技术领域
本发明涉及一种多孔树脂珠粒。更例示性地，本发明涉及含有第 一芳族单乙烯基化合物-二乙烯基化合物-(甲基)丙烯腈-第二芳族单乙 烯基化合物共聚物的多孔树脂珠粒。所述多孔树脂珠粒在合成核酸时 特别有用。
背景技术
使用亚磷酰胺法的固相合成方法被广泛用于核酸如DNA寡核苷 酸和RNA的化学合成。在所述方法中，例如，首先通过可切割的连接 体如琥珀酰基，将成为待合成的核酸的3’-末端的核苷预先负载至固相 合成载体上，并且将所述载体放入反应柱中且安置在自动核酸合成仪 上。之后，例如，以下列根据所述自动核酸合成仪的合成程序的方式， 将合成试剂注入所述反应柱中。(1)通过三氯乙酸/二氯甲烷溶液、二氯 乙酸/甲苯溶液等对核苷5’-OH基进行脱保护，(2)通过核苷亚磷酰胺(核 酸单体)/乙腈溶液和活化剂(四唑等)/乙腈溶液，使阿米迪特(amidite)与 5’-OH基进行偶联反应；(3)通过乙酸酐/吡啶/甲基咪唑/THF等对未反 应的5’-OH基进行封端，以及(4)通过碘/水/吡啶等对亚磷酸酯进行氧 化。
通过重复所述合成循环，合成了具有预期序列的核酸。通过用氨、 甲胺等对可切割的连接体进行水解，将最后合成的核酸从所述固相合 成载体中切出(参见非专利文献1)。
作为在核酸合成中待使用的固相合成载体，迄今已使用CPG(可控 孔度玻璃)、硅胶等无机粒子，但是近年来，已经开始使用能够增加每 重量固相合成载体的合成核酸量的树脂珠粒，以便以合适的价格和大 量来进行合成。作为这种树脂珠粒，例如可提及高交联且不溶胀的多 孔聚苯乙烯珠粒(参见专利文献1)、低交联且溶胀的多孔聚苯乙烯珠粒 (参见专利文献2)等。
然而，当将作为合成起点的核苷连接体的负载量增加至太高水平， 以便进一步增加重量固相合成载体的合成核酸量时，会造成阿米迪特 的偶联效率变差且获得的核酸纯度显著降低的问题。例如，可商购的 固相合成载体的核苷连接体负载量的上限迄今最多为约200μmol/g，所 述负载量的核苷连接体能够以高纯度合成20个碱基的DNA寡核苷酸。
已通过使用丙烯腈抑制多孔树脂珠粒在各种有机溶剂中的溶胀比 波动来进行尝试以改进核酸合成能力(参见专利文献3)。然而，尽管该 文献中使用的多孔树脂珠粒在各种有机溶剂中多孔树脂珠粒的溶胀比 波动小，但是对核酸合成能力还需要进一步的改进。
专利文献1：JP-A-3-68593
专利文献2：JP-A-2005-325272
专利文献3：JP-A-2008-74979
非专利文献1：核酸化学的当前规程(2000)，第3.6单元，未改性 寡核苷酸的合成(Current Protocols in Nucleic Acid Chemistry(2000)， UNIT 3.6 Synthesis of Unmodified Oligonucleotides)。
发明内容
本发明的目的是提供一种用于以高合成量和高纯度来合成核酸的 多孔树脂珠粒。
本发明人已首次出乎其意料地发现，在含有第一芳族单乙烯基化 合物-二乙烯基化合物-(甲基)丙烯腈-第二芳族单乙烯基化合物共聚物 的多孔树脂珠粒中，当在核酸合成中使用其中
(1)所述第二芳族单乙烯基化合物含有能够通过脱水缩合反应与羧 基结合的基团，并且
(2)干体积为2至3ml/g，
的多孔树脂珠粒作为固相合成载体时，提高了获得的核酸合成量 并且提高了其纯度。
基于这些发现，本发明人已进一步进行深入研究，结果完成了本 发明。
因此，本发明涉及下列多孔树脂珠粒，用于制造核酸的方法等。
(1)一种多孔树脂珠粒，所述多孔树脂珠粒包含第一芳族单乙烯基 化合物-二乙烯基化合物-(甲基)丙烯腈-第二芳族单乙烯基化合物共聚 物，其中所述第二芳族单乙烯基化合物含有能够通过脱水缩合反应与 羧基结合的基团，并且其中所述多孔树脂珠粒具有2至3ml/g的干体 积。
(2)在(1)中所述的多孔树脂珠粒，其中所述能够通过脱水缩合反 应与羧基结合的基团是选自氨基、氨烷基、羟基和羟烷基的基团。
(3)在(1)或(2)中所述的多孔树脂珠粒，其中源自所述(甲基)丙烯 腈的结构单元的量为1至4mmol/g。
(4)在(1)至(3)中任一项所述的多孔树脂珠粒，其中基于单体的总 量，所述二乙烯基化合物的量为2至10mol％。
(5)在(1)至(4)中任一项所述的多孔树脂珠粒，其中所述二乙烯基 化合物是二乙烯基苯。
(6)一种制造核酸的方法，所述方法包含将核苷或核苷酸通过可切 割的连接体顺序结合至(1)至(5)中任一项所述的多孔树脂珠粒，由此获 得寡核苷酸。
本发明的多孔树脂珠粒具有高核酸合成量和核酸合成纯度。因此， 当使用本发明的多孔珠粒时，与使用常规多孔树脂珠粒的情况相比， 能够有效地进行核酸的合成。
具体实施方式
