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1、(10)授权公告号 CN 102321153 B (45)授权公告日 2013.06.05 CN 102321153 B *CN102321153B* (21)申请号 201110261822.1 (22)申请日 2011.09.06 C07K 5/083(2006.01) C07K 1/16(2006.01) (73)专利权人 中国科学院成都生物研究所 地址 610041 四川省成都市武侯区人民南路 四段九号 (72)发明人 周金燕 谭红 杨杰 钟娟 肖亮 (74)专利代理机构 成都赛恩斯知识产权代理事 务所 ( 普通合伙 ) 51212 代理人 肖国华 CN 1312813 A,2001.。
2、09.12, 说明书第 34 页 第 2 段 . 汪宇等 . 人工培养蛹虫草子座中核苷类化合 物的提取工艺研究 .中国药师 .2004, 第 7 卷 ( 第 12 期 ), 第 930 页第 1 栏最后 1 段 . 宁停波等 . 新奥霉素发酵液的理化性质和提 取方法研究 . 湖南农业科学 .2011,( 第 13 期 ), 第 23 页第 1 栏第 2 段， 第 23 页第 2 栏第 1-2 段， 第 24 页第 1 栏第 2、 7 段 . 周金燕等 . 葡萄灰孢霉代谢产物的分离及生 物活性 .应用与环境生物学报 .2002, 第 8 卷 ( 第 5 期 ), 第 532-534 页 . 邓洪。
3、渊等 . 生物农药的研究和应用进展 . 世 界科技研究与发展 .2005, 第 27 卷 ( 第 1 期 ), 第 76-80 页 . 冯振群， 卢清 . 新型生物杀菌剂新奥霉素 防治烟草花叶病毒病的田间药效 .现代农 药 .2011, 第 10 卷 ( 第 4 期 ), 第 50-52 页 . (54) 发明名称 一种新奥苷肽粉状固体的制备方法 (57) 摘要 本发明属于生物化工技术领域， 具体涉及一 种新奥苷肽的提取方法， 特别是一种从发酵液中 分离提取新奥苷肽的方法。一种新奥苷肽粉状固 体的制备方法， 包括以下步骤 ：（1） 粗膏制备 ： 发 酵液先加热升温灭菌， 再加入助滤剂和絮凝剂，。
4、 过 滤， 浓缩得粗膏 ；（2） 纯化精制 ： 所得粗膏与柱层 析硅胶混合， 真空干燥， 磨碎， 过筛， 硅胶柱层析， 减压蒸馏回收洗脱溶剂， 浓缩干燥得到新奥苷肽 粉状产品。 本发明具有使用有机溶剂耗用少， 获得 的新奥苷肽产品纯度高， 易于工业化等优点。 (51)Int.Cl. (56)对比文件 审查员 许慧娜 权利要求书 1 页 说明书 3 页 附图 1 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利 权利要求书1页 说明书3页 附图1页 (10)授权公告号 CN 102321153 B CN 102321153 B *CN102321153B* 1/1 页 2 1. 一种新。
5、奥苷肽粉状固体的制备方法， 其特征是 ： 包括以下步骤 ： （1） 粗膏制备 ： 发酵液先加热升温至 60 , 保持 10-60 分钟， 然后将发酵液温度降至 30以下 ； 加入珍珠岩或硅藻土， 充分搅拌， 放置 10-30 分钟， 再加入明矾， 充分搅拌， 用型 号为 600-2000 目的滤布进行过滤， 滤液在真空度 -0.08MPa 至 -0.09MPa， 水浴温度 60 70或 50 55条件下浓缩得粗膏， 所述的发酵液由产生新奥苷肽的放线菌发酵产生， 加 入的珍珠岩或硅藻土的质量克占发酵液的体积毫升的百分比为 0.1%-3.0% ； 加入的明矾的 质量克占发酵液的体积毫升的百分比为 。
