一种用于微生物肥料的芽孢杆菌液的同步发酵方法
技术领域
本发明涉及一种用于微生物肥料的芽孢杆菌液的同步发酵方法。
背景技术
肥料是重要的农业生产资料，微生物肥料的应用，不仅可以保证农产品的产量， 而且可以显著提高产品的品质、减少环境污染、培肥地力、改良土壤，防治土壤病虫 害，是农业可持续发展及生产绿色食品的新型肥料。目前已在我国大力推广，并展现 出美好的应用前景。为此，中华人民共和国农业部已制定颁发了“微生物肥料行业标 准NY-227-94”，等微生物肥料系列标准，并明确规定了作为肥料的有效微生物种类及 其质量标准。而其中有效微生物的活菌数量乃是产品的质量核心。
为了保证产品能够达到标准所要求的微生物数量，目前很多微生物肥料的生产都 选用了易于培养、生长快、菌体形成数量多的有效微生物进行生产。但是大多数微生 物极易受到环境的影响，而很快丧失生活能力，失去商品价值。现有的研究表明，一 类细菌，在特定条件下可以形成一种具有休眠特性的“芽孢”，它们可以耐受一定的高 温和干燥，存活时间长且性状稳定，此种有效的菌种更适宜作为微生物肥料进行生产。 这类细菌一般在固体培养基上容易形成“芽孢”，但在液体深层培养条件下，则较难形 成芽孢，只有在满足其特定条件后，才能形成或最大量形成。
目前，微生物肥料芽孢杆菌液的生产，大多采用微生物发酵的常规方法进行接种 培养，即在发酵培养基灭菌后，待降温至所需的培养温度(35～26℃)时，再将种子 液接入罐内按正常条件进行培养。由于种子液内除了部分为芽孢外，仍有一定数量的 营养体，因此，未经加热而一同接入罐内会造成生长起点不一，菌体生长快慢参差不 齐，几代同堂，给生产控制带来困难。即使延长生产周期6个小时，芽孢形成率也仅 80％左右。
发明内容
本发明的目的在于克服现有的微生物发酵方法接种的种子液易造成生长起点不 一，菌体生长快慢参差不齐，几代同堂，给生产控制带来困难，且芽孢形成率低的缺 陷，从而提供一种可在大规模的液体发酵条件下，使之同步形成芽孢，并能提高芽孢 形成的数量和比例，缩短生产周期的用于微生物肥料的芽孢杆菌液的同步发酵方法。
本发明的目的是通过如下的技术方案实现的：
本发明提供一种用于微生物肥料的芽孢杆菌液的同步发酵方法，包括如下步骤：
1)将芽孢杆菌的培养基液加入发酵罐内，于121～126℃、0.11～0.13MPa下灭菌 25～35分钟(优选30分钟)；然后降温至80～95℃，同时将罐内压力降至常压；
2)在火圈火焰灭菌的状态下，开启发酵罐罐体的接种盖，将纯种芽孢菌液作为种 子接入发酵罐内，并随即关闭接种盖，使发酵罐罐体呈密闭状态；
3)在罐温80～95℃(优选85～90℃)和常压条件下，将发酵罐内混合物搅拌10～ 20分钟，对芽孢杆菌种子进行高温处理；然后采用夹套循环水冷却，20分钟内降温至 26～35℃，按照常规发酵条件进行芽孢杆菌的发酵培养。
所述的芽孢杆菌包括巨大芽孢杆菌、苏云金芽孢杆菌、胶质芽孢杆菌、枯草芽孢 杆菌、地衣芽孢杆菌侧孢芽孢杆菌、解几丁质芽孢杆菌、固N芽孢杆菌等微生物肥料 生产用芽孢杆菌。
本发明的方法已经在巨大芽孢杆菌、苏云金芽孢杆菌、胶质芽孢杆菌、枯草芽孢 杆菌、地衣芽孢杆菌、侧孢芽孢杆菌、固N芽孢杆菌、解几丁质芽孢杆菌等有肥料功 能的芽孢杆菌的液体发酵生产中应用。可分别使成熟芽孢的同步形成率达到90～99％， 一般可缩短发酵周期6个小时左右。
本发明提供的发酵方法是在发酵罐生产过程中，将菌种的芽孢种子液，在种子罐 上直接进行高温接种和高温处理。与现有技术通常应用的适温接种相比较，其优点在 于：
1.本方法不仅有助于打破种子(有效菌芽孢)的休眠，促进芽孢的萌发，也可以 杀死非芽孢状态的菌体，如种子液中的营养体细胞。使接种的种子处在同一生理状态， 从同一起跑线出发，以便在适宜的条件下同步生长，同步增殖，同步形成新一代的芽 孢，提高了成熟芽孢形成的速率、比例和整齐度。避免因为种子本身的生理和发育阶 段的差异而引至发酵过程中的菌体生长快慢不一。因而有利于生产控制，对缩短生产 周期、降低生产成本、稳定和提高产品质量，效果显著。
2、通过高温接种可以杀死种子液中可能携带的噬菌体和其他非芽孢状态的杂菌， 有利于保证种子液的纯度。
