技术领域
本发明涉及血液制品领域，特别涉及一种能从冷沉淀制备三种血液制品的工艺方法。
技术背景
冷沉淀新鲜冰冻血浆低温融化后析出的一种沉淀组分，富含凝血因子Ⅷ、纤维蛋白原和纤维结合蛋白。血浆中约一半的凝血因子Ⅷ和纤维蛋白原，以及绝大部分的纤维结合蛋白会富集在冷沉淀当中。
凝血因子Ⅷ是治疗甲型血友病唯一的特效药，在临床上有巨大的应用价值。纤维蛋白原是治疗先天性和获得性纤维蛋白原缺乏症的首选药物。纤维结合蛋白在治疗疱疹性角膜溃疡方面也有较高的临床价值。
目前世界上几乎所有的血浆来源的凝血因子Ⅷ都是从冷沉淀制备得到的；纤维蛋白原多数是由Cohn氏组分Ⅰ制备得到的，也有少部分是由冷沉淀制备得到的；纤维结合蛋白在临床上则直接由冷沉淀代替。
关于冷沉淀制备凝血因子Ⅷ或者纤维蛋白原的报道非常多，而且许多技术方案已经在商业上得到实施。制备纤维结合蛋白的技术方案也非常多，多数为明胶亲和层析。但是由于技术的局限性，还没有任何一种技术方案可以由冷沉淀先后制备凝血因子Ⅷ、纤维蛋白原和纤维结合蛋白三种血液制品。因为在目前已有的技术方案中，都着眼于一种制品的分离提取和纯化，其他成分都作为杂蛋白被去除，很难再得到利用。
在冷沉淀中，凝血因子Ⅷ是一种微量蛋白，而纤维蛋白原和纤维结合蛋白含量要相对丰富的多。因此如果兼顾纤维蛋白原和纤维结合蛋白的收率，那么凝血因子Ⅷ的收率就会很容易受到影响，这也是目前没有任何已报道的工艺可以同时纯化这三种蛋白质制品的原因之一。
在现有的血液制品工艺当中，冷沉淀多用于凝血因子Ⅷ的制备，因为凝血因子Ⅷ是一种更加珍贵、经济价值更高的蛋白质。由于技术的限制，纤维蛋白原和纤维结合蛋白都会被抛弃。在纯化凝血因子Ⅷ的过程中，要通过沉淀技术将含量相对高得多的纤维蛋白原和纤维结合蛋白从溶液中析出，从而提高凝血因子Ⅷ的纯度。常用的沉淀技术有：甘氨酸沉淀、PEG沉淀、乙醇沉淀、低pH沉淀等。甘氨酸沉淀法需要消耗大量的甘氨酸，成本较高，而且凝血因子Ⅷ会共沉淀而导致收率降低；PEG沉淀法和乙醇沉淀法存在PEG残留或者蛋白质变性的问题；低pH法会导致纤维蛋白原和纤维结合蛋白沉淀不完全，纯化效果不好。
例如发明专利（申请公布号101703763A）公开了一种制备纤维蛋白原的方法，利用冷沉淀经过阴离子交换层析法和甘氨酸沉淀法制备纤维蛋白原，无法获得凝血因子Ⅷ和纤维结合蛋白；发明专利（专利号03115784.X）公开了一种制备纤维结合蛋白的方法，以冷沉淀为原料经过酒精沉淀、PEG沉淀和阴离子交换层析，制得纤维结合蛋白，但是也无法获得冷沉淀中富含的凝血因子Ⅷ、纤维蛋白原。
血浆（特别是人血浆）或者血浆组分是非常宝贵和稀有的资源，只有尽可能的分离纯化出有医疗价值的蛋白质成分，才能提高血浆的有效利用率。这一类的制备技术显然无法使冷沉淀中的各种有用成分得到充分的利用，实现冷沉淀中多种血浆蛋白的综合开发和利用。
发明内容
本发明提供了一套完整的分离纯化工艺，能够从冷沉淀中先后分别制备凝血因子Ⅷ、纤维蛋白原和纤维结合蛋白，共三种血液制品。
一种由冷沉淀制备凝血因子Ⅷ、纤维蛋白原和纤维结合蛋白的方法，制备步骤包括：冷沉淀溶解、凝胶吸附、纤维蛋白原和纤维结合蛋白沉淀析出、两步离子交换层析和甘氨酸/氯化钠沉淀法，以及病毒灭活。
