抗菌肽的前体肽和成熟肽均可以是通过化学合成、 基因重组表达获得的产物。本发明获得的半滑舌鳎抗菌肽 hepcidin 经原核表达后得到的 重组蛋白具有明显的抑制金黄色葡萄球菌、 鳗弧菌、 迟缓爱德华氏菌生长的作用， 相对于其 他抗菌肽， 本发明的抗菌肽对海洋病原菌的抑制作用更为明显， 可应用于水产养殖业。因 此， 本发明的半滑舌鳎抗菌肽可应用于制备抗病菌类产品， 抗病菌类产品包括饲料添加剂、 兽药、 防腐剂、 医药产品如抗菌药物等。 附图说明 0020 图 1 ： 本发明抗菌肽对金黄色葡萄球菌、 鳗弧菌和迟缓爱德华氏菌的抑菌作用图。 具体实施方式 0021 下面结合实。

13、例对本发明的方法做进一步说明。 但实例仅限于说明， 并不限于此。 下 列实施例中未注明具体条件的实验方法， 通常可按常规条件， 如 J. 萨姆布鲁克 (Sambrook) 等编写的 分子克隆实验指南 中所述的条件， 或按照制造厂商所建议的条件运行。 0022 一、 半滑舌鳎 hepcidin 抗菌肽序列的确定 0023 本发明首先构建半滑舌鳎 cDNA 文库， 从半滑舌鳎混合组织中克隆得到抗菌肽 hepcidin， 具体步骤为 ： 0024 1、 半滑舌鳎 cDNA 文库的构建及序列分析 ： 0025 总 RNA 的提取和 cDNA 合成 ： 分离半滑舌鳎成鱼各组织， 参照 invitroge。

14、n 公司 Trizol 抽提试剂说明书进行 RNA 提取。文库构建采用 Clontech 公司 SmartcDNA Library Construction Kit 试剂盒进行逆转录合成第一链， 得到 10l cDNA 第一链产物。 0026 半滑舌鳎 cDNA 文库的构建和鉴定 ： 取 cDNA 1l 用于连接反应， 体系 10l， 转化 其中 0.5l。取 200l 转化液涂板， 培养过夜。计算单菌落数为每板 1012 个， 重组率约 说 明 书 CN 102219845 A CN 102219854 A3/4 页 5 为 97， 可获得的 cDNA 文库克隆数为 1.01106个。随机挑。

15、取 24 个克隆测序， 结果 23 条 有效序列中 unigene 比例为 23/23100 100， 同时对序列进行全长分析， 其中 13 条 全长， 完整性比率为 13/17100 76.5。 0027 对半滑舌鳎 cDNA 文库的克隆进行测序分析， 得到 1 条 EST 序列编码半滑舌鳎抗菌 肽 hepcidin 前导肽。 0028 根据cDNA文库的筛选得到的半滑舌鳎抗菌肽hepcidin序列， 设计特异性引物P1， P2(P1 ： 5 -GTTCAGTTGGAGAAAGGTGGA-3； P2 ： 5 -GTCGTCGCCGCTCAGTATT-3 )， 以半滑舌 鳎肾脏总 RNA 为模。

16、板进行扩增， PCR 条件为 94 5min ； 94 30s， 55 30s， 72共 30 个循 环 ； 72 7min。扩增得到包括半滑舌鳎抗菌肽 hepcidin 开放阅读框的片段约 470bp， 连接 转化后以 M13(47) 和 M13(48) 为引物进行阳性克隆的鉴定， 扩增片段 600bp 左右， 测序确定 片段的序列。 0029 生物信息学分析显示半滑舌鳎抗菌肽 hepcidin cDNA 开放阅读框长 291bp， 预测 其编码一个含96个氨基酸残基的前体肽， 核苷酸序列如序列表中SEQ IDNO ： 1所述， 96个氨 基酸残基的前体肽的氨基酸序列如序列表中SEQ ID 。

17、NO ： 2所述。 进一步分析显示， 该前体肽 的第 1-24 位氨基酸残基为其信号肽区域， 第 80-96 位氨基酸残基为其成熟肽， 即序列表中 SEQ ID NO ： 3所述的氨基酸序列。 由于半滑舌鳎抗菌肽hepcidin前体肽中信号肽区域和成 熟肽区与已经报道的抗菌肽 hepcidin 家族有明显的相似性， 故半滑舌鳎抗菌肽 hepcidin 为新的 hepcidin 家族成员。 0030 2、 半滑舌鳎抗菌肽 hepcidin 重组蛋白的抑菌活性检测 0031 以原核表达系统诱导表达半滑舌鳎抗菌肽 hepcidin 成熟肽重组蛋白， 具体步骤 如下 ： 0032 重组质粒的构建与鉴定。