6、0.01%-0.1% ； （2）纯化精制 ： 所得粗膏与 100 200 目的柱层析硅胶混合， 其比例为粗膏 : 硅胶 =1:12.5， 搅拌均匀， 在40条件下真空干燥， 磨碎， 过100目筛， 用G100200的硅胶填 柱， 其质量是上柱搅拌物料的 5 10 倍， 进行硅胶柱层析， 采用氯仿 : 甲醇 =80 20:20 80 二元洗脱剂进行梯度洗脱， 下柱液以薄层层析分析结果分段采集， 减压下蒸馏回收洗脱 溶剂， 浓缩物经干燥得到新奥苷肽粉状产品。 权 利 要 求 书 CN 102321153 B 2 1/3 页 3 一种新奥苷肽粉状固体的制备方法 0001 所属领域 0002 本发明属。
7、于生物化工技术领域， 具体涉及一种新奥苷肽的提取方法， 特别是一种 从发酵液中分离提取新奥苷肽的方法。 背景技术 0003 近年来， 我国研究开发了一系列的核苷类农用抗生素。 如， 具有胞苷骨架的核苷类 抗生素武夷霉素， 嘧肽霉素， 多抗菌素 (polyoxin)， 含有胞嘧啶核苷肽类结构的宁南霉素、 云南霉素及庆丰霉素等。以上核苷类农用抗生素均为通过微生物发酵产生， 而微生物菌株 发酵产生的核苷类活性物质的量往往很低， 加之在发酵液中还有与核苷类活性物质共存的 其它大量杂质和副产物， 如有微生物细胞、 蛋白质、 色素、 其它细胞代谢产物及末用完的培 养基等， 从发酵液中提取分离核苷类活性物质。
8、也是一个比较复杂的过程。 目前， 源自微生物 发酵产生的核苷类农用抗生素的提取主要有两种提取方法， 一种是离子交换方法， 包括发 酵液的酸化， 固液分离， 离子交换层析， 浓缩等 ； 另一种方法是膜提取方法， 通过采用微滤膜 微滤， 再超滤， 纳滤和喷雾干燥等。 0004 本实验室在进行抗生素的研究过程中， 发现一株放线菌经发酵能产生具有广谱抗 菌生物活性的嘧啶核苷肽类物质， 尤其对革兰氏阳性菌、 植物病毒的抑制活性很强， 如有 很强的抗植物病毒病如烟草、 辣椒、 番茄花叶病毒病等的活性。发明者命名该放线菌产生 的嘧啶核苷肽类抗菌物质为新奥甘肽 ( 或新奥霉素 )， 主要成分是一种新的尿嘧啶核。
9、苷肽 (1- 尿嘧啶 -4 肌氨酰 - 丝氨酰氨基 -1， 4- 二脱氧 -D- 吡喃葡萄糖醛酸 )( 专利申请号 ： 200910060121.4)， 化学结构为 ： 0005 0006 目前已公开的新奥苷肽提取技术内容 ( 专利申请号 ： 200910060121.4) 主要涉及 微量新奥苷肽样品 (mg 级 ) 的制备技术， 包括新奥苷肽发酵结束后， 通过添加 2-4 倍发酵液 体积的甲醇或乙醇， 从上述发酵培养液中收集新奥苷肽， 再通过正相硅胶层析和反相硅胶 层析分离， 得到的新奥苷肽样品， 用高效液相色谱进一步分离纯化， 制备得到微量的新奥苷 肽。 该提取技术方法步骤繁琐， 耗用大量。
10、的有机溶剂， 提取周期长， 活性损失大， 不适合大量 新奥苷肽的制备。 如果通过传统的离子交换方法提取新奥苷肽， 得到的是膏状的产品 ； 而用 说 明 书 CN 102321153 B 3 2/3 页 4 膜技术提取， 一次性设备投资非常大。 发明内容 0007 为了解决以上问题， 本发明提供一种从发酵液中分离提取新奥苷肽的新方法， 实 现高纯度新奥苷肽粉状固体的大量制备。 本发明包含以下步骤 ： 发酵液， 灭菌， 预处理， 减压 浓缩， 柱层析， 减压浓缩， 干燥， 新奥苷肽粉状产品。 0008 上述步骤中的发酵液是由能产生新奥苷肽的放线菌或其遗传改良菌株， 通过在一 级液体培养基中培养， 。