一种由冷沉淀制备凝血因子Ⅷ、纤维蛋白原和纤维结合蛋白的方法，制备步骤包括：冷沉淀用注射用水溶解后，在适当的条件下用DEAE Sephadex A50凝胶进行吸附，吸附后的溶液调节至合适的pH、电导率和温度，纤维蛋白原和纤维结合蛋白形成沉淀析出，离心分离沉淀和上清液。上清液经过S/D病毒灭活和离子交换层析纯化得到凝血因子Ⅷ。沉淀再溶解后，经过离子交换层析分为流穿液和洗脱液。流穿液经过S/D病毒灭活和2次甘氨酸沉淀得到纯化的纤维蛋白原；洗脱液经过巴氏灭活得到纤维结合蛋白。
一种由冷沉淀制备凝血因子Ⅷ、纤维蛋白原和纤维结合蛋白的方法，包括以下具体步骤：
（1）冷沉淀用注射用水在15~35℃范围内搅拌溶解，用0.1mol/L的乙酸调节pH值为6.6~7.0，电导率小于4 mS/cm，加入平衡好的DEAE Sephadex A50凝胶，搅拌吸附40~60分钟，离心除去凝胶和未溶解的沉淀；
（2）步骤1中离心后的上清液再用0.1mol/L的乙酸调节pH值为6.2~6.5，并降低温度至12~18℃，纤维蛋白原和纤维结合蛋白会形成沉淀，可以通过离心分离沉淀，而凝血因子Ⅷ则留在上清液当中；
（3）步骤2中离心后的上清液富含凝血因子Ⅷ，经过澄清过滤后，加入1%的聚山梨酸酯-80和0.3%的磷酸三丁酯，24℃孵育6小时，可以有效灭活潜在的脂包膜病毒，如HBV等；
（4）步骤3中经过病毒灭活的溶液经过弱阴离子交换层析，可以吸附其中的凝血因子Ⅷ，大部分杂蛋白从层析柱上流穿，吸附后的层析柱经过洗涤可以除去残留的杂蛋白和聚山梨酸酯-80、磷酸三丁酯，用适当的洗脱液可以从层析柱上洗下凝血因子Ⅷ，经过浓缩、配制、除菌、分装、冻干、100℃/30min干热病毒灭活，即可得到凝血因子Ⅷ制品；
（5）步骤2中离心所得的沉淀含纤维蛋白原和纤维结合蛋白，用含氯化钠、枸橼酸钠和盐酸精氨酸的缓冲液溶解后，经过澄清过滤，加入1%的聚山梨酸酯-80和0.3%的磷酸三丁酯，24℃孵育6小时，可以有效灭活潜在的脂包膜病毒，如HBV等；
（6）步骤5中经过病毒灭活的溶液经过弱阴离子交换层析，可以吸附其中的纤维结合蛋白，大部分纤维蛋白原则从层析柱上流穿，吸附后的层析柱经过洗涤可以洗掉少量被吸附的纤维蛋白原和残留的聚山梨酸酯-80、磷酸三丁酯，用适当的洗脱液可以从层析柱上洗下纤维结合蛋白，经过6℃/10h巴氏灭活后，再经过浓缩、配制、除菌、分装可以制成注射液或者滴眼液；
（7）步骤6中层析柱上的流穿液和洗涤液富含纤维蛋白原，向其中加入甘氨酸（0.5~1.5mol/L）和氯化钠（1.0~2.1mol/L），纤维蛋白原形成沉淀，通过离心分离沉淀，将聚山梨酸酯-80、磷酸三丁酯留在上清液当中；
（8）将步骤7中所得的纤维蛋白原沉淀溶解后，再加入甘氨酸和氯化钠，再次离心分离沉淀，进一步降低聚山梨酸酯-80和磷酸三丁酯的残留量；
（9）步骤8中所得的纤维蛋白原沉淀溶解，经过浓缩、配制、除菌、分装、冻干、100℃/30min干热病毒灭活，即可得到纤维蛋白原制品。
以上步骤中所述“离心”是血液制品行业中通用的固液分离技术，一般采用连续流离心机（管式离心机），转速为通常14000转/分，进液速度通常为1~2.5L/min。所述脂包膜病毒灭活，即通常所说的有机溶剂/去污剂法病毒灭活技术，有机溶剂一般采用磷酸三丁酯，去污剂一般采用聚山梨酸酯-80或者Triton X-100。在24℃孵育6小时，对脂包膜病毒的灭活效果已经得到有效验证。所述“100℃/30min干热病毒灭活”和“巴氏灭活”也是血液制品行业通用的病毒灭活技术，可以有效灭活多种脂包膜和非脂包膜病毒。所述“澄清过滤”是生物制药行业熟知的深层过滤或膜过滤技术。所述“浓缩、配制、除菌、分装、冻干”都是制药行业熟知的技术或者操作方法。