本发明的多孔树脂珠粒含有第一芳族单乙烯基化合物-二乙烯基 化合物-(甲基)丙烯腈-第二芳族单乙烯基化合物共聚物。在本文中，术 语“第一芳族单乙烯基化合物-二乙烯基化合物-(甲基)丙烯腈-第二芳族 单乙烯基化合物共聚物”是指含有如下结构单元的共聚物，所述结构单 元各自分别源自第一芳族单乙烯基化合物、二乙烯基化合物、(甲基) 丙烯腈和第二芳族单乙烯基化合物。换言之，术语“第一芳族单乙烯基 化合物-二乙烯基化合物-(甲基)丙烯腈-第二芳族单乙烯基化合物共聚 物”是指通过将作为单体的第一芳族单乙烯基化合物、二乙烯基化合 物、(甲基)丙烯腈和第二芳族单乙烯基化合物共聚而获得的共聚物。
提供本发明多孔树脂珠粒的结构单元(即，第一芳族单乙烯基化合 物-二乙烯基化合物-(甲基)丙烯腈-第二芳族单乙烯基化合物共聚物的 结构单元)之一的“第一芳族单乙烯基化合物”是指苯乙烯或其取代产 物。作为苯乙烯的取代产物，例如可以提及这样的化合物，在所述化 合物中，利用碳原子数为1至5的烷基(例如，甲基、乙基、正丙基、 异丙基、正丁基、异丁基、仲丁基、叔丁基、正戊基、异戊基、仲戊 基或叔戊基)、卤原子、羧基、磺酸酯基、氰基、碳原子数为1至5的 烷氧基(例如，甲氧基、乙氧基、丙氧基、丁氧基或戊氧基)、硝基、酰 基(例如，乙酰氧基或苯甲酰氧基)等来取代苯乙烯的一个以上氢原子。
作为这种第一芳族单乙烯基化合物，例如例示性地可以提及：苯 乙烯；作为苯环部分被取代的苯乙烯的“核烷基取代的苯乙烯”，如邻甲 基苯乙烯、间甲基苯乙烯、对甲基苯乙烯、2，4-二甲基苯乙烯、乙基苯 乙烯、三甲基苯乙烯和对叔丁基苯乙烯；“α-烷基取代的苯乙烯”，如α- 甲基苯乙烯和α-甲基对甲基苯乙烯；作为苯环部分被卤代的苯乙烯的 “核卤代苯乙烯”，如氯苯乙烯、二氯苯乙烯、氟苯乙烯、五氟苯乙烯、 溴苯乙烯；“卤代烷基苯乙烯”，如氯甲基苯乙烯和氟甲基苯乙烯；“酰 氧基苯乙烯”，如羟基苯乙烯、羟甲基苯乙烯、苯甲酸乙烯酯、苯乙烯 磺酸钠、氰基苯乙烯、甲氧基苯乙烯、乙氧基苯乙烯、丁氧基苯乙烯、 硝基苯乙烯、乙酰氧基苯乙烯和苯甲酰氧基苯乙烯等，然而不限于此。 优选作为第一芳族单乙烯基化合物的是苯乙烯。
提供本发明多孔树脂珠粒的结构单元之一的“二乙烯基化合物”是 指芳族二乙烯基化合物、二(甲基)丙烯酸酯或其取代产物。作为芳族二 乙烯基化合物的取代产物或二(甲基)丙烯酸酯的取代产物，可以提及例 如其中将所述芳族二乙烯基化合物或二(甲基)丙烯酸酯的一个以上氢 原子用下列基团取代的化合物：碳原子数为1至5的烷基；卤原子； 羧基；磺酸酯基；氰基；碳原子数为1至5的烷氧基；和硝基。
作为这样的二乙烯基化合物，例示性地，例如可以提及：芳族二 乙烯基化合物如二乙烯基苯、甲基二乙烯基苯、二乙烯基甲苯和二乙 烯基萘；二(甲基)丙烯酸酯化合物如乙二醇二(甲基)丙烯酸酯、二甘醇 二(甲基)丙烯酸酯、三甘醇二(甲基)丙烯酸酯、四甘醇二(甲基)丙烯酸 酯，另外的多羟基乙二醇二(甲基)丙烯酸酯、丙二醇二(甲基)丙烯酸酯、 二丙二醇二(甲基)丙烯酸酯，另外的多羟基丙二醇二(甲基)丙烯酸酯、 1，2-丁二醇二(甲基)丙烯酸酯、1，3-丁二醇二(甲基)丙烯酸酯、1，4-丁二 醇二(甲基)丙烯酸酯、1，5-戊二醇二(甲基)丙烯酸酯、1，6-己二醇二(甲基) 丙烯酸酯、1，9-壬二醇二(甲基)丙烯酸酯、1，10-癸二醇二(甲基)丙烯酸 酯、2-甲基-1，8-辛二醇二(甲基)丙烯酸酯以及1，4-环己二醇二(甲基)丙 烯酸酯；等。优选作为本发明二乙烯基化合物的是二乙烯基苯。关于 所述二乙烯基苯，优选使用邻、间或对二乙烯基苯或其混合物作为提 供所述结构单元的化合物。在它们之中，特别优选间或对二乙烯基苯。 所述二乙烯基化合物在本发明的多孔树脂珠粒中起交联剂的作用。由 于存在当交联剂的量小时，多孔树脂珠粒易于溶胀这一趋势，所以所 述二乙烯基化合物的量可有助于增加溶胀比。
提供本发明多孔树脂珠粒的结构单元之一的“(甲基)丙烯腈”是指 “丙烯腈”或“甲基丙烯腈”，或“丙烯腈和甲基丙烯腈两者”。即，关于源 自本发明多孔树脂珠粒中含有的(甲基)丙烯腈的结构单元，可以各自独 立含有源自丙烯腈的结构单元或源自甲基丙烯腈的结构单元或者可以 含有这些单元两者。
提供本发明多孔树脂珠粒的结构单元之一的“第二芳族单乙烯基 化合物”是指含有“能够通过脱水缩合反应与羧基结合的官能团”的苯乙 烯或其取代产物。因此，在合成目标核酸的情况下，将核苷与所述多 孔树脂珠粒连接，并且当在所述情况下的连接体中存在羧基时，能够 容易地将连接体的羧基与所述多孔树脂珠粒连接，从而从能够有效地 进行核酸合成的观点来看是有利的。作为这种“能够通过脱水缩合反应 与羧基结合的官能团”，可以提及氨基、氨烷基、羟基、羟烷基等。更 优选地，可以提及伯胺基、氨甲基、羟基、羟甲基等。优选的是，将 所述“能够通过脱水缩合反应与羧基结合的官能团”布置在乙烯基的对 位，但也可以是邻位或间位。
作为这种第二芳族单乙烯基化合物，例如例示性地可以提及：氨 基苯乙烯单体或其取代产物如氨基苯乙烯；氨烷基苯乙烯单体或其取 代产物如氨甲基苯乙烯；羟基苯乙烯单体或其取代产物如羟基苯乙烯； 羟烷基苯乙烯单体或其取代产物如羟甲基苯乙烯；等，在其中优选对 氨基苯乙烯、对氨甲基苯乙烯、对羟基苯乙烯和对羟甲基苯乙烯。
