可在低温、好氧条件下去除微污染水源水中氨氮的细菌.pdf

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1、(10)授权公告号 CN 101570736 B (45)授权公告日 2011.03.23 CN 101570736 B *CN101570736B* (21)申请号 200910071569.6 (22)申请日 2009.03.18 CGMCC No.2890 2009.01.19 C12N 1/20(2006.01) C02F 3/34(2006.01) C02F 3/02(2006.01) C12R 1/01(2006.01) (73)专利权人 哈尔滨工业大学 地址 150001 黑龙江省哈尔滨市南岗区西大 直街 92 号 (72)发明人 李伟光 张多英 郜玉楠 王广智 解丰波 (74)。

2、专利代理机构 哈尔滨市松花江专利商标事 务所 23109 代理人 金永焕 (54) 发明名称 可在低温、 好氧条件下去除微污染水源水中 氨氮的细菌 (57) 摘要 可在低温、 好氧条件下去除微污染水源水中 氨氮的细菌， 它涉及细菌。 它解决了现有细菌不适 用于处理微污染水源水和低温处理的问题。本发 明细菌 SRA13 为 Brevibacterium mcbrellneri， 属于短杆菌属， 已在中国微生物菌种保藏管理 委员会普通微生物中心保藏， 保藏编号为 CGMCC No.2890， 保藏日期为 2009 年 1 月 19 日。筛选方 法 ： 一、 分离纯化 ； 二、 制菌液 ； 三、 菌。

3、液筛选培养 ； 四、 取存活菌株的菌液筛选培养 ； 五、 重复步骤四 后取存活菌株进行逐步低温驯化 ； 六、 取低温驯 化后存活菌株的菌液， 复筛后即得。 本发明细菌能 在 2 10的低温条件下处理微污染水源水。 (83)生物保藏信息 (51)Int.Cl. 审查员 刘树柏 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利 权利要求书 1 页 说明书 4 页 附图 1 页 CN 101570736 B1/1 页 2 1. 可在低温、 好氧条件下去除微污染水源水中氨氮的细菌， 其特征在于低温、 好氧 条件下去除微污染水源水中氨氮的细菌 SRA13 为迈克布瑞德短杆菌 (Brevibacte。

4、rium mcbrellneri)， 属于短杆菌属， 已在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏， 保藏编号为 CGMCC No.2890， 保藏日期为 2009 年 1 月 19 日 ； 该菌为革兰氏阴性好氧菌， 为 短杆状， 长为 0.4m 0.9m， 宽为 0.7m 1.0m， 常成对或成簇存在， 无芽孢和鞭毛， 进行抽搐运动 ； 在牛肉膏蛋白胨培养基上形成黄色菌落， 菌落圆形， 菌落表面隆起， 光滑。 权 利 要 求 书 CN 101570736 B1/4 页 3 可在低温、 好氧条件下去除微污染水源水中氨氮的细菌 技术领域 0001 本发明涉及细菌。 0002 背景技术 00。

5、03 氨氮 (NH3-N) 以离子态氨 (NH4+) 和非离子态氨 (NH3) 两种形式存在于水中。饮用 水中氯化了的氨超过 0.2mg/L 会引起嗅味的问题， 还会降低消毒效果， 氨在水管中， 经亚硝 化菌作用， 生成亚硝酸盐， 对人体健康带来危害。 0004 随着对异养硝化 - 好氧反硝化方面的研究逐步深入， 并分离出大量的异养型硝化 菌， 如 Peseudomonas spp、 Alcaligenes faecalis、 Thiosphaera pantotropha、 Thauera mechemichensis 等。但以上菌株处理过程中会发生出水中亚硝酸盐和硝酸盐积累现象， 对人体有。

6、危害， 且会产生 N2O， 对环境造成二次污染。名称为 “脱氮不动杆菌及其降解废水 中氨氮的方法 ( 中国专利号 ： ZL200410019474.7， 申请日 ： 2004 年 06 月 04 日， 授权公告 日 ： 2006 年 07 月 26 日 )” 的专利中公开了一株脱氮不动杆菌 (Acinetobacter sp)YY-5， CGMCCNo.1154， 降解废水中氨氮的方法， 可在好氧条件下将废水中的氨氮直接氧化成氮气， 但是该菌株应用时进水氨氮浓度均较高， 最低时进水氨氮浓度也在 50mg/L 以上， 不适用于 处理氨氮浓度在5mg/L以下的微污染水源水， 而且在降解氨氮时， 控。