3.采用高温接种，当打开接种罐盖接种时，罐内蒸汽外逸形成罐内正压，减少了 空气中杂菌进入罐内的可能性，降低了因接种操作带来污染的机率。
4.该方法简便易行，适用于目前微生物肥料生产中芽孢杆菌制品的生产。
具体实施方式
试验装置
本发明的实验是在带有搅拌器的外置换热夹套的发酵罐中进行的，还包括机械搅 拌、进气管、排气管、取样管、移种管、放料管、温度指示、罐压表、空气流量表、 投料口、接种口、外置换热夹套等装置。
测试方法
当正常发酵10小时后，每4小时，取样一次，进行发酵液中微生物的形态变化和 数量观察；具体方法按照《微生物肥料行业标准NY-227-94》的方法，进行取样、制 片和显微镜观察，以确定菌体的生长状态，统计芽孢形成的比例，直至发酵液中的芽 孢形成速率相对稳定时，结束培养。然后再按照规定的平板活菌计数法，对发酵液进 行稀释、塗皿培养，根据长出的菌落数(包括由芽孢萌发形成的菌落和尚未形成芽孢 的营养体形成的菌落)进行计算，而确定活菌总数；同时将稀释塗皿的稀释液，经80 ℃水浴中加热处理10分钟，进行塗皿、培养和菌落计数(芽孢形成的菌落数)，则可 取得发酵液中芽孢的数量，与前者检测的活菌总数之差，则为芽孢同步形成的比例。
实施例1
将巨大芽孢杆菌的培养基液(按重量百分比计，淀粉3％，豆饼粉1％，玉米浆0.1％， K2HPO4 0.5％，(NH4)2SO4 0.2％，CaCO3 0.5％，pH7.2-7.5)300公斤加入带有搅拌器的外置 换热夹套的发酵罐，升温至121℃、压力达0.11MPa，保温保压30分钟进行灭菌。然后 缓慢降温至90℃，同时将罐内压力降至常压，在发酵车间的正常工作状态下，在罐体 接种口周围，点燃火圈，在火焰的保护下打开发酵罐罐体的接种盖，迅速将纯种巨大 芽孢杆菌液种子加入发酵罐内，并随即关闭接种盖，使罐体呈密闭状态。打开搅拌， 在罐温90℃和常压条件下保持15分钟，进行巨大芽孢杆菌种子的高温处理。然后， 迅速将罐温降至30℃，按照该菌的发酵条件进行培养(培养温度30±1℃，罐压 0.05MPa，搅拌转速每分钟280转，通气量1∶1体积/体积/分)。用本试验规定的测试 方法测得芽孢同步形成率92％，总用时28小时。
对比例1
将巨大芽孢杆菌采用与实例1同样的培养基及灭菌方法，在发酵培养基灭菌后， 待降温至所需的培养温度30℃时，再将种子液接入罐内，不需要90℃高温处理，按照 相同发酵条件进行培养。用本试验规定的测试方法测得芽孢同步形成率75％，总用时 35小时。
实施例2
将地衣芽孢杆菌的培养基液(按重量百分比计，淀粉0.5％，K2HPO4 0.2％， (NH4)2SO4 0.1％，MgSo4 0.05％，酵母膏0.1％，CaCO3 0.1％，pH7.0-7.3)300公斤加入带 有搅拌器的外置换热夹套的发酵罐，升温至121℃、压力达0.11MPa，保温保压35分钟 进行灭菌。然后缓慢降温至90℃，同时将罐内压力降至常压，在发酵车间的正常工作 状态下，在罐体接种口周围，点燃火圈，在火焰的保护下打开发酵罐罐体的接种盖， 迅速将纯种地衣芽孢杆菌液种子加入发酵罐内，并随即关闭接种盖，使罐体呈密闭状 态。打开搅拌，在罐温85℃和常压条件下保持20分钟，进行地衣芽孢杆菌种子的高 温处理。然后，迅速将罐温降至32℃，按照该菌的发酵条件(培养温度32±1℃，罐 压0.06MPa，搅拌转速每分钟200转，通气量1∶0.5体积/体积/分)进行培养。用本 试验规定的测试方法测得芽孢同步形成率94％，总用时32小时。
对比例2
将地衣芽孢杆菌采用与实施例2相同的培养基和灭菌方法，当培养基灭菌后结束， 降温至32℃时，将种子液接入罐内，不经过85℃，20分钟的高温处理，按相同条件 进行培养。用本试验规定的测试方法测得芽孢同步形成率76％，总用时38小时。
实施例3