作为羟基苯乙烯单体或氨基苯乙烯单体的“取代产物”，可以提及 其中除“能够通过脱水缩合反应与羧基结合的官能团”之外的一个以上 氢原子被下列基团取代的那些化合物：碳原子数为1至5的烷基；卤 原子；羧基；磺酸酯基；氰基；甲氧基；硝基；等。
可通过直接使用在制造初期含有“能够通过脱水缩合反应与羧基 结合的官能团”的第二芳族单乙烯基化合物来制造本发明的多孔树脂 珠粒(在下文中描述制造方法)，但是其也可以通过由悬浮共聚合等一次 合成多孔树脂珠粒，然后引入“能够通过脱水缩合反应与羧基结合的官 能团”来制造。特别地，当将具有羟基作为所述“能够通过脱水缩合反应 与羧基结合的官能团”的第二芳族单乙烯基化合物作为提供本发明多 孔树脂珠粒的结构单元的单体引入时(即，将羟基苯乙烯作为提供本发 明多孔树脂珠粒的结构单元的单体引入)，优选通过后一制造方法来制 造珠粒，因为所述羟基苯乙烯本身是非常不稳定的单体，原因在于其 倾向于引起聚合且因此不易对其进行操作和保存。
根据这种制造过程，作为成为本发明“第二芳族单乙烯基化合物” 基础的芳族单乙烯基化合物，可以提及例如：酰氨基苯乙烯如乙酰氨 基苯乙烯；酰氧基苯乙烯如乙酰氧基苯乙烯、乙酰氧基苯乙烯 (ethanoyloxystyrene)和苯甲酰氧基苯乙烯；卤烷基苯乙烯如氯甲基苯乙 烯；等。
可将通过悬浮共聚合等合成的多孔树脂珠粒中源自酰氧基苯乙烯 或酰氨基苯乙烯的结构单元，通过用碱或酸水解而转化成作为本发明 多孔树脂珠粒结构单元的“源自第二芳族单乙烯基化合物的结构单元”， 例示性地为源自羟基苯乙烯、氨基苯乙烯等的结构单元。而且，可将 源自卤烷基苯乙烯的结构单元，通过与邻苯二甲酰亚胺和肼、氨、氢 氧化钠等的反应转化为作为本发明多孔树脂珠粒的结构单元的“源自 第二芳族单乙烯基化合物的结构单元”，例示性地为源自氨烷基苯乙 烯、羟烷基苯乙烯等的结构单元。即，通过与邻苯二甲酰亚胺和肼、 氨等的反应，可将源自卤烷基苯乙烯的结构单元转化为源自氨烷基苯 乙烯的结构单元，并且通过与氢氧化钠等的反应，可将源自卤烷基苯 乙烯的结构单元转化为源自羟烷基苯乙烯的结构单元。优选的是，将 被转化成为所述“能够通过脱水缩合反应与羧基结合的官能团”的酰氧 基、酰氨基、卤烷基等布置在乙烯基的对位，但也可以是邻位或间位。
或者，可以对通过悬浮共聚合等合成的包含第一芳族单乙烯基化 合物-二乙烯基化合物-(甲基)丙烯腈化合物共聚物的多孔树脂珠粒进行 后处理，从而将卤烷基引入源自第一芳族单乙烯基化合物的结构单元 的芳环中，随后将其转化为源自氨烷基苯乙烯或羟烷基苯乙烯的结构 单元。例如，通过向包含第一芳族单乙烯基化合物-二乙烯基化合物-(甲 基)丙烯腈化合物共聚物的多孔树脂珠粒分散体中加入氯甲基醚和氯化 锌并使它们发生反应来引入氯甲基。接下来，经由通过使所述共聚物 与氨反应来引入氨甲基，从而引入“源自第二芳族单乙烯基化合物的结 构单元”。即使通过这种制造过程也能够获得本发明的多孔树脂珠粒。 优选的是，将卤烷基布置在乙烯基的对位，但也可以是邻位或间位。
尽管基于本发明多孔树脂珠粒的结构单元的总量，源自第一芳族 单乙烯基化合物的结构单元(也可以称作“第一单乙烯基化合物结构单 元”)的量不受特殊限制，但是对于每重量多孔树脂珠粒，其占有量优 选为3.0至8.3mmol/g，更优选为4.5至8.0mmol/g。进一步优选为 5.0至7.5mmol/g。
当源自第一单乙烯基化合物的结构单元的量小于上述范围时，所 述多孔树脂珠粒的耐溶剂性、热稳定性和多孔性可能不充分，从而当 被用于核酸的固相合成时，几乎不能预期所需的效果。而且，当源自 第一单乙烯基化合物的结构单元的量大于上述范围时，在有机溶剂中 的溶胀度降低，从而当被用于核酸的固相合成时，核酸的合成量变小， 并且进一步地，核酸纯度也减小。
尽管基于本发明多孔树脂珠粒的结构单元的总量，源自二乙烯基 化合物的结构单元(也可以称作“二乙烯基化合物结构单元”)的量不受 特殊限制，但是对于每重量多孔树脂，其占有量优选为0.2至1.0 mmol/g，更优选为0.25至0.8mmol/g，进一步优选为0.3至0.7mmol/g。
当源自二乙烯基化合物的结构单元的量小于上述范围时，多孔树 脂珠粒的耐溶剂性、热稳定性和多孔性可能不充分，从而当被用于核 酸的固相合成时，几乎不能预期所需的效果。而且，当源自二乙烯基 化合物的结构单元的量大于上述范围时，在有机溶剂中的溶胀度降低， 从而当被用于核酸的固相合成时，核酸的合成量可能变小，并且进一 步地，核酸纯度也可能减小。
本发明多孔树脂珠粒在乙腈中显著溶胀，但其干体积为2至3 ml/g。与通常的多孔树脂珠粒比较，所述干体积较小。然而，由于本发 明的多孔树脂珠粒在乙腈中显示大的溶胀比，因此能够扩大使用乙腈 的核酸合成的反应范围，由此能够改进核酸合成的反应性。因此，根 据本发明，能够获得用于固相合成载体中的多孔树脂珠粒，与用于核 酸合成应用的常规多孔树脂珠粒相比，所述多孔树脂珠粒能够合成同 时具有高的合成量及合成纯度的核酸。