7、制温度为1540， 不 适用于低温处理， 如黑龙江省， 年平均气温最高只有 4.9， 而松花江每年有 6 个月以上的 时间， 水温处于 10以下， 因此在北方地区冬季时期应用上述菌种是难以达到处理要求的。 中国环境科学 ， 2003 ； 23(6) ： 644647在研究低温下生物陶粒反应器去除水源水中氨氮 时虽然在低温条件下有较好的氨氮去除效果， 但却导致了亚硝酸盐的大量积累， 对人体健 康带来危害。 0005 发明内容 0006 本发明的目的是为了解决现有细菌在去除水中氨氮时存在出水中亚硝酸盐和硝 酸盐积累现象、 产生 N2O 对环境造成二次污染以及不适用于处理微污 染水源水和低温处理 的。

8、问题， 而提供可在低温、 好氧条件下去除微污染水源水中氨氮的细菌。 0007 可在低温、 好氧条件下去除微污染水源水中氨氮的细菌 SRA13 为 Brevibacterium mcbrellneri( 迈克布瑞德短杆菌 )， 属于短杆菌属 (mcbrellneri)， 已在中国微生物菌种保 藏管理委员会普通微生物中心保藏， 保藏编号为 CGMCC No.2890， 保藏日期为 2009 年 1 月 19 日 ； 低温、 好氧条件下去除微污染水源水中氨氮的细菌为革兰氏阴性好氧菌， 为短杆状， 长为 0.4m 0.9m， 宽为 0.7m 1.0m， 常成对或成簇存在， 无芽孢和鞭毛， 进行抽 搐运。

9、动 ； 在牛肉膏蛋白胨培养基上形成黄色菌落， 菌落圆形， 菌落表面隆起， 光滑。 0008 可在低温、 好氧条件下去除微污染水源水中氨氮细菌的筛选驯化方法按以下步骤 实现 ： 一、 将微污染水源水在温度 28 32、 150 170r/min 的好氧条件下富集培养 48h 后得富集液， 富集液梯度稀释后涂布于 LB 固体培养基上， 在 28 32的条件下分离培养 48h， 然后挑取特征不同的单菌落， 分别接种于 LB 固体培养基上纯化培养 24h ； 二、 将纯化后 的菌株接种于 LB 液体培养基中， 在 28 32的条件下培养 24h 后， 得菌液 ； 三、 取 1ml 菌 液接种于筛选培养。

10、基中， 在2832的条件下培养48h ； 四、 取存活菌株的菌液1ml转接于 说 明 书 CN 101570736 B2/4 页 4 新鲜的筛选培养基中， 在 28 32的条件下培养 48h ； 五、 重复步骤四 1 2 次后取存活菌 株接种于筛选培养基中进行逐步低温驯化， 逐步低温驯化是在 20的条件下培养 48h， 驯 化 3 代后取存活菌株的菌液 1ml 接种于筛选培养基中在 15的条件下培养 48h， 驯化 3 代 后再取存活菌株的菌液 1ml 接种于筛选培养基中在 8的条件下培养 48h， 驯化 3 代后再取 存活菌株的菌液 1ml 接种于筛选培养基中在 6的条件下培养 48h， 驯。

11、化 3 代后再取存活菌 株的菌液 1ml 接种于筛选培养基中在 2的条件下培养 48h， 驯化 3 代 ； 六、 取 5ml 2下低 温驯化后存活菌株的菌液， 在 12000r/min 转速下离心 5min， 取沉淀物并加入 1ml 无菌水制 成悬浮液， 然后加入含 5g 活性炭的 50ml 蒸馏水， 在 2下固定 48h 后将固定有细菌的活性 炭取出， 再将固定有细菌的活性炭接种于含 5mg/L 氨氮的无菌水中， 在 2、 140r/min 的条 件下振荡 8h， 然后取具有氨氮降解能力且不产生硝酸盐和亚硝酸盐的菌株， 即为可在低温、 好氧条件下去除微污染水源水中氨氮的细菌 ； 其中步骤三中。

12、筛选培养基每 1000mL 由 1.9g 的 Na2HPO4、 2.0g 的 KH2PO4、 0.01g 的 MgSO47H2O、 0.005g 的 CaCl22H2O、 5.0g 的 NH4Cl 和 余量的水组成， pH 值为 6.0 8.0， 所述余量的水为微污染水源水。 0009 本发明中低温、 好氧条件下去除微污染水源水中氨氮的细菌， 接触酶阳性、 氧化酶 阴性、 甲基红试验阴性、 不产生乙酰甲基甲醇、 不产生 H2S、 不水解淀粉、 不液化明胶、 产生吲 哚、 生长 pH 值为 6 8， 生长温度为 2 30。 0010 本发明中筛选驯化所得低温、 好氧条件下去除微污染水源水中氨氮的。

