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1、(10)授权公告号 CN 101525576 B (45)授权公告日 2013.03.13 CN 101525576 B *CN101525576B* (21)申请号 200910131333.7 (22)申请日 2009.04.14 C12N 1/12(2006.01) C02F 9/14(2006.01) C02F 3/32(2006.01) C12R 1/89(2006.01) (73)专利权人 普罗米绿色能源(深圳)有限公司 地址 518000 广东省深圳市南山区科智西路 科技园工业区厂房 25 栋 2 段 3 层西 (72)发明人 李凝 弥永利 兰玉 张仕华 (74)专利代理机构 深。
2、圳市维邦知识产权事务所 44269 代理人 黄莉 CN 101280328 A,2008.10.08,1-8. 郑洪立， 等 . 产生物柴油微藻培养研究进 展 .中国生物工程杂志 .2009, 第 29 卷 ( 第 3 期),正文112页左栏第2段-114页左栏第2段. (54) 发明名称 利用生活污水和工业废水生产微藻的方法 (57) 摘要 本发明公开一种利用生活污水和工业废水生 产微藻的方法， 包括以下步骤 ： 初期培养步骤， 将 污水处理厂经过一级处理并过滤的生活污水加入 生物反应器， 并按照每升生活污水 200 毫克的比 例添加尿素， 然后， 在生物反应器中加入藻种， 在 光照、 通空。
3、气和二氧化碳的条件下搅拌培养， 直到 微藻细胞生长进入稳定期 ； 油脂诱导步骤， 在生 物反应器中按照1 200 1 1000 的体积比加 入来自蔗糖厂的蔗糖渣发酵后的工业废液， 诱导 微藻细胞内的油脂积累 ； 提取步骤， 在油脂积累 达到稳定后， 提取生物反应器中的微藻细胞。 本发 明可连续生产高油脂含量的微藻， 并显著降低微 藻的培养成本， 有利于微藻生物培养的产业化。 (51)Int.Cl. (56)对比文件 审查员 廖雅静 权利要求书 1 页 说明书 3 页 附图 5 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利 权利要求书 1 页 说明书 3 页 附图 5 页 1/1 。
4、页 2 1. 一种利用生活污水和工业废水生产微藻的方法， 其特征在于， 该方法包括以下步 骤 ： 初期培养步骤， 将污水处理厂经过一级处理并过滤的生活污水加入生物反应器， 并按 照每升生活污水200毫克的比例添加尿素， 所述过滤的具体操作包括 ： 以50m的尼龙过滤 膜过滤掉水中的大颗粒杂质后， 通过多级过滤装置除去水中的细菌类微生物， 然后， 在生物 反应器中加入小球藻菌， 在光照、 通空气和二氧化碳的培养条件下搅拌培养， 直到微藻细胞 生长进入稳定期， 所述的培养条件为 ： 温度 20-30、 pH 值 7.5-10， 二氧化碳通气量为每日 2 升、 平均光照时间为每日 9 小时、 光照强。
5、度范围为 100 1200 微爱因斯坦 / 平方米秒 ； 油脂诱导步骤， 在生物反应器中按照 1 200 1 1000 的体积比加入来自蔗糖厂 的蔗糖渣发酵后的工业废液， 诱导微藻细胞内的油脂积累， 本步骤中的培养条件为 ： 温度 20 -30， pH 值 7.5-10.0， 平均光照时间为每日 14 小时， 光照强度范围为 100 1200 微 爱因斯坦 / 平方米秒 ； 提取步骤， 在油脂积累达到稳定后， 提取生物反应器中的微藻细胞。 2. 如权利要求 1 所述的利用生活污水和工业废水生产微藻的方法， 其特征在于， 在所 述油脂诱导步骤之前还包括有 ： 脱水步骤， 将达到稳定生长期的微藻培。