步骤1中所述冷沉淀和注射用水的比例在1:2~1:5之间，以1:3最佳。所述比例是指质量比。
步骤1中所述DEAE Sephadex A50凝胶的添加量为每千克冷沉淀1~2g干胶。干胶需经过溶胀和平衡后才能使用。溶胀方法参照DEAE Sephadex A50凝胶使用说明书。平衡方法为：将含10~30mmol/L枸橼酸钠、30~80mmol/L氯化钠、pH为6.6~7.0的平衡液加入溶胀好的凝胶中，搅拌均匀并平衡10~20分钟，抽滤除去平衡液，再添加新的平衡液，反复平衡3~5次。
步骤2中所述调节pH过程，加乙酸的速度为100~300ml/min，使用喷雾的方式最佳。
步骤3和步骤5中所述的澄清过滤，要求滤膜具有一定的过滤精度。一般要求≤0.5微米。
步骤4中所述的弱阴离子交换层析可以采用Toyopeal DEAE-650M凝胶或者DEAE-Sepharase Fast Flow凝胶。层析柱规模按照每升柱床体积1~3千克冷沉淀计算。凝胶装填入层析柱，需经过平衡。平衡液含10~30mmol/L枸橼酸钠、50~80mmol/L氯化钠、80~120mmol/L甘氨酸，pH为6.6~7.0。需平衡3~5个柱床体积。将步骤3中经过灭活的溶液泵入平衡好的层析柱。然后依次用洗涤液和洗脱液冲洗层析柱。洗涤液含10~30mmol/L枸橼酸钠、80~150mmol/L氯化钠、80~120mmol/L甘氨酸，pH为6.6~7.0。洗涤至少3个柱床体积，直至波长280nm的紫外吸收值恢复或者接近基线水平。洗脱液含10~30mmol/L枸橼酸钠、200~250mmol/L氯化钠、80~120mmol/L甘氨酸，pH为6.6~7.0。根据波长280nm的紫外吸收值收集洗脱峰，收获纯化的凝血因子Ⅷ浓缩物。层析过程的线流速可参照所使用的凝胶的说明书，一般控制在100~150cm/h为宜。
步骤5中所述的溶解液含10~30mmol/L枸橼酸钠、50~80mmol/L氯化钠、10~30mmol/L盐酸精氨酸，pH8.0~8.5。溶解过程温度以20~35℃为宜。每公斤沉淀添加溶解液5~15公斤为宜。溶解后电导率控制在6.0~9.0 mS/cm，pH控制在7.5~8.0。
步骤6中所述的弱阴离子交换层析可以采用Toyopeal DEAE-650M凝胶或者DEAE-Sepharase Fast Flow凝胶。层析柱规模按照每升柱床体积0.8~2千克冷沉淀计算。凝胶装填入层析柱，需经过平衡。平衡液含10~30mmol/L枸橼酸钠、50~80mmol/L氯化钠、10~30mmol/L盐酸精氨酸，pH为7.5~8.0，电导率控制在6.0~9.0 mS/cm。需平衡3~5个柱床体积。将步骤5中经过灭活的溶液泵入平衡好的层析柱，收集流穿液。然后用平衡液冲洗层析柱（洗涤过程）。洗涤至少3个柱床体积，直至波长280nm的紫外吸收值恢复或者接近基线水平。收集洗涤液，并与流穿液混合。洗脱液含10~30mmol/L枸橼酸钠、250~350mmol/L氯化钠pH为6.5~7.5。根据波长280nm的紫外吸收值收集洗脱峰，收获纯化的纤维结合蛋白浓缩物。层析过程的线流速可参照所使用的凝胶的说明书，一般控制在100~150cm/h为宜。