因此，为了将本发明多孔树脂珠粒的干体积调整为2至3ml/g， 有必要考虑基于多孔树脂珠粒结构单元的总量，源自(甲基)丙烯腈的结 构单元(也可以称作“(甲基)丙烯腈结构单元”)的量。
基于本发明的多孔树脂珠粒结构单元的总量，源自(甲基)丙烯腈的 结构单元的量优选为1至4mmol/g，更优选为1.5至3.5mmol/g，进一 步优选为1.8至3.0mmol/g。
当源自(甲基)丙烯腈的结构单元的量小于上述范围时，几乎不能获 得所需干重的多孔树脂珠粒，并且当被用于核酸的固相合成时几乎不 能预期所需的效果。而且，当所述量大于上述范围时，几乎不能形成 多孔树脂珠粒自身。通过全氮分析来测定本发明多孔树脂珠粒中源自 (甲基)丙烯腈的结构单元的量。例示性地，这是通过将样品放入铂盘， 在微量天平中对其进行称重，然后通过微量全氮分析仪TN-110(由三菱 化学株式会社制造)来测定氮的量，并由源自(甲基)丙烯腈的结构单元 的分子量计算而得到。
尽管不受特殊限制，但是基于本发明多孔树脂珠粒的结构单元的 总重量，源自第二芳族单乙烯基化合物的结构单元(也可以称作“第二芳 族单乙烯基化合物结构单元”)的量优选为0.05至1.5mmol/g，更优选为 0.1至1.0mmol/g，进一步优选为0.2至0.8mmol/g。
这是因为当源自第二芳族单乙烯基化合物的结构单元的量小于上 述范围时，几乎不能获得其效果，而当所述量大于上述范围时几乎不 能形成多孔树脂珠粒本身。
在本发明多孔树脂珠粒中，关于源自第二芳族单乙烯基化合物的 结构单元所具有的“能够通过脱水缩合反应与羧基结合的官能团”的量， 例如在氨基、氨烷基、羟基或羟烷基的情况下，对于每重量多孔树脂 珠粒，“能够通过脱水缩合反应与羧基结合的官能团”的占有量优选为 0.05至1.5mmol/g，更优选为0.1至1.0mmol/g，进一步优选为0.2至 0.8mmol/g。
当所述“能够通过脱水缩合反应与羧基结合的官能团”的量小于上 述范围时，则存在当被用作核酸固相合成的载体时，核酸的合成量变 小的趋势。而且，当所述量大于上述范围时，则存在当被用作核酸固 相合成的载体时，核酸纯度降低的趋势。
在本发明多孔树脂珠粒中，关于源自第二芳族单乙烯基化合物的 结构单元具有的“能够通过脱水缩合反应与羧基结合的官能团”的量，例 如在氨基、氨烷基、羟基或羟烷基的情况下，通过基于JIS K 0070的 滴定来对其进行测定。例示性地，可使用已知量的乙酰化试剂(乙酸酐/ 吡啶)，通过对目标固相合成载体的羟基进行乙酰化，然后通过氢氧化 钾滴定来测定乙酰化未消耗的乙酸酐的量，从而能够计算所述官能团 的量。
用于制造本发明多孔树脂珠粒的方法不受特殊限制，并且可以提 及，例如：
(1)用于制造多孔树脂珠粒的方法，所述方法包括使用有机溶剂和 水，使第一芳族单乙烯基化合物、二乙烯基化合物、(甲基)丙烯腈和含 有能够通过脱水缩合反应与羧基结合的官能团的第二芳族单乙烯基化 合物进行悬浮共聚合；
(2)用于制造多孔树脂珠粒的方法，所述方法包括通过悬浮共聚合 等合成多孔树脂珠粒，然后将能够通过脱水缩合反应与羧基结合的官 能团引入到源自第二芳族单乙烯基化合物等的结构单元中。
在进行所述悬浮共聚合时，基于第一芳族单乙烯基化合物、二乙 烯基化合物、(甲基)丙烯腈和第二芳族单乙烯基化合物的总量，所述第 一芳族单乙烯基化合物的量(给料量)优选为31至85mol％，更优选为 45至82mol％，进一步优选为53至76mol％。
在进行所述悬浮共聚合时，基于第一芳族单乙烯基化合物、二乙 烯基化合物、(甲基)丙烯腈和第二芳族单乙烯基化合物的总量，所述二 乙烯基化合物的量(给料量)优选为2至10mol％，更优选为2.5至8 mol％，进一步优选为3至7mol％。
在进行所述悬浮共聚合时，基于第一芳族单乙烯基化合物、二乙 烯基化合物、(甲基)丙烯腈和第二芳族单乙烯基化合物的总量，所述(甲 基)丙烯腈的量(给料量)优选为10至40mol％，更优选为13至35mol％， 进一步优选为18至30mol％。
在进行所述悬浮共聚合时，基于第一芳族单乙烯基化合物、二乙 烯基化合物、(甲基)丙烯腈和第二芳族单乙烯基化合物的总量，所述第 二芳族单乙烯基化合物的量(给料量)优选为0.5至15mol％，更优选为 1至10mol％，进一步优选为2至8mol％。在包括通过悬浮共聚合等 来一次合成多孔树脂珠粒，然后引入“能够通过脱水缩合反应与羧基结 合的官能团”的制造方法的情况下，上述量对于成为第二芳族单乙烯基 化合物的基础的芳族单乙烯基化合物相同。
通过搅拌和使上述各化合物(在下文中有时将待进行悬浮共聚合 的本发明多孔树脂珠粒的各个组成成分(即，第一芳族单乙烯基化合物、 二乙烯基化合物、(甲基)丙烯腈和第二芳族单乙烯基化合物)称作“单体”) 和有机溶剂的混合物在水中乳化来进行悬浮共聚合。