6、养液通过脱水装置进行脱水。 3. 如权利要求 1 所述的利用生活污水和工业废水生产微藻的方法， 其特征在于， 在所 述油脂诱导步骤中， 加入的工业废水与生物反应器内藻培养液的体积比为 1 800。 权 利 要 求 书 CN 101525576 B 2 1/3 页 3 利用生活污水和工业废水生产微藻的方法 技术领域 0001 本发明涉及微藻培养技术， 尤其涉及一种利用生活污水和工业废水生产微藻的方 法。 背景技术 0002 随着世界原油的迅速消耗， 石油价格的不断增长， 生物柴油等可再生能源近年来 开始受到人们的关注。生物柴油 (Biodiesel) 是生物质能的一种， 它是指动植物或微生物 的。
7、油脂经过酯交换等技术得到的一种长链脂肪酸的单烷基酯。 生物柴油可再生、 降解， 不含 硫及芳香类化合物， 是一种对环境友好的能源， 因此受到世界各国的广泛关注。 0003 生物柴油早期主要来源于油料作物。现在随着石油消耗的迅速增长， 尽管餐饮废 油及动物脂肪已用于生物柴油的生产， 但这些来源远远不能满足人们的需要， 而且， 油料作 物还会大量的占用农业生产耕地， 以美国为例， 仅仅满足每年交通燃料需求的 50， 即使是 产油量最高的油棕， 就需要占用现有耕地的24。 为了避免与农业争地， 近年来各国对利用 油料作物生产生物柴油比较慎重。 0004 微藻可以利用二氧化碳和阳光， 外加营养元素进行。
8、光合作用， 生长繁殖。 同时通过 生物合成反应将碳元素转化成脂类物质储存在细胞中。同传统的油料作物相比， 微藻具有 很多优势 ： (1) 油产量高， 同样的单位生产面积微藻的原油产量高于最好的油料作物 ； (2) 培养液可循环利用， 节水 ； (3) 生活及工业废水培养液经过处理才释放， 对环境友好 ； (4) 微 藻可以生活在海水和污水中， 不会占用耕地， 不需要使用除草剂或杀虫剂， 同时微藻可以吸 收工业释放的二氧化碳， 除去引起河水湖水污染的氮和磷元素 ； (3) 生物质利用率高， 提脂 后剩余的生物质可发酵生产甲醇和乙醇， 或者作为饲料添加剂添加到牲畜饲料中。正因为 如此， 早在半个世。
9、纪前人们就开始了对这项技术的研究， 但是利用微藻生产生物柴油的方 法存在很多问题， 成本太高阻碍了该项技术的产业化。 0005 现阶段微藻的培养主要以光生物反应器内的异养为主。 在外加碳源、 矿物质、 光源 及通气的条件下， 微藻可在短时间内迅速生长， 但是该方法需要添加微藻生长所必须的各 种营养物质及微量元素， 成本极高， 并且受到光生物反应器体积的限制， 无法实现微藻的大 规模培养 ； 另外， 微藻会在氮饥饿的条件下大量积累油脂， 但是在微藻生长的过程中， 异养 培养液中丰富的氮源反而限制了油脂的积累。 发明内容 0006 本发明所要解决的技术问题是 ： 提供一种利用生活污水和工业废水生产。
10、微藻的方 法， 该方法可连续生产高油脂含量的微藻， 并显著降低微藻的培养成本， 有利于微藻生物培 养的产业化。 0007 为解决上述技术问题， 本发明采用如下技术方案 ： 0008 一种利用生活污水和工业废水生产微藻的方法， 包括以下步骤 ： 0009 初期培养步骤， 将污水处理厂经过一级处理并过滤的生活污水加入生物反应器， 说 明 书 CN 101525576 B 3 2/3 页 4 并按照每升生活污水200毫克的比例添加尿素， 所述过滤的具体操作包括 ： 以50m的尼龙 过滤膜过滤掉水中的大颗粒杂质后， 通过多级过滤装置除去水中的细菌类微生物， 然后， 在 生物反应器中加入小球藻菌， 在光。