步骤7和8中所述的甘氨酸和氯化钠可以事先配制成高浓度的母液，然后泵入制品中，使甘氨酸和氯化钠的最终浓度分别达到0.5~1.5mol/L和1.0~2.1mol/L，也可以直接向制品中加入粉末状或者细颗粒状的甘氨酸和氯化钠，使其最终浓度分别达到0.5~1.5mol/L和1.0~2.1mol/L即可。
本发明具有以下优点：
1、可以按照先后顺序分别从冷沉淀中分离提取凝血因子Ⅷ、纤维蛋白原和纤维结合蛋白共3种有用的血液制品。大大提高了血浆的利用率。
2、三种制品的生产可以利用相同的设备，如和纤维蛋白原的生产可以共用沉淀反应罐和离心机；凝血因子Ⅷ和纤维结合蛋白的生产可以共用层析柱（两种制品使用相同的离子交换凝胶）。
3、三种制品可以同时获得较高的收率和纯度。
4、以DEAE Sephadex A50凝胶代替传统工艺中的氢氧化铝凝胶来吸附冷沉淀中残留的凝血因子Ⅱ、Ⅶ、Ⅸ、Ⅹ具有以下优点：A50凝胶吸附凝血因子Ⅱ、Ⅶ、Ⅸ、Ⅹ的专一性优于氢氧化铝凝胶；A50凝胶由专业的供应商提供，质量可控性好，批间差异小；氢氧化凝胶需要现场制备，而现场制备的凝胶相应的浓度、纯度等质量可控性不高，而且容易随制备原料混入钙、镁等金属离子（凝血因子激活剂）。
5、本发明人经充分研究确认，各种凝血因子的吸附效果依赖于不同的吸附方法和吸附条件等因素的相互结合，才能达到本发明所需吸附效果，从而筛选确定了最佳工艺条件。
6、本发明人经充分研究确认，三种蛋白质（特别是凝血因子Ⅷ）高收率和纯化效果依赖于沉淀方法，温度、pH、电导率值的最佳组合，才可以保证三种蛋白质（特别是凝血因子Ⅷ）具有较高的收率和纯化效果，从而筛选确定了最佳工艺条件。
7、本发明人经充分研究确认，两种蛋白质的纯化依赖于离子交换层析条件，电导率和pH值最佳组合，才能达到本发明所需效果，从而筛选确定了最佳工艺条件。
具体实施方式
实例1：
第一步：取冷沉淀10kg，加入30kg30℃的注射用水，搅拌溶解1小时。用喷雾的方式加入0.1mol/L的乙酸，加乙酸的速度为120ml/min，调节pH值为6.9，调节电导率小于4 mS/cm，用去乙酸约1.4L。加入平衡好的DEAE Sephadex A50凝胶，搅拌吸附40分钟，采用连续流离心机（管式离心机）离心除去凝胶和少量未溶解的沉淀，收集上清液。
在第一步之前应作如下准备：称取DEAE Sephadex A50凝胶（干胶）20g。干胶置于烧杯中，加入80mmol/L氯化钠溶液1L溶胀6小时。配制平衡液：20mmol/L枸橼酸钠、60mmol/L氯化钠、pH为6.9。弃去烧杯中上层溶胀液，保留下层凝胶，再加入1L平衡液，搅拌均匀，并平衡10~20分钟，抽滤除去平衡液，再添加新的平衡液，反复平衡3~5次。
第二步：收集第一步中的上清液40.5kg。以200 ml/min的速度继续喷雾加0.1mol/L的乙酸约1.8L，调节pH至6.2。加乙酸的同时用冰水浴降温，调节温度至16℃。温度和pH达到要求后离心分离沉淀（称为酸沉淀）和上清液。
第三步：收集第二步所得上清液35kg，用Milligard? 1.2/0.5μm滤芯过滤。向滤液中加入1%的聚山梨酸酯-80和0.3%的磷酸三丁酯，混合均匀，24℃孵育6小时，灭活病毒。