13、细菌能在 2 10的低温条件下处理微污染水源水， 氨氮降解率达 90以上， 且无硝酸盐和亚硝酸 盐积累， 不产生 N2O。 0011 本发明中可在低温、 好氧条件下去除微污染水源水中氨氮的细菌 SRA13 为 Brevibacterium mcbrellneri( 迈克布瑞德短杆菌 )， 属于短杆菌属 (mcbrellneri)， 已在 中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏， 保藏编号为 CGMCC No.2890， 保藏日 期为 2009 年 1 月 19 日。 附图说明 0012 图 1 为具体实施方式六中低温、 好氧条件下去除微污染水源水中氨氮细菌的原子 力显微镜观察图。 具体。

14、实施方式 0013 具体实施方式一 ： 本实施方式可在低温、 好氧条件下去除微污染水源水中氨氮的 细菌SRA13为Brevibacterium mcbrellneri， 属于短杆菌属(mcbrellneri)， 已在中国微生 物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏， 保藏编号为CGMCC No.2890， 保藏日期为2009 年1月19日 ； 低温、 好氧条件下去除微污染水源水中氨氮的细菌为革兰氏阴性好氧菌， 为短 杆状， 长为 0.4m 0.9m， 宽为 0.7m 1.0m， 常成对或成簇存在， 无芽孢和鞭毛， 进 行抽搐运动 ； 在牛肉膏蛋白胨培养基上形成黄色菌落， 菌落圆形， 菌落表面隆。

15、起， 光滑。 0014 本实施方式中可在低温、 好氧条件下去除微污染水源水中氨氮的细菌是根据 伯 杰细菌鉴定手册 初步判定为不动杆菌属， 然后经过 SHERLOCK 微生物系统鉴定为迈克布瑞 德短杆菌 Brevibacterium mcbrellneri。 0015 具体实施方式二 ： 本实施方式与具体实施方式二不同的是可在低温、 好氧条件下 说 明 书 CN 101570736 B3/4 页 5 去除微污染水源水中氨氮的细菌， 接触酶阳性， 氧化酶阴性 ； 甲基红试验阴性， 不产生乙酰 甲基甲醇 ； 不产生 H2S， 不水解淀粉， 不液化明胶 ； 产生 吲哚 ； 生长 pH 值为 6 8， 。

16、生长温度 为 2 30。其它与具体实施方式二相同。 0016 具体实施方式三 ： 本实施方式可在低温、 好氧条件下去除微污染水源水中氨氮细 菌的筛选驯化方法按以下步骤实现 ： 一、 将微污染水源水在温度 28 32、 150 170r/ min的好氧条件下富集培养48h后得富集液， 富集液梯度稀释后涂布于LB固体培养基上， 在 28 32的条件下分离培养 48h， 然后挑取特征不同的单菌落， 分别接种于 LB 固体培养基 上纯化培养 24h ； 二、 将纯化后的菌株接种于 LB 液体培养基中， 在 28 32的条件下培养 24h 后， 得菌液 ； 三、 取 1ml 菌液接种于筛选培养基中， 在。

17、 28 32的条件下培养 48h ； 四、 取存活菌株的菌液1ml转接于新鲜的筛选培养基中， 在2832的条件下培养48h ； 五、 重 复步骤四 1 2 次后取存活菌株接种于筛选培养基中进行逐步低温驯化， 逐步低温驯化是 在 20的条件下培养 48h， 驯化 3 代后取存活菌株的菌液 1ml 接种于筛选培养基中在 15 的条件下培养 48h， 驯化 3 代后再取存活菌株的菌液 1ml 接种于筛选培养基中在 8的条件 下培养 48h， 驯化 3 代后再取存活菌株的菌液 1ml 接种于筛选培养基中在 6的条件下培养 48h， 驯化 3 代后再取存活菌株的菌液 1ml 接种于筛选培养基中在 2的条。

18、件下培养 48h， 驯化 3 代 ； 六、 取 5ml 2下低温驯化后存活菌株的菌液， 在 12000r/min 转速下离心 5min， 取沉淀物并加入 1ml 无菌水制成悬浮液， 然后加入含 5g 活性炭的 50ml 蒸馏水， 在 2下固 定 48h 后将固定有细菌的活性炭取出， 再将固定有细菌的活性炭接种于含 5mg/L 氨氮的无 菌水中， 在 2、 140r/min 的条件下振荡 8h， 然后取具有氨氮降解能力且不产生硝酸盐和亚 硝酸盐的菌株， 即为可在低温、 好氧条件下去除微污染水源水中氨氮的细菌 ； 其中步骤三中 筛选培养基每 1000mL 由 1.9g 的 Na2HPO4、 2.0。