在本发明中，有机溶剂是指在悬浮共聚合体系中除了水之外的溶 剂，并合适地使用烃和醇。例示性地，作为所述烃，可使用脂肪族饱 和或不饱和烃或者芳族烃，其中优选碳原子数为5至12的脂肪族烃， 并且更优选地，可以提及正己烷、正庚烷、正辛烷、异辛烷、十一烷、 十二烷等。另外，优选使醇共存，以便增加在此时(在下文中，将以增 加多孔性为目的而使用的醇称作“成孔剂”)获得的珠粒的多孔性。作为 依据本发明的醇，例如，可提及脂肪醇，并且其碳原子数优选为5至9。 作为这种醇，例示性地，可提及2-乙基己醇、戊醇(例如，叔戊醇)、壬 醇、2-辛醇、环己醇等。
取决于烃和醇的例示性组合，可任选地改变待用于悬浮共聚合中 的烃和醇的重量比，从而能够增加固相合成载体的比表面积。烃和醇 的优选混合比为以重量比计1∶9至6∶4。
在悬浮共聚合时，基于上述各单体的总重量，有机溶剂的重量优 选为0.5至2.5倍，更优选为0.8至2.2倍，进一步优选为1.0至2.0倍。 当该值大于或小于上述值时，所得多孔树脂珠粒的比表面积变小，并 且通过使用珠粒的化学反应的合成反应产物的量变小。
根据本发明，可通过应用常规的已知方法来进行用于进行悬浮共 聚合的方法本身。
在悬浮共聚合中待使用的分散体稳定剂不受特殊限制，并且可使 用常规已知的聚乙烯醇、聚丙烯酸、明胶、淀粉、羧甲基纤维素等亲 水保护性胶体试剂，以及碳酸钙、碳酸镁、磷酸钙、硫酸安定(valium sulfate)、硫酸钙、膨润土等微溶性粉末等。尽管分散体稳定剂的量不 受特殊限制，但是优选基于悬浮共聚合体系中水的重量，分散体稳定 剂的量为0.01至10重量％。当该值较小时，可能破坏悬浮共聚合的分 散稳定性，并且可能形成大量聚集体。当该值较大时，可能形成大量 的微小珠粒。
在进行悬浮共聚合时待使用的聚合引发剂不受特殊限制，并且可 使用常规已知的过氧化二苯甲酰、过氧化二月桂酰、过氧化二硬脂酰、 1，1-二(叔丁基过氧化)-2-甲基环己烷、1，1-二(叔己基过氧化)-3，3，5-三甲 基环己烷、1，1-二(叔己基过氧化)环己烷、1，1-二(叔丁基过氧化)-环己烷、 二叔己基过氧化物、叔丁基异丙苯基过氧化物、二叔丁基过氧化物、 1，1，3，3-四甲基丁基过氧化-2-乙基己酸酯、叔己基过氧化-2-乙基己酸 酯、叔丁基过氧化-2-乙基己酸酯、叔丁基过氧化异丙基一碳酸酯和类 似的过氧化物、以及2，2’-偶氮双异丁腈、2，2’-偶氮双-2-甲基丁腈、2，2’- 偶氮双-2，4-二甲基戊腈和类似的偶氮化合物。聚合引发剂的添加量不 受特殊限制，并且可以由本领域技术人员选择合适的量。
可任选地设定进行悬浮共聚合的反应条件，并且例如，可以提及 在60至90℃下搅拌30分钟至48小时。例如，搅拌速率为100rpm至 1,000rpm，优选为200rpm至500rpm。通过悬浮共聚合，能够获得第 一芳族单乙烯基化合物-二乙烯基化合物-(甲基)丙烯腈-第二芳族单乙 烯基化合物共聚物。
任选对这样获得的共聚物进行洗涤、干燥、分级等处理。另外， 在通过悬浮共聚合等合成多孔树脂珠粒之后，可以将能够通过脱水缩 合反应与羧基结合的官能团引入源自第二芳族单乙烯基化合物的结构 单元中。引入方法如前文中所述。
通过上述处理能够获得本发明的多孔树脂珠粒。可将该多孔树脂 珠粒用作固相合成载体。
本发明的“多孔树脂珠粒”并不总是必须显示严格的球形，并且其 至少可以为粒状。然而，从能够增加其填充固相合成反应柱的效率并 且其几乎不会破碎的观点来看，本发明的多孔树脂珠粒(用于固相合成 的载体)优选为球形。
通过激光衍射散射法测定的本发明多孔树脂珠粒的中值粒径不受 特殊限制，但是优选为1至1,000μm，更优选为10至500μm，进一步 优选为20至300μm。通过激光衍射散射法来测定本发明多孔树脂珠粒 的中值粒径。例示性地，使用50体积％的乙醇水溶液作为分散介质， 通过激光衍射散射型粒径分布分析仪LA-950(由日本堀场株式会社制 造)测定粒径来计算平均粒径。
中值粒径取决于在悬浮聚合的情况下在聚合开始前的搅拌条件、 成孔剂的种类和量以及在进行悬浮聚合时的分散体稳定剂的浓度。因 此，通过调整这些条件，可以将中值粒径调整在所需范围内。作为成 孔剂，可提及上述的醇。另外，在溶胀条件下中值粒径的增大有助于 增加多孔树脂珠粒的溶胀比。
通过压汞法测定的本发明多孔树脂珠粒的中值孔径不受特殊限 制，但是优选为1至1,000nm，更优选为5至500nm，进一步优选为 10至300nm。
通过压汞法来测定本发明多孔树脂珠粒的中值孔径。例示性地， 将0.2g多孔树脂珠粒放入水银测孔仪PoreMaster 60-GT中(由康塔仪器 公司制造)，并在140°的汞接触角和480dyn/cm的汞表面张力的条件下 通过压汞法来测定。