将侧孢芽孢杆菌的培养基液(按重量百分比计，蛋白胨0.5％，豆饼粉0.2％，酵母 粉0.2％，淀粉1％，蔗糖0.5％，K2HPO4 0.2％，MgSo4 0.05％，CaCO3 0.01％，pH7.0-7.5) 300公斤加入带有搅拌器的外置换热夹套的发酵罐，升温至121℃、压力达0.11MPa， 保温保压35分钟进行灭菌。然后缓慢降温至88℃，同时将罐内压力降至常压，在发 酵车间的正常工作状态下，在罐体接种口周围，点燃火圈，在火焰的保护下打开发酵 罐罐体的接种盖，迅速将纯种侧孢芽孢杆菌液种子加入发酵罐内，并随即关闭接种盖， 使罐体呈密闭状态。打开搅拌，在罐温88℃和常压条件下保持13分钟，进行侧孢芽 孢杆菌种子的高温处理。然后，迅速将罐温降至30℃，按照该菌的发酵条件(培养温 度30±1℃，罐压0.05MPa，搅拌转速每分钟180转，通气量1∶0.7体积/体积/分) 进行培养。用本试验规定的测试方法测得芽孢同步形成率92％，总用时28小时。
对比例3
将侧孢芽孢杆菌采用与实施例3完全相同的培养基及灭菌条件，在培养基灭菌后， 降温至所需的培养温度30℃时，再将种子液接入罐内按该菌的正常条件进行培养。用 本试验规定的测试方法测得芽孢同步形成率81％，总用时34小时。
实施例4
将枯草芽孢杆菌的培养基液(按重量百分比计，淀粉1.5％，玉米浆0.1％， K2HPO4 0.5％，(NH4)2SO4 0.1％，CaCO3 0.25％，pH7.3-7.5)300公斤加入带有搅拌器的外置 换热夹套的发酵罐，升温至121℃、压力达0.11MPa，保温保压30分钟进行灭菌。然后 降温至95℃，同时将罐内压力降至常压，在发酵车间的正常工作状态下，在罐体接种 口周围，点燃火圈，在火焰的保护下打开发酵罐罐体的接种盖，迅速将纯种枯草芽孢 杆菌液种子加入发酵罐内，并随即关闭接种盖，使罐体呈密闭状态。打开搅拌，在罐 温95℃和常压条件下保持10分钟，进行枯草芽孢杆菌种子的高温处理。然后，迅速 将罐温降至35℃，按照该菌的酵条件(罐温35℃，罐压0.05MPa，转速每分钟160转， 通气量1∶0.8体积/体积/分)进行培养。用本试验规定的测试方法测得芽孢同步形成 率90％，总用时30小时。
对比例4
将枯草芽孢杆菌采用与实施例4相同的培养基和灭菌条件，在培养基灭菌后，待 降温至35℃时，再将种子液接入罐内按相同条件进行培养。用本试验规定的测试方法 测得芽孢同步形成率72％，总用时36小时。
实施例5
将胶质芽孢杆菌的培养基液(按重量百分比计，葡萄糖0.7％，酵母粉0.5％，花生 饼粉0.2％，(NH4)2SO4 0.2％，MgSO4 0.1％，pH7.5-7.8)300公斤加入带有搅拌器的外置换 热夹套的发酵罐，升温至121℃、压力达0.11MPa，保温保压30分钟进行灭菌。然后缓 慢降温至88℃，同时将罐内压力降至常压，在发酵车间的正常工作状态下，在罐体接 种口周围，点燃火圈，在火焰的保护下打开发酵罐罐体的接种盖，迅速将纯种胶质芽 孢杆菌液种子加入发酵罐内，并随即关闭接种盖，使罐体呈密闭状态。打开搅拌，在 罐温80℃和常压条件下保持15分钟，进行胶质芽孢杆菌种子的高温处理。然后，迅 速将罐温降至28℃，按照常规发酵条件进行培养。用本试验规定的测试方法测得芽孢 同步形成率99％，总用时32小时。
对比例5
将胶质芽孢杆菌采与实施例5相同的培养基及灭菌条件，在发酵培养基灭菌后， 降温至28℃时，再将种子液接入罐内按相同条件进行培养。用本试验规定的测试方法 测得芽孢同步形成率72％，总用时36小时。
附表使用本发明的方法和常规方法进行芽孢杆菌的发酵培养的比较
试验 编号 芽孢同步形成率(％) 总用时(小时) 正常发酵的染菌率(％) 实 施 例 1 92 28 0 2 94 32 0 3 95 28 0 4 90 30 0 5 99 32 0 对 比 例 1 75 35 3 2 76 38 2 3 81 34 1 4 72 36 0 5 80 38 0
由上表的数据可以看出，使用本发明的方法与常规方法进行芽孢杆菌的发酵相 比，(1)本发明的在发酵罐上直接高温接种处理方法简便易行；(2)通过高温处理， 可以促进种子液中的芽孢萌发，杀死未形成芽孢的营养体，使接种的种子处在同一生 理状态，从同一起跑线出发，同步生长、增殖，提高芽孢的同步形成率14-19％；同时 缩短发酵周期6个小时左右；降低了生产成本，提高和稳定了产品质量。(3)通过高 温处理，还可以直接杀死混入种子液中的其它杂菌的营养体细胞，及可能掺带的噬菌 体，降低了因为种子液纯度不够或接种操作而带来的染菌机率，提高了生产的成功率， 保证了生产的稳定性。