19、g 的 KH2PO4、 0.01g 的 MgSO47H2O、 0.005g 的 CaCl22H2O、 5.0g 的 NH4Cl 和余量的水组成， pH 值为 6.0 8.0， 所述余量的水为微污染水 源水。 0017 本实施方式步骤一中 LB 固体培养基在 121下灭菌 15 30min 后使用。 0018 本实施方式步骤二中 LB 液体培养基在 121下灭菌 15 30min 后使用。 0019 本实施方式步骤三中筛选培养基在 121下灭菌 15 30min 后使用。 0020 本实施方式步骤四、 五和六中的存活菌株为使筛选培养基中出现浑浊的菌株。 0021 本实施方式步骤六中含5g活性炭的。

20、50ml蒸馏水在121下灭菌2030min后使 用。 0022 本实施方式中筛选驯化得到的细菌可在 2 10的低温条件下处理微污染水源 水， 氨氮降解率达 90以上， 且无硝酸盐和亚硝酸盐积累， 不产生 N2O。 0023 具体实施方式四 ： 本实施方式与具体实施方式三不同的是步骤一中 LB 固体培养 基每 1000mL 由 10g 的胰蛋白胨、 5g 的酵母浸粉、 20g 的琼脂、 10g NaCl 的和余量的水组成， pH 值为 6.0 8.0。其它步骤及参数与具体实施方式三相同。 0024 具体实施方式五 ： 本实施方式与具体实施方式四不同的是步骤二中 LB 液体培养 基每1000mL由。

21、10g的胰蛋白胨、 5g的酵母浸粉、 10gNaCl的和余量的水组成， pH值为6.0 8.0。其它步骤及参数与具体实施方式四相同。 0025 具体实施方式六 ： 本实施方式可在低温、 好氧条件下去除微污染水源水中氨氮细 菌的筛选方法按以下步骤实现 ： 一、 将 6 个微污染水源水样分别在温度 30、 160r/min 的 说 明 书 CN 101570736 B4/4 页 6 好氧条件下富集培养 48h 后得富集液， 富集液梯度稀释后涂布于 LB 固体培养基上， 在 30 的条件下分离培养 48h， 然后挑取特征不同的单菌落， 分别接种于 LB 固体培养基上纯化培 养24h ； 二、 将纯化。

22、后的菌株接种于LB液体培养基中， 在30的条件下培养24h后， 得菌液 ； 三、 取 1ml 菌液接种于筛选培养基中， 在 30的条件下培养 48h ； 四、 取存活菌株的菌液 1ml 转接于新鲜的筛选培养基中， 在 30的条件下培养 48h ； 五、 重复步骤四 2 次后取存活菌株 接种于筛选培养基中进行逐步低温驯化， 逐步低温驯化是在 20的条件下培养 48h， 驯化 3 代后取存活菌株的菌液 1ml 接种于筛选培养基中在 15的条件下培养 48h， 驯化 3 代后再 取存活菌株的菌液 1ml 接种于筛选培养基中在 8的条件下培养 48h， 驯化 3 代后再取存活 菌株的菌液 1ml 接种。

23、于筛选培养基中在 6的条件下培养 48h， 驯化 3 代后再取存活菌株的 菌液 1ml 接种于筛选培养基中在 2的条件下培养 48h， 驯化 3 代 ； 六、 取 5ml 2下低温驯 化后存活菌株的菌液， 在 12000r/min 转速下离心 5min， 取沉淀物并加入 1ml 无菌水制成悬 浮液， 然后加入含 5g 活性炭的 50ml 蒸馏水， 在 2下固定 48h 后将固定有细菌的活性炭取 出， 再将固定有细菌的活性炭接种于含 5mg/L 氨氮的无菌水中， 在 2、 140r/min 的条件下 振荡 8h， 然后取具有氨氮降解能 力且不产生硝酸盐和亚硝酸盐的菌株， 即为可在低温、 好 氧条。

24、件下去除微污染水源水中及氨氮的细菌 ； 其中步骤三中筛选培养基每 1000mL 由 1.9g 的 Na2HPO4、 2.0g 的 KH2PO4、 0.01g 的 MgSO47H2O、 0.005g 的 CaCl22H2O、 5.0g 的 NH4Cl 和余 量的水组成， pH 值为 6.0 8.0， 所述余量的水为微污染水源水。 0026 本实施方式步骤一中微污染水源水样为沿江 ( 河 ) 从上游至下游于江 ( 河 ) 中心 处每隔 10 米分别取水， 共取样 6 处。 0027 本实施方式中筛选得到具体实施方式一中的低温、 好氧条件下去除微污染水源水 中氨氮的细菌SRA13为Brevibacterium mcbrellneri， 如图1所示， 无鞭毛 ； 经检测， 在2 的条件下处理微污染水源水， 氨氮降解率达94， 且无硝酸盐和亚硝酸盐积累， 不产生N2O。 说 明 书 CN 101570736 B1/1 页 7 图 1 说 明 书 附 图 。