11、照、 通空气和二氧化碳的培养条件下搅拌培养， 直到微藻 细胞生长进入稳定期， 所述的培养条件为 ： 温度 20-30、 pH 值 7.5-10， 二氧化碳通气量为 每日 2 升、 平均光照时间为每日 9 小时、 光照强度范围为 100 1200 微爱因斯坦 / 平方米 秒 ； 0010 油脂诱导步骤， 在生物反应器中按照 1 200 1 1000 的体积比加入来自蔗糖 厂的蔗糖渣发酵后的工业废液， 诱导微藻细胞内的油脂积累， 本步骤中的培养条件为 ： 温度 20 -30， pH 值 7.5-10.0， 平均光照时间为每日 14 小时， 光照强度范围为 100 1200 微 爱因斯坦 / 平方米。
12、秒 ； 0011 提取步骤， 在油脂积累达到稳定后， 提取生物反应器中的微藻细胞。 0012 本发明的有益效果是 ： 本发明的实施例通过利用生活污水和工业废水中含有的微 藻生长及油脂积累所必须的营养物质及微量元素对藻种进行培养及诱导油脂积累， 从而实 现了连续生产高油脂焊料的微藻， 同时亦对污水进行了生物处理， 并且污水可以循环利用， 极大地降低了微藻的培养成本， 有利于微藻生物培养的产业化。 0013 下面结合附图对本发明作进一步的详细描述。 附图说明 0014 图 1 是本发明提供的利用生活污水和工业废水生产微藻的方法一个实施例中初 期培养步骤中微藻细胞的生长曲线图。 0015 图 2 是。
13、本发明提供的利用生活污水和工业废水生产微藻的方法一个实施例中油 脂诱导步骤中微藻细胞中油脂含量变化图。 0016 图 3 是本发明提供的利用生活污水和工业废水生产微藻的方法一个实施例中以 生活污水培养与以生活污水和工业废水混合液培养的微藻油脂含量差异图。 0017 图 4 是本发明提供的利用生活污水和工业废水生产微藻的方法一个实施例中以 生活污水培养的微藻的油脂含量气质色谱图。 0018 图 5 是本发明提供的利用生活污水和工业废水生产微藻的方法一个实施例中以 生活污水和工业废水培养的微藻的油脂含量气质色谱图。 具体实施方式 0019 本发明的核心在于尽可能地利用生活污水中的营养元素， 最大限。
14、度地促进微藻生 物量和油脂的积累， 减少了藻类培养的成本， 同时降低了污水的各种生物指标， 使其更容易 达到排放标准， 变废为宝， 一举多得。 0020 下面详细描述本发明提供的利用生活污水和工业废水生产微藻的方法的一个实 施例。具体实现时， 本实施例培养一次微藻的流程主要包括以下步骤 ： 0021 初期培养步骤， 将经过一级处理并过滤的生活污水加入生物反应器后， 在生物反 应器中加入藻种， 在光照、 通空气和二氧化碳的条件下搅拌培养， 直到微藻细胞生长进入稳 定期， 具体实现时， 此步骤中可采取以下养条件 ： 温度 20-30、 pH 值 7.5-10， 二氧化碳通气 量为每日 2 升、 平。
15、均光照时间为每日 9 小时、 光照强度范围为 100 1200 微爱因斯坦 / 平 说 明 书 CN 101525576 B 4 3/3 页 5 方米秒 (E/m2/s) ； 0022 油脂诱导步骤， 在生物反应器中按照 1 200 1 1000 的体积比加入蔗糖渣发 酵后的工业废液， 诱导微藻细胞内的油脂积累， 具体实现时， 所加入的工业废水与生物反应 器内藻培养液的体积比为1800的情况下， 可达到最佳效果， 此步骤中可采取以下培养条 件 ： 温度 20 -30， pH 值 7.5-10.0， 平均光照时间为每日 14 小时， 光照强度范围为 100 1200 微爱因斯坦 / 平方米秒 (。