第四步：用Toyopeal DEAE-650M凝胶装填层析柱，柱床体积为5L（柱床高度10cm，直径25cm）。配制平衡液：10mmol/L枸橼酸钠、80mmol/L氯化钠、80mmol/L甘氨酸，pH为6.8。需平衡5个柱床体积。将第三步中灭活后的溶液用蠕动泵泵入层析柱，流速为0.5L/min。然后依次用洗涤液和洗脱液冲洗层析柱。洗涤液含10mmol/L枸橼酸钠、150mmol/L氯化钠、120mmol/L甘氨酸，pH为6.8。洗涤至少3个柱床体积，直至波长280nm的紫外吸收值恢复或者接近基线水平。洗脱液含10mmol/L枸橼酸钠、250mmol/L氯化钠、120mmol/L甘氨酸，pH为6.8。根据波长280nm的紫外吸收值收集洗脱峰，收获纯化的凝血因子Ⅷ浓缩物约2.3L，测定所含凝血因子Ⅷ效价为48IU/ml，比活性为115IU/mg蛋白质。经过配制、除菌、分装、冻干、100℃/30min干热病毒灭活，得到凝血因子Ⅷ制品440瓶（规格为200IU /10ml/瓶）。
第五步：配制45kg溶解液： 20mmol/L枸橼酸钠、50mmol/L氯化钠、20mmol/L盐酸精氨酸，pH8.5。加入第二步中收集到的4.95kg酸沉淀（“每公斤沉淀添加溶解液5~15公斤为宜），30~35℃搅拌溶解2小时。溶解后电导率为8.5 mS/cm，pH为8.0。溶解后的溶液用过滤精度≤0.5微米的Milligard? 1.2/0.5μm滤芯（Milligard为milipore公司的过滤产品）过滤。向滤液中加入1%的聚山梨酸酯-80和0.3%的磷酸三丁酯，混合均匀，24℃孵育6小时，灭活病毒。
第六步：采用第四步中装填好的层析柱，按照凝胶说明书再生处理后，采用新的平衡液重新平衡。平衡液：20mmol/L枸橼酸钠、50mmol/L氯化钠、20mmol/L盐酸精氨酸，pH为8.0，电导率8.5 mS/cm。平衡5个柱床体积。将第五步中灭活后的溶液用蠕动泵泵入层析柱，流速为0.5L/min。收集流穿液。然后用平衡液冲洗层析柱（洗涤过程）。洗涤至少3个柱床体积。收集第一个柱床体积（约5L）的洗涤液，并与流穿液混合。洗脱液含20mmol/L枸橼酸钠、300mmol/L氯化钠pH为7.0。根据波长280nm的紫外吸收值收集洗脱峰，收获纯化的纤维结合蛋白浓缩物4.1L，含纤维结合蛋白6.5g/L，纯度为85.3%。经过6℃/10h巴氏灭活后，再经过浓缩、配制、除菌、分装可以制成注射液或者滴眼液。
第七步：第六步中收集的流穿液和洗涤液共54kg，在搅拌的同时，向其中缓慢加入粉末状的甘氨酸5.4kg和氯化钠7.02kg，继续搅拌30min。离心并收集沉淀，得到5.2kg。
第八步：再加入50kg注射用水，25℃搅拌1小时使沉淀完全溶解。在搅拌的同时，向其中缓慢加入粉末状的甘氨酸5.5kg和氯化钠7.2kg，继续搅拌30min。离心并收集沉淀，得到4.9kg。
第九步：沉淀用注射用水溶解后，经过浓缩、配制、除菌、分装、冻干、100℃/30min干热病毒灭活，得到纤维蛋白原制品528瓶（规格为0.5g/25ml/瓶）。经过检测，纤维蛋白原纯度为98.2%。
在本实例中，10kg冷沉淀制备得到的产品及其质量标准统计如下表：
纯度（比活性） 产量 收率 人凝血因子Ⅷ 115IU/mg蛋白质 440瓶（200IU /瓶） 44瓶/kg冷沉淀 人纤维结合蛋白 85.3% 26.65g（未分装） 2.6g/kg冷沉淀 人纤维蛋白原 98.2% 528瓶（0.5g/瓶） 52.8瓶/kg冷沉淀
实例2：
第一步：取冷沉淀10kg，加入50kg35℃的注射用水，搅拌溶解1小时；以100 ml/min的速度喷雾方式加乙酸调节pH值为6.7。加入平衡好的DEAE Sephadex A50凝胶，搅拌吸附50分钟；