本发明的多孔树脂珠粒的干体积优选为2至3ml/g，更优选为2.2 至3ml/g，进一步优选为2.2至2.8ml/g。本发明的多孔树脂珠粒具有 在上述范围内的干体积并因此能够进行与迄今已开发的用于核酸合成 的多孔树脂珠粒相比，合成量和合成纯度都高的核酸合成。
当干体积小于上述干体积下限时，核酸的合成量和合成纯度降低。 在另一方面，当干体积大于上述干体积上限时，由于树脂含量较少， 所以核酸合成的起点数目变小，结果每个反应容器的核酸合成量降低。 当干体积小时，通常认为核酸合成的范围变小，这对核酸合成是不利 的。然而，尽管与通常的固相合成树脂珠粒相比体积较小，但是与通 常的固相合成树脂珠粒相比，本发明的多孔树脂珠粒能够出乎意料地 增加核酸的合成量和合成纯度。
通过量筒来测定本发明多孔树脂珠粒的干体积。例示性地，将 1.00g多孔树脂珠粒放入10ml容量的量筒中，通过稍微加入振动来将 多孔树脂珠粒完全填充于量筒中，然后测定其表观体积。
干体积取决于在悬浮共聚合时(甲基)丙烯腈单体的量。存在以下趋 势：当(甲基)丙烯腈的混合量为10至40mol％时，与不混合(甲基)丙烯 腈的情况相比，所得多孔树脂珠粒的干体积变小。
另外，干体积受在进行悬浮共聚合时要与单体混合的有机溶剂的 量和种类影响。存在以下趋势：随着有机溶剂的量变少，干体积变小。 然而，当有机溶剂的量太少时，孔径变得太小，因此核酸合成能力降 低，从而基于单体的总重量，有机溶剂的量优选为0.5至2.5倍。
可将本发明的多孔树脂珠粒用作各种化学合成反应的载体，并且 可将其特别有效地用在核酸合成中。
关于使用本发明多孔树脂珠粒的核酸合成，可以应用常规已知的 方法。例如，将下列的核苷琥珀酰基连接体
(其中DMT是5’-保护基，并且B1是碱基)
与本发明多孔树脂珠粒上能够通过脱水缩合反应与羧基结合的官能团 结合。接下来，以其变为预定的核苷酸序列的方式，从该核苷的5’末 端逐步地结合核苷亚磷酰胺。可使用自动合成仪来进行该合成反应。 例如，通过向填充有核苷琥珀酰基连接体结合的多孔树脂珠粒的装置 的反应柱中顺序进料5’-OH去保护试剂、核苷亚磷酰胺溶液、阿米迪 特活化剂溶液、氧化剂溶液、封端剂溶液、作为洗涤液的乙腈等来重 复所述反应。最后，例如通过利用碱溶液使其水解来切去琥珀酰基连 接体部分，从而获得所需核酸。可使用常规已知的连接体，例如，可 列举与核苷连接体结合并具有下列结构的多孔树脂珠粒等。
(其中由大圆表示的部分是用于固相合成的载体，DMT是5’-保护 基，且B1是碱基。)
实施例
下面参考实施例来进一步例示性地描述本发明。
发明例1
将配备有冷凝器、搅拌器和氮引入管的500ml容量的可分离式烧 瓶布置在恒温水浴上，并且将2.5g聚乙烯醇(由日本可乐丽株式会社制 造)和250g蒸馏水进料至其中并以300rpm搅拌来溶解聚乙烯醇。向 所得溶液中加入通过混合并溶解35g苯乙烯(由日本和光纯药工业株式 会社制造)、4.5g(4.8mol％)对乙酰氧基苯乙烯(由Sigma-Aldrich制造)、 5.5g(4.0mol％)二乙烯基苯(55％含量，由日本和光纯药工业株式会社 制造)、11.5g(29.7mol％)甲基丙烯腈(由日本和光纯药工业株式会社制 造)、60g 2-乙基己醇(由日本和光纯药工业株式会社制造)、30g异辛烷 (由日本和光纯药工业株式会社制造)和1g过氧化苯甲酰(25％水分，由 日本油脂株式会社制造)而制备的溶液，并且在室温下，在氮气流下搅 拌(300rpm)，然后通过升温至80℃来进行悬浮共聚合24小时。
使用蒸馏水和丙酮(由日本和光纯药工业株式会社制造)，通过过滤 来洗涤聚合产物，并且将其分散于丙酮中至约1L的总体积。使其静置 一段时间，从而使即使当倾斜容器时，沉淀也不变松散，然后弃去上 层丙酮。通过再次加入丙酮至约1L的总体积并重复静置和丙酮排出操 作来进行该沉淀的分级。通过过滤该分散体并将其在减压下干燥，获 得了含有苯乙烯-二乙烯基苯-甲基丙烯腈-对乙酰氧基苯乙烯共聚物的 多孔树脂珠粒。
接下来，将20g含有上述共聚物的多孔树脂珠粒粉末、80g乙醇、 50g蒸馏水和2g氢氧化钠进料到配备有冷凝器、搅拌器和氮引入管的 500ml容量的烧瓶中，并使其在搅拌的同时在75℃下进行反应18小 时。通过过滤该分散体并且在减压下将其干燥，获得了含有苯乙烯-二 乙烯基苯-甲基丙烯腈-4-羟基苯乙烯共聚物的多孔树脂珠粒。
发明例2
以与发明例1中相同的方式获得了含有苯乙烯-二乙烯基苯-丙烯 腈-4-羟基苯乙烯共聚物的多孔树脂珠粒，与发明例1中不同之处在于， 作为单体，使用34g苯乙烯、6g(5.7mol％)对乙酰氧基苯乙烯(由 Sigma-Aldrich制造)、8.5g(5.5mol％)二乙烯基苯(55％含量，由日本和 光纯药工业株式会社制造)和12g(34.6mol％)丙烯腈。
发明例3