11、作为种子液 ； 将在上述第一级液体培养基中培养好的种子液接种到 适合放线菌或其遗传改良菌株生长和产生新奥苷肽的培养基中培养， 在 26 -37发酵培 养 2-5 天， 发酵结束后， 收集发酵液 ； 0009 上述步骤中的发酵液先加热升温至 60， 保持 10-60 分钟， 杀灭发酵液中的放线 菌或其遗传改良菌株活菌体， 然后将发酵液温度降至 30以下 ； 0010 上述步骤中的预处理操作是加 0.1 -3.0 ( 克 / 毫升 ) 的助滤剂到灭菌发酵液 中， 充分搅拌， 放置 10-30 分钟， 加入 0.01 -0.1 ( 克 / 毫升 ) 的絮凝剂， 充分搅拌， 用型 号为 600-200。
12、0 目的滤布进行过滤， 除去菌体、 细胞碎片及其它蛋白质等固形物。 0011 所述的助滤剂可以为 ： 活性碳、 珍珠岩、 高岭土或硅藻土 ； 0012 所述的絮凝剂可以为 ： 明矾、 聚氯化铝或三价铁的盐类 ； 0013 上述步骤中预处理的发酵液， 经过滤后， 在真空度 -0.08MPa 至 -0.09Mpa， 水浴温 度 60 70或 50 55； 所得粗膏与柱层析硅胶 (100 200 目 ) 混合， 其比例为粗膏 硅胶 1 1 2.5， 搅拌均匀， 在 40条件下真空干燥， 磨碎， 过 100 目筛。用 G100 200 的硅胶填柱， 其质量是上柱搅拌物料的 5 10 倍， 进行硅胶柱层。
13、析， 采用氯仿甲醇 80 20 20 80 二元洗脱剂进行梯度洗脱， 下柱液以薄层层析分析结果分段采集， 减压 下蒸馏回收洗脱溶剂， 浓缩物经干燥得到新奥苷肽粉状产品。 0014 本发明将专利 200910060121.4 公开的新奥苷肽的提取方法中的硅胶层析三元洗 脱体系改变为二元洗脱体系， 并去掉了反相硅胶层析分离和高效液相色谱纯化步骤， 具有 使用有机溶剂耗用少， 获得的新奥苷肽产品纯度高， 易于工业化等优点。 附图说明 0015 新奥苷肽粉状产品生产的工艺流程图。 具体实施方式 0016 以下结合实施例对本发明作进一步详细描述。 0017 实施例 1 0018 取 2L 新奥苷肽发酵液。
14、 ( 效价 10000 单位 )， 发酵液先加热升温至 60， 保持 30 分钟， 杀灭发酵液中的放线菌或其遗传改良菌株活菌体， 然后将发酵液温度降至 30以下， 加入 2.0 ( 克 / 毫升 ) 硅藻土助滤剂到灭菌后的发酵液中， 搅拌均匀， 放置 20 分钟， 加入 0.05 ( 克 / 毫升 ) 的明矾， 充分搅拌， 用 600 目滤布过滤， 滤液在减压条件下浓缩， 真空度 控制在-0.08MPa， 温度控制在60； 所得粗膏与柱层析硅胶(100200目)混合， 其比例为 粗膏硅胶11.5， 搅拌均匀， 在40下真空干燥， 磨碎， 过100目筛。 用G100200的 说 明 书 CN 1。
15、02321153 B 4 3/3 页 5 硅胶填柱， 其质量是上柱物料的 8 倍， 进行硅胶柱层析， 采用氯仿甲醇 80 20 20 80 二元洗脱剂进行梯度洗脱， 下柱液以薄层层析分析结果分段采集， 减压下蒸馏回收洗脱 溶剂， 浓缩物经干燥得到新奥苷肽粉状产品， 高压液相色谱分析产品纯度 90.4。 0019 实施例 2 0020 取 2L 新奥苷肽发酵液 ( 效价 10000 单位 )， 发酵液先加热升温至 60， 保持 30 分钟， 杀灭发酵液中的放线菌或其遗传改良菌株活菌体， 然后将发酵液温度降至 30以下， 加入 2.0 ( 克 / 毫升 ) 硅藻土助滤剂到灭菌后的发酵液中， 搅拌均。