在第一步之前应作如下准备：称取DEAE Sephadex A50凝胶（干胶）15g。配制平衡液：10mmol/L枸橼酸钠、80mmol/L氯化钠、pH为6.7；
其余操作步骤同实施例1第一步。
第二步：以100 ml/min的速度继续喷雾方式加0.1mol/L的乙酸，调节pH至6.5。加乙酸的同时用冰水浴降温，调节温度至12℃。
其余操作步骤同实施例1第二步。
第三步：收集第二步所得上清液55kg，操作步骤同实施例1第三步。
第四步：用DEAE-Sepharase Fast Flow凝胶装填层析柱，柱床体积为6L（柱床高度6cm，直径25cm）。配制平衡液：30mmol/L枸橼酸钠、50mmol/L氯化钠、120mmol/L甘氨酸，pH为6.6。需平衡3个柱床体积。洗涤液含20mmol/L枸橼酸钠、80mmol/L氯化钠、100mmol/L甘氨酸，pH为7.0。洗涤至少3个柱床体积，直至波长280nm的紫外吸收值恢复或者接近基线水平。洗脱液含30mmol/L枸橼酸钠、200mmol/L氯化钠、80mmol/L甘氨酸，pH为6.6。将第三步中灭活后的溶液用蠕动泵泵入层析柱，流速为0.6L/min。然后依次用洗涤液和洗脱液冲洗层析柱。
其余操作步骤同实施例1第四步。
收获纯化的凝血因子Ⅷ浓缩物约1.6L，测定所含凝血因子Ⅷ效价为64IU/ml，比活性为102IU/mg蛋白质。经过配制、除菌、分装、冻干、100℃/30min干热病毒灭活，得到凝血因子Ⅷ制品409瓶（规格为200IU /10ml/瓶）。
第五步：配制45kg溶解液： 30mmol/L枸橼酸钠、60mmol/L氯化钠、10mmol/L盐酸精氨酸，pH8.0。加入第二步中收集到的沉淀3.8kg，20~25℃搅拌溶解2小时。
其余操作步骤同实施例1第五步。
第六步：采用第四步中装填好的层析柱。平衡液：10mmol/L枸橼酸钠、70mmol/L氯化钠、30mmol/L盐酸精氨酸，pH为7.9。平衡4个柱床体积。洗脱液含10mmol/L枸橼酸钠、350mmol/L氯化钠、pH为7.5。
其余操作步骤同实施例1第六步。
收获纯化的纤维结合蛋白浓缩物2.9L，含纤维结合蛋8.9g/L，纯度为86.1%。
第七步：缓慢加入事先配制好的甘氨酸、氯化钠溶液。
其余操作步骤同实施例1第七步。
第八步：缓慢加入事先配制好的甘氨酸、氯化钠溶液。
其余操作步骤同实施例1第八步。
第九步：操作步骤同实施例1第九步。
得到纤维蛋白原制品528瓶（规格为0.5g/25ml/瓶）。
在本实例中，10kg冷沉淀制备得到的产品及其质量标准统计如下表：
纯度（比活性） 产量 收率 人凝血因子Ⅷ 102IU/mg蛋白质 409瓶（200IU /瓶） 41瓶/kg冷沉淀 人纤维结合蛋白 86.1% 28.65g（未分装） 2.8g/kg冷沉淀 人纤维蛋白原 99.1% 506瓶（0.5g/瓶） 50.6瓶/kg冷沉淀
实施例3：不同的吸附方法和吸附条件研究测试
许多关于凝血因子Ⅷ、纤维蛋白原的纯化工艺当中都包含了氢氧化铝凝胶吸附的步骤。氢氧化铝凝胶能够吸附多种凝血因子，但它是一种非特异性吸附剂，吸附能力有限。而且氢氧化铝凝胶的制备和质量控制比较复杂，不容易控制。现有工艺之所以不能够很好的利用冷沉淀中的多种有效成分，一个主要的原因是，当凝血因子Ⅱ、Ⅶ、Ⅸ、Ⅹ去除不够完全的时候，由于多种蛋白提取工艺复杂，工艺流程和耗时比较长，从冷沉淀中分离出的一种组分（例如富含纤维蛋白原和纤维结合蛋白的组分）在用于纯化其他蛋白质的时候会出现凝血因子激活，发生凝聚反应的现象。即便在制备工艺过程中没有发生明显的凝聚反应，由于激活的凝血因子的作用，往往导致凝血因子Ⅷ和纤维蛋白原产品复溶后出现絮状蛋白质沉淀，甚至胶状凝聚物。