16、E/m2/s) ； 0023 提取步骤， 在油脂积累达到稳定后， 对微藻培养液进行过滤脱水， 提取生物反应器 中的微藻细胞， 并冷冻干燥。 0024 另外， 在初期培养步骤中， 可采用以下方法对生物污水进行过滤 ： 0025 以 50m 的尼龙过滤膜过滤掉水中的大颗粒杂质后， 通过多级过滤装置除去水中 的细菌类微生物。 0026 将生物污水加入生物反应器时， 还可以添加适量尿素， 尿素添加量优选为每升 200 毫克。 0027 在初期培养阶段， 可每天进行细胞计数及培养液 OD 值检测， 直至细胞生长进入稳 定期， 参考图 1， 经多次实验结果表明， 一般培养时间为 10 15 天。 0028。
17、 另外， 为了减少工业废水的加入量考虑， 在初期培养完成后， 还可以将达到稳定生 长期的微藻培养液通过脱水装置进行脱水， 以减小藻液体积。 0029 在油脂诱导阶段， 可每天取样尼罗红染色后进行荧光强度检测， 直至脂类积累量 达到平稳， 如图 2， 经多次实验结果表明， 一般诱导时间为 5 14 天。 0030 具 体 实 现 时， 本 实 施 例 采 用 的 藻 种 为 小 球 藻 ： Chlorella sorokiniana 和 Chlorella sp.IFRPD 1014。该藻种的确定是通过对从中国污染最严重的两个淡水湖 ： 云 南滇池和江苏太湖收集到的藻样进行混合培养、 高速离心分。
18、层之后， 将收集到的不同藻种， 涂抹在固体琼脂平板上， 并挑选单克隆微藻分开培养， 并选取生长最快的藻种， 对其进行 rDNA 分子鉴定， 最终确定的可达到最佳培养效果的两个藻种 ： Chlorella sorokiniana 和 Chlorella sp.IFRPD 1014。 0031 而本实施例采用的生活污水则来自污水处理厂， 为经过一级处理的生活污水 ； 蔗 糖渣发酵后的废水则来自蔗糖厂。 0032 参考图 3- 图 5， 对通过本实施例的方法得到的微藻生物质进行油脂提取， 分别对 以生活污水培养的微藻以及以生活污水和工业废水混合液培养的微藻为样本， 对提取到的 油脂进行 GC/MS 。
19、定量分析表明， 通过以生活污水和工业废水混合液培养得到的微藻中油脂 含量比以生活污水培养的微藻的油脂含量增加了 2 3 倍。 0033 本发明充分利用了生活污水和工业废水中所含有的藻类生长及油脂积累所必须 的营养物质及微量元素， 获得了高含油量微藻的同时对污水进行了生物处理， 而且微藻培 养液 ( 即生活和工业污水 ) 可以多次循环利用， 极大降低了微藻的培养成本。因此本发明 提供的方法是一种成本低， 转废为宝， 一举多得的方法， 有利于微藻生物柴油产业及环境污 水处理工程的扩大发展。 0034 以上所述是本发明的优选实施方式， 应当指出， 对于本技术领域的普通技术人员 来说， 在不脱离本发明原理的前提下， 还可以做出若干改进和润饰， 这些改进和润饰也视为 本发明的保护范围。 说 明 书 CN 101525576 B 5 1/5 页 6 图 1 说 明 书 附 图 CN 101525576 B 6 2/5 页 7 图 2 说 明 书 附 图 CN 101525576 B 7 3/5 页 8 图 3 说 明 书 附 图 CN 101525576 B 8 4/5 页 9 说 明 书 附 图 CN 101525576 B 9 5/5 页 10 说 明 书 附 图 CN 101525576 B 10 。