18、 ： 根据半滑舌鳎抗菌肽hepcidin的成熟肽cDNA序列， 利用 一对特异引物在其两端分别引入限制性内切酶位点EcoRI和NotI位点， 扩增半滑舌鳎抗菌 肽的成熟肽， 亚克隆进原核表达质粒 pET28a， 测序确定。 0033 将重组表达载体转化进宿主菌 BL21(DE3)pLysS， 在 LB 固体培养基平板中培养， 筛 选工程菌株。 挑取工程菌株活化后， 以150接种于15mL的2YT培养液中(含30ug/mL的 卡那霉素与34ug/mL氯霉素)37震荡培养， 当OD600约为0.6时加诱导剂异丙基-D-硫 代半乳糖苷 (IPTG) 至终浓度 1mM， 25诱导表达 20h， 菌液经。

19、 12,000rmp 离心 10min 收集细 胞。称取湿重， 按照 1g 10 50mL 的比例加入裂解液 (Tris-Hcl 50mM， EDTA 20mM， Nacl 100mM， Triton-100 0.5)重悬细胞， 并超声波破碎细胞， 12,000rmp， 离心10min收集裂解 上清液。 0034 用琼脂孔穴扩散法检测重组蛋白的抑菌活性 ： 将处于对数生长期的金黄色葡萄球 菌、 鳗弧菌和迟缓爱德华氏菌悬浮液 (OD600 0.2 0.3)200L 与 55的 LB 固体培养 基 ( 或海水培养基 2216E)25mL 混匀后铺板， 待其凝固后， 用牛沣杯 ( 直径 8mm) 打。

20、孔， 孔中 滴加约1.5uM超声离心后的上清液， 37培养8-12h， 以同体积的PBS做为阴性对照， 第2天 观察。结果发现抑菌圈出现， 说明半滑舌鳎抗菌肽 hepcidin 重组蛋白对金黄色葡萄球菌、 鳗弧菌和迟缓爱德华氏菌的生长具有抑制作用 ( 图 1)。 0035 二、 半滑舌鳎抗菌肽 hepcidin 的同源性多肽及活性衍生物 0036 本发明还保护与序列为 SEQ ID NO ： 3 的半滑舌鳎抗菌肽 hepcidin 具有 70或以 说 明 书 CN 102219845 A CN 102219854 A4/4 页 6 上同源性的多肽， 该多肽的功能与抗菌肽 hepcidin 功能。

21、相同或相似。 0037 对于所述的同源性的多肽， 可以是与抗菌肽 hepcidin 具有 75同源性 (4 个氨基 酸的不同)、 80以上同源性(3个氨基酸的不同)和90以上同源性(1个氨基酸的不同) 的多肽， 该多肽的功能与本发明的多肽功能相同或相似。 0038 所述的同源性多肽可以用Applied biosystem合成仪或PioneerTM肽合成仪等多 肽合成仪器按固相化学技术合成。 也可以通过插入目的核苷酸片段的表达载体表达出所需 要的多肽。 0039 本发明还涉及到包含有半滑舌鳎抗菌肽 hepcidin 的多肽片段， 所述的多肽片段 可以是在本发明抗菌肽的 N 端或 C 末端连接上的。

22、保护性残基所形成的片段， 例如在 N 端连 接上的 Ser-Gly-Ser(SGS) 形成的序列， 用琼脂孔穴扩散法检测对金黄色葡萄球菌的生长 具有抑制作用， 效果同抗菌肽相似。 0040 另外， 本发明的半滑舌鳎抗菌肽 hepcidin， 其氨基酸残基上可以进行类似于糖基 化的修饰， 从而增强抗菌性。 说 明 书 CN 102219845 A CN 102219854 A1/2 页 7 0001 序 列 表 CN 102219845 A CN 102219854 A2/2 页 8 0002 序 列 表 CN 102219845 A CN 102219854 A1/1 页 9 图 1 说 明 书 附 图 CN 102219845 A 。