通用电气公司（GE）生产的DEAE Sephadex A50凝胶，是一种离子交换凝胶，能够特异性的吸附带负电荷的凝血因子Ⅱ、Ⅶ、Ⅸ、Ⅹ。也正是由于这一特性，该凝胶被长期用于生产人凝血酶原复合物（主要成分为凝血因子Ⅱ、Ⅶ、Ⅸ、Ⅹ）。本研究者发现，采用DEAE Sephadex A50凝胶代替氢氧化铝凝胶吸附，能够更加有效地去除冷沉淀中的凝血因子Ⅱ、Ⅶ、Ⅸ、Ⅹ，能够防止凝血因子Ⅷ和纤维蛋白原被激活，使制品更加稳定。然而，凝血因子Ⅷ和纤维蛋白原也是带负电荷的蛋白质，也能够被DEAE Sephadex A50凝胶吸附，关键是找到合适的条件（pH、电导率、缓冲液成分、温度、吸附时间和凝胶用量），能够使凝血因子Ⅱ、Ⅶ、Ⅸ、Ⅹ被完全吸附，而凝血因子Ⅷ和纤维蛋白原则极少被吸附。
本发明以DEAE Sephadex A50凝胶代替氢氧化铝凝胶作为吸附剂，大大地提高了吸附的特异性，并且通过对比试验找到了最佳的吸附条件，能够完全的去除凝血因子Ⅱ、Ⅶ、Ⅸ、Ⅹ，而较好的保持凝血因子Ⅷ和纤维蛋白原等有效成分。具体实验方法为：取300g冷沉淀，加入750ml注射用水，30℃搅拌溶解，分置于9个烧杯中，每个烧杯盛100ml；用0.1mol/L的乙酸调节pH值，2mol/L的NaCl溶液调电导率；按照比例称取DEAE Sephadex A50凝胶（干胶），用含20mmol/L枸橼酸钠、30mmol/L氯化钠、pH为6.8的平衡液反复平衡3~5次，加入上述烧杯中，吸附不同的时间。氢氧化铝凝胶采用三氯化铝溶液和氢氧化钠溶液制备。测定吸附前和吸附后各种凝血因子效价。凝血因子效价测定方法按照2010版《中国药典》三部进行。
不同的吸附方法和吸附条件对各种凝血因子的吸附效果
注：（a）表示在保持电导率为3.1mS/cm、吸附时间为40min、凝胶用量为1.5g/kg冷沉淀的条件不变情况下，研究不同pH条件下，吸附前后各种凝血因子效价的变化（每克冷沉淀）。
（b）表示在保持pH为6.8、吸附时间为40min、凝胶用量为1.5g/kg冷沉淀的条件不变情况下，研究不同电导率条件下，吸附前后各种凝血因子效价的变化（每克冷沉淀）。
（c）表示在保持pH为6.8、电导率为3.1mS/cm、凝胶用量为1.5g/kg冷沉淀的条件不变情况下，研究不同吸附时间下，吸附前后各种凝血因子效价的变化（每克冷沉淀）。
（d））表示在保持pH为6.8、电导率为3.1mS/cm、吸附时间为40min的条件不变情况下，研究不同凝胶用量条件下，吸附前后各种凝血因子效价的变化（每克冷沉淀）。
（e）表示吸附条件为：pH为6.8、电导率为3.1mS/cm、吸附时间为40min、每公斤冷沉淀添加108g 20%的氢氧化铝凝胶。（吸附前后每克冷沉淀凝血因子含量的变化）
从研究结果可以得出以下结论：
1、pH在6.8附近比较合适。pH接近6.0时凝血因子Ⅱ、Ⅶ、Ⅸ、Ⅹ不能被完全吸附，pH接近7.6时部分凝血因子Ⅷ则会被吸附；
2、电导率在3.1mS/cm附近比较合适。电导率在8.3和15.2时凝血因子Ⅱ、Ⅶ、Ⅸ、Ⅹ的吸附量明显降低；