以与发明例1中相同的方式获得了含有苯乙烯-二乙烯基苯-甲基 丙烯腈-4-羟基苯乙烯共聚物的多孔树脂珠粒，与发明例1中不同之处 在于，进料2.6g聚乙烯醇、260g蒸馏水、29g苯乙烯、5g(5.9mol％) 对乙酰氧基苯乙烯、7.5g(6.1mol％)二乙烯基苯、10.5g(29.9mol％)甲 基丙烯腈、58g 2-乙基己醇和25g异辛烷，并且将搅拌速率设定为350 rpm。
比较例1
以与发明例1中相同的方式获得了含有苯乙烯-二乙烯基苯-4-羟 基苯乙烯共聚物的多孔树脂珠粒，与发明例1中不同之处在于，使用 49g苯乙烯、4g(4.5mol％)对乙酰氧基苯乙烯、7g(5.4mol％)二乙烯基 苯(和0g甲基丙烯腈)作为单体，并且将2-乙基己醇改为52g，将异辛 烷改为23g。
比较例2
以与发明例1中相同的方式获得了含有苯乙烯-二乙烯基苯-甲基 丙烯腈-4-羟基苯乙烯共聚物的多孔树脂珠粒，与发明例1中不同之处 在于，进料2.6g聚乙烯醇、260g蒸馏水、33g苯乙烯、4g(5.3mol％) 对乙酰氧基苯乙烯和7g(6.3mol％)二乙烯基苯、5g(15.9mol％)甲基丙 烯腈、61g 2-乙基己醇，以及26g异辛烷，并且将搅拌速率设定为400 rpm。
比较例3
以与发明例1中相同的方式获得了含有苯乙烯-二乙烯基苯-甲基 丙烯腈-4-羟基苯乙烯共聚物的多孔树脂珠粒，与发明例1中不同之处 在于，进料2.6g聚乙烯醇、260g蒸馏水、42g苯乙烯、7g(6.3mol％) 对乙酰氧基苯乙烯、5.5g(3.4mol％)二乙烯基苯、13.5g(29.2mol％)甲 基丙烯腈、20g异辛烷和1.5g过氧化苯甲酰，使用48g 1-癸醇代替60 g 2-乙基己醇，并且将搅拌速率设定为450rpm。
试验例1：多孔树脂珠粒的物理性能测定
对在发明例1至3和比较例1至3中获得的多孔树脂珠粒进行下 列物理性能测定。
(中值粒径)
在50体积％的乙醇液体中，对待测定的每个样品进行超声分散。 对于该分散体，使用50体积％的乙醇液体作为分散介质，通过激光衍 射/散射型粒径分布分析仪LA-920(由日本堀场株式会社制造)来测定中 值粒径。
(中值孔径)
将0.2g份的待测定的每个样品放入水银测孔仪PoreMaster 60-GT 中(由康塔仪器公司制造)，并在140°汞接触角和480dyn/cm汞表面张 力的条件下，通过压汞法来测定中值孔径。
(官能团的量)
对0.5至2g待测定的每个样品进行称重，并将其放入烧瓶中，并 且向其中精确地加入0.5ml乙酰化试剂(通过向25g乙酸酐中加入吡啶 以调节总体积至100ml来制备)和4.5ml吡啶。通过调节烧瓶中的混合 物到95至100℃满2小时后，将其自然冷却至室温并且向其中加入1ml 蒸馏水。通过将混合物加热10分钟，使乙酰化未消耗的乙酸酐降解。 将烧瓶中的全部内含物转入烧杯中，用蒸馏水稀释至总体积150ml， 然后用0.5N的氢氧化钾水溶液滴定。与其独立地，除了不加入待测定 样品之外，通过上述相同的操作来进行空白试验。通过下式(1)来计算 待测定样品的官能团的量(羟基量)。在本文中，A(mmol/g)是指在待测 定样品中的羟基量，B(ml)是空白试验中氢氧化钾水溶液的滴定体积， C(ml)是在待测定样品的测定中氢氧化钾水溶液的滴定体积，f是氢氧 化钾水溶液因子且M(g)是待测定样品的称量重量。
A(mmol/g)＝(B-C)×0.5(mol/l)×f/M (1)
(源自(甲基)丙烯腈的结构单元含量)
将2至3mg份的待测定的每个样品放入铂盘中并用微量天平称 重，然后通过全氮分析仪TN-110(由三菱化学株式会社制造)来进行测 定。使用下式(2)，从这样获得的N浓度(重量％)来计算源自(甲基)丙 烯腈的结构单元D的含量。
D含量(mmol/g)＝(N浓度(重量％)×10)/(N分子量×D中的N数目) (2)
(干体积)
将1.00g份的待测定的每个样品放入10ml容量的量筒中，通过施 加振动将样品完全填充于其中，然后测定其表观体积。
将这些结果示于表1中。
[表1]
试验例2：DNA寡核苷酸的合成及其评价
使用在发明例1和2以及比较例1和2中获得的多孔树脂珠粒， 以下列方式合成具有20个碱基长度的DNA寡核苷酸并对其进行评价。
在发明例1和比较例2中获得的多孔树脂珠粒的情况下，将5g 多孔树脂珠粒、1.95g DMT-dT-3’-琥珀酸酯(由北京OM化学(OM chemicals)制造)、1.00g HBTU(由Novabiochem制造)、0.90ml N，N-二 异丙基乙胺(由Sigma-Aldrich制造)和50ml乙腈(由日本和光纯药工业 株式会社制造)混合，使其在搅拌时在室温下进行反应12小时，使用乙 腈通过过滤对其进行洗涤然后将其干燥。
在发明例2中获得的多孔树脂珠粒的情况下，将5g多孔树脂珠 粒、1.35g DMT-dT-3’-琥珀酸酯、0.70g HBTU、0.65ml N，N-二异丙基 乙胺和50ml乙腈混合，使其在搅拌时在室温下进行反应12小时，使 用乙腈通过过滤对其进行洗涤然后将其干燥。