16、匀， 放置 20 分钟， 加 入 0.05 ( 克 / 毫升 ) 的明矾， 充分搅拌， 用 600 目滤布过滤， 滤液在减压条件下浓缩， 真 空度控制在 -0.085MPa 左右， 温度控制在 60； 所得粗膏与柱层析硅胶 (100 200 目 ) 混 合， 其比例为粗膏硅胶 1 1.5， 搅拌均匀， 在 40下真空干燥， 磨碎， 过 100 目筛。用 G100 200 的硅胶填柱， 其质量是上柱物料的 8 倍， 进行硅胶柱层析， 采用氯仿甲醇 80 20 20 80 二元洗脱剂进行梯度洗脱， 下柱液以薄层层析分析结果分段采集， 新 奥苷肽洗脱部分减压下蒸馏回收洗脱溶剂， 得到浓缩物 ； 该浓。
17、缩物再进行二次硅胶层析， 洗 脱剂采用一次硅胶获得该组分的氯仿与甲醇相同比例非梯度洗脱， 减压下蒸馏回收洗脱溶 剂， 浓缩物经干燥得到新奥苷肽粉状产品， 高压液相色谱分析产品纯度 94.2。 0021 实施例 3 0022 取 2L 新奥苷肽发酵液 ( 效价 10000 单位 )， 发酵液先加热升温至 60， 保持 30 分钟， 杀灭发酵液中的放线菌或其遗传改良菌株活菌体， 然后将发酵液温度降至 30以下， 加入 2.0 ( 克 / 毫升 ) 珍珠岩助滤剂到灭菌后的发酵液中， 搅拌均匀， 放置 20 分钟， 加 入 0.05 ( 克 / 毫升 ) 的明矾， 充分搅拌， 用 600 目滤布过滤，。
18、 滤液在减压条件下浓缩， 真 空度控制在 -0.09MPa 左右， 温度控制在 55 ； 所得粗膏与柱层析硅胶 (100 200 目 ) 混 合， 其比例为粗膏硅胶 1 1.5， 搅拌均匀， 在 40下真空干燥， 磨碎， 过 100 目筛。用 G100 200 的硅胶填柱， 其质量是上柱物料的 8 倍， 进行硅胶柱层析， 采用氯仿甲醇 80 20 20 80 二元洗脱剂进行梯度洗脱， 下柱液以薄层层析分析结果分段采集， 减压 下蒸馏回收洗脱溶剂， 浓缩物经干燥得到新奥苷肽粉状产品， 高压液相色谱分析产品纯度 91.1。 0023 实施例 4 0024 取 2L 新奥苷肽发酵液 ( 效价 100。
19、00 单位 )， 发酵液先加热升温至 60， 保持 30 分钟， 杀灭发酵液中的放线菌或其遗传改良菌株活菌体， 然后将发酵液温度降至 30以下， 加入 2.0 ( 克 / 毫升 ) 珍珠岩助滤剂到灭菌后的发酵液中， 搅拌均匀， 放置 20 分钟， 加 入 0.05 ( 克 / 毫升 ) 的明矾， 充分搅拌， 用 600 目滤布过滤， 滤液在减压条件下浓缩， 真 空度控制在 -0.09MPa 左右， 温度控制在 55 ； 所得粗膏与柱层析硅胶 (100 200 目 ) 混 合， 其比例为粗膏硅胶 1 1.5， 搅拌均匀， 在 40下真空干燥， 磨碎， 过 100 目筛。用 G100 200 的硅胶填柱， 其质量是上柱物料的 8 倍， 进行硅胶柱层析， 采用氯仿甲醇 80 20 20 80 二元洗脱剂进行梯度洗脱， 下柱液以薄层层析分析结果分段采集， 新 奥苷肽洗脱部分减压下蒸馏回收洗脱溶剂， 得到浓缩物 ； 该浓缩物再进行二次硅胶层析， 洗 脱剂采用一次硅胶获得该组分的氯仿与甲醇相同比例非梯度洗脱， 减压下蒸馏回收洗脱溶 剂， 浓缩物经干燥得到新奥苷肽粉状产品， 高压液相色谱分析产品纯度 94.8。 说 明 书 CN 102321153 B 5 1/1 页 6 说 明 书 附 图 CN 102321153 B 6 。