3、吸附时间在40~60min之间最合适，只吸附20min会有少量凝血因子Ⅱ、Ⅶ、Ⅸ、Ⅹ残留；
4、凝胶用量在1.5g/kg冷沉淀比较合适。该值小于0.5时会有部分凝血因子Ⅱ、Ⅶ、Ⅸ、Ⅹ残留，该值大于3时会导致少量凝血因子Ⅷ被吸附。
5、最适合的吸附条件是：pH6.8、电导率3.1mS/cm、吸附时间40~60min、凝胶用量1.5g/kg冷沉淀。
6、、在适当的条件下，采用DEAE Sephadex A50凝胶的吸附效果要明显优于传统的氢氧化铝凝胶：凝血因子Ⅱ、Ⅶ、Ⅸ、Ⅹ的吸附更加完全，凝血因子Ⅷ的吸附更少。
实施例4：不同的沉淀条件研究测试
影响冷沉淀综合开发利用的另一个技术关键点是纤维蛋白原和纤维结合蛋白的沉淀方法。纤维蛋白原和纤维结合蛋白在低温下会以沉淀的形式析出，纤维蛋白原在弱酸性或者地离子强度（低电导率值）条件下也会溶解度降低。但是低温条件下，凝血因子Ⅷ也会形成沉淀，如血浆冷沉淀。温度、pH、电导率值的最佳组合可以保证三种蛋白质（特别是凝血因子Ⅷ）具有较高的收率和纯化效果。下表是不同条件下三种蛋白质的回收率（凝血因子Ⅷ测定离心后上清液中的回收率，纤维蛋白原和纤维结合蛋白测定离心后沉淀中的回收率）。
不同的沉淀条件对凝血因子Ⅷ、纤维蛋白原和纤维结合蛋白收率的影响
注：a表示电导率为3.0、温度为14℃条件下，不同pH对于凝血因子Ⅷ、纤维蛋白原和纤维结合蛋白收率的影响。
b表示pH为6.3、温度为14℃条件下，不同电导率对于凝血因子Ⅷ、纤维蛋白原和纤维结合蛋白收率的影响。
c表示pH为6.3、电导率为3.0条件下，不同温度对于凝血因子Ⅷ、纤维蛋白原和纤维结合蛋白收率的影响。
从研究结果可以得出以下结论：
1、pH在6.3附近比较合适，凝血因子Ⅷ、纤维蛋白原和纤维结合蛋白的收率相对均衡，特别是凝血因子Ⅷ、纤维蛋白原的收率相对较高。pH接近5.8时凝血因子Ⅷ收率明显降低；pH接近6.8时纤维蛋白原的收率明显降低。
2、电导率值在3.0附近比较合适。随着电导率的升高，纤维蛋白原的收率急剧降低。
3、温度在14℃附近比较合适。温度在8℃时凝血因子Ⅷ收率急剧降低；在20℃附近，纤维蛋白原的收率明显降低，纤维结合蛋白的收率急剧降低。
4、最佳的沉淀条件是pH6.3、电导率值3.0mS/cm、温度14℃。
实施例5：不同层析条件研究测试
富含纤维蛋白原和纤维结合蛋白的沉淀溶解后，经过离子交换层析可以有效的使两种蛋白质分别得到纯化，特别是纤维蛋白原的纯度可以达到98%。电导率和pH是影响纤维蛋白原和纤维结合蛋白的收率和纯度的关键因素。电导率越低、pH越高，纤维蛋白原和纤维结合蛋白越容易被吸附在层析介质上。在一定的条件下，纤维结合蛋白与层析介质的结合能力总是要比纤维蛋白原高。层析条件不同，它们与层析介质的结合能力的差异也不同。在合适的条件下，结合能力的差异最大，可以使纤维蛋白原和纤维结合蛋白能够更好的分离，分别保持较高的纯度和收率。下表是不同层析条件下关于两种蛋白质收率和纯度的对比研究。溶解液的pH用0.1mol/L的NaOH溶液调节，根据溶解液中所含的NaCl浓度不同调节电导率。
不同层析条件下纤维蛋白原和纤维结合蛋白的收率和纯度
注：a表示研究pH的影响时，电导率为8.0mS/cm；b表示研究电导率的影响时，pH为7.5.
从研究结果可以得出以下结论：在pH为8.0，电导率为8.0mS/cm时，纤维蛋白原和纤维结合蛋白的收率和纯度能达到一个较为均衡的状态。