在比较例1中获得的多孔树脂珠粒的情况下，将5g多孔树脂珠 粒、1.95g DMT-dT-3’-琥珀酸酯、1.00g HBTU、0.94ml N，N-二异丙基 乙胺和50ml乙腈混合，使其在搅拌时在室温下进行反应12小时，使 用乙腈通过过滤对其进行洗涤然后将其干燥。
将这些多孔树脂珠粒的每一种与10ml的CapA(20％乙酸酐/80％ 乙腈)、10ml的CapB(20％N-甲基咪唑/30％吡啶/50％乙腈)、0.1g的4- 二甲基氨基吡啶(由Sigma-Aldrich制造)以及25ml乙腈混合，使其在 搅拌时在室温下进行反应12小时，使用乙腈通过过滤对其进行洗涤， 然后在减压下将其干燥，从而获得DMT-dT-3’-琥珀酸酯结合的固相合 成载体。由DMT基的吸光率测定(412nm)来计算DMT-dT-3’-琥珀酸酯 的结合量，所述DMT基通过使用对甲苯磺酸/乙腈溶液的去保护来产 生。
将0.8至1.1g份的在上文中获得的DMT-dT-3’-琥珀酸酯结合的多 孔树脂珠粒填充于合成柱(6.3ml容量)中并将其设置在AKTA oligopilot plus 100(由通用电气医疗集团制造)上，并且在2当量/合成规 模(2eq/synthesis scale)的核苷亚磷酰胺浓度和DMT-on的条件下，合成 了20mer的DNA寡核苷酸的混合序列。合成之后，将多孔树脂珠粒干 燥，浸泡在25ml 28％的氨水中，然后使其在55℃下进行反应18小时， 从而进行DNA寡核苷酸的切出和碱基氨基的去保护。通过过滤器过滤 来分离多孔树脂珠粒，并且从滤液的UV吸光率测定(260nm)来计算核 酸的OD产率(相当于核酸合成量)。另外，从滤液的HPLC(由沃特斯公 司制造)测定来计算全长％(具有所需序列长度的DNA寡核苷酸的比 率)。结果示于表2中。
[表2]
使用在发明例3和比较例3中获得的多孔树脂珠粒，以下列方式 合成具有20个碱基长度的DNA寡核苷酸并对其进行评价。
在发明例3中获得的多孔树脂珠粒的情况下，将5g多孔树脂珠 粒、1.95g DMT-dT-3’-琥珀酸酯(由北京OM化学制造)、1.00g HBTU(由 Novabiochem制造)、0.90ml N，N-二异丙基乙胺(由Sigma-Aldrich制造) 和50ml乙腈(由日本和光纯药工业株式会社制造)混合，使其在搅拌时 在室温下进行反应12小时，使用乙腈通过过滤对其进行洗涤然后将其 干燥。
在比较例3中获得的多孔树脂珠粒的情况下，将5g多孔树脂珠 粒、1.46g DMT-dT-3’-琥珀酸酯、0.75g HBTU、0.68ml N，N-二异丙基 乙胺和50ml乙腈混合，使其在搅拌时在室温下进行反应12小时，使 用乙腈通过过滤对其进行洗涤然后将其干燥。
将这些多孔树脂珠粒的每一种与10ml的CapA(20％乙酸酐/80％ 乙腈)、10ml的CapB(20％N-甲基咪唑/30％吡啶/50％乙腈)、0.1g的4- 二甲基氨基吡啶(由Sigma-Aldrich制造)以及25ml乙腈混合，使其在 搅拌时在室温下进行反应12小时，使用乙腈通过过滤对其进行洗涤， 然后在减压下将其干燥，从而获得DMT-dT-3’-琥珀酸酯结合的固相合 成载体。由DMT基的吸光率测定(412nm)来计算DMT-dT-3’-琥珀酸酯 的结合量，所述DMT基通过使用对甲苯磺酸/乙腈溶液的去保护来产 生。
将3.3mg份的在上文中获得的DMT-dT-3’-琥珀酸酯结合的多孔树 脂珠粒填充于合成柱中并且将其设置在Applied Biosystems 3400 DNA 合成仪(由美国应用生物系统公司制造)上，并且在DMT-on的条件下合 成了20mer的DNA寡核苷酸的混合序列。合成之后，对多孔树脂珠粒 进行干燥，将其转入玻璃瓶中，与1ml 28％的氨水混合，然后使其在 55℃下进行反应15小时以进行DNA寡核苷酸的切出和碱基氨基的去 保护。通过过滤器过滤来分离多孔树脂珠粒，并且由滤液的UV吸光率 测定(260nm)来计算核酸的OD产率(相当于核酸合成量)。另外，由滤 液的HPLC(由沃特斯公司制造)测定来计算全长％(具有所需序列长度 的DNA寡核苷酸的比率)。结果示于表3中。
[表3]
从表2和表3中显而易见的是，发现与比较例相比，当使用本发 明的多孔树脂珠粒时，每树脂珠粒的DNA寡核苷酸合成量(OD产率) 变高并且合成纯度(全长％)也变高。
虽然已参考其具体实施方式详细描述了本发明，但是对于本领域 技术人员显而易见，在不脱离本发明主旨和范围的条件下，可对其中 进行各种变化和修改。
本申请基于2009年9月17日提交的日本专利申请 No.2009-216214，并且通过参考将其全部内容引入本文。本文引用的所 有文献以它们的整体引入到这里。
本发明提供了一种可用作核酸合成用固相合成载体的多孔树脂珠 粒。由于本发明的多孔树脂珠粒获得了高核酸合成量和合成纯度，所 以由于使用所述多孔树脂珠粒，与使用常规多孔树脂珠粒的情况相比， 能够更有效地进行核酸合成。