一种二十二碳六烯酸生产菌株及其诱变筛选方法和其应用.pdf

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1、(10)授权公告号 CN 101591617 B (45)授权公告日 2011.03.23 CN 101591617 B *CN101591617B* (21)申请号 200910033493.8 (22)申请日 2009.06.15 CCTCC NO:M208246 2008.12.08 C12N 1/12(2006.01) C12N 15/01(2006.01) C12Q 1/04(2006.01) C12P 7/64(2006.01) C12R 1/89(2006.01) (73)专利权人 南京工业大学 地址 210009 江苏省南京市新模范马路 5 号 (72)发明人 黄和 练敏 肖爱。

2、华 任路静 金立晶 朱婧瑶 (74)专利代理机构 南京苏高专利商标事务所 ( 普通合伙 ) 32204 代理人 肖明芳 CN 1101034 A,1995.04.05, 说明书实施例 . CN 1986822 A,2007.06.27, 说明书实施例 . CN 1648233 A,2005.08.03, 说明书实施例 . 任路静等 . 利用 Crypthecodiniumcohnii 高 密度发酵生产 DHA 的流加策略研究 .食品与发 酵工业 .2007, 第 33 卷 ( 第 1 期 ),25-27， 31. (54) 发明名称 一种二十二碳六烯酸生产菌株及其诱变筛选 方法和其应用 (57。

3、) 摘要 本 发 明 公 开 了 一 种 二 十 二 碳 六 烯 酸 产 生菌及其诱变筛选的方法和其应用。该诱 变筛选方法是基于代谢途径分析的菌种理 性 选 育 技 术。 该 菌 株 分 类 命 名 为 隐 甲 藻 CrypthecodiniumcohniiHX-308， 已保藏于中国典 型培养物保藏中心， 保藏编号为 M208246。该菌 株是通过紫外化学诱变筛选获得的 DHA 高产菌。 该菌株 DHA 含量高达出发菌株的 1.53 倍、 生理生 化稳定、 具有稳定的遗传性能， 同时本发明的菌种 经液体培养发酵可生产多不饱和脂肪酸， 不饱和 脂肪酸含量达到 20.4g/L， 其中 DHA 的。

4、含量达到 8.16g/L， 是生产天然 DHA 的优良藻株， 具备优异 的工业化生产前景。 (83)生物保藏信息 (51)Int.Cl. (56)对比文件 审查员 曲凯 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利 权利要求书 1 页 说明书 6 页 CN 101591617 B1/1 页 2 1. 一种二十二碳六烯酸生产菌株， 其分类命名为隐甲藻 (Crypthecodinium cohnii)， 已保藏于武汉大学中国典型培养物保藏中心， 其保藏编号是 CCTCC NO ： M 208246。 2. 权利要求 1 所述的二十二碳六烯酸生产菌株在发酵生产二十二碳六烯酸中的应用。 3.。

5、 根据权利要求 2 所述的应用， 其特征在于将菌株 CCTCC NO ： M 208246 按 5 30 (v/v) 的接种量接种于发酵培养基中， 20 30， 培养 3 5 天。 4. 根据权利要求 3 所述的应用， 其特征在于所述的发酵培养基为 pH5.0 8.0 的能提 供碳源、 无机盐及微量元素的液体培养基， 发酵培养基包含如下组分 ： 葡萄糖， 15 50g/L ； 酵母膏， 0.5 5g/L ； KH2PO4， 1 10g/L ； NaCl， 10 40g/L ； MgSO47H2O， 2 20g/L ； KCl， 0.2 2g/L ； CaCl2， 0.02 0.5g/L ； N。

6、aHCO3， 0.1 2g/L ； FeSO4， 0.001 0.01g/L ； 谷氨酸 钠， 5 50g/L。 权 利 要 求 书 CN 101591617 B1/6 页 3 一种二十二碳六烯酸生产菌株及其诱变筛选方法和其应用 技术领域 0001 本发明属于生物技术领域， 具体涉及一株高产不饱和脂肪酸二十二碳六烯酸菌 株， 以及获得该菌株的诱变筛选方法和该菌株的应用。 背景技术 0002 DHA(Docosahexaenoic acid， 22 ： 64.7.10.13.16.19， 全名二十二碳六烯酸 ) 是 一种重要的长链多不饱和脂肪酸(polyunsaturated fatty aci。

7、d， 简称PUFA)， 属于-3系 列。 DHA作为细胞膜合成的必要成分， 具有增强视力、 促进脑细胞发育等作用， 是婴幼儿大脑 生长发育和成年人大脑正常功能维持的必要成分， 被誉为 “脑黄金” 。DHA 也可以降血脂、 预 防和治疗动脉硬化、 抗炎、 抗癌等作用。因而， DHA 受到了食品界和医疗界的广泛关注。 0003 传统鱼油来源的 DHA， 难以满足人们对高品质保健品的要求以及不断增长的市 场需求。1968 年， Harrington， GW 等发现异养培养 Crypthecodinium cohnii( 早期称 ： Gyrodinium cohnii) 可得到较高产量的 DHA， 且。

8、脂肪酸组成较为单一， 总脂含量达 20， 其 中 DHA 占 30 50， 其他不饱和脂肪酸百分率小于 1， 是 DHA 高效的生产菌之一。1994 年， Yano 等人自深海鱼肠分离得到 5 株细菌 Vibrio sp. 产生 DHA， 其中有一株 6 天内能 产生 0.8mg/L 的 DHA ； 1998 年， 王黎等从鲐鱼和鲭鱼肠道中分离出 8 株富含多不饱和脂肪 酸的革兰氏阴性菌， 其中一株 WL1021 的 DHA 含量较高 ； 戴传超等筛选出一株产 DHA 的头 孢霉属丝状真菌， 菌丝含油脂 21.23， DHA 占总脂肪酸的 2.51 ； Bajpai 等发现破囊弧 菌 Thra。

9、ustochytrium arueum ATCC34304 总脂肪酸中 50均为 DHA， 在含 2.5淀粉的培 养基上培养其 DHA 产量达到 511mg/L ； Iida 等对培养基进行了优化后细胞产量达到 5.7g/ L ； Lizuyi 等则发现 Tharustochrtuim arueumATCC28201 在培养基中有更分散的形态， 在 初步优化培养基条件后， ATCC28210 最高 DHA 产量达到 850mg/L。Singh 等对发酵培养基 和条件进行优化后， 结果 ATCC28210 的 5d 培养生物量和 DHA 产量达到 10.4g/L 和 1.011g/ L ； Va。

10、zhappilly 等研究了 20 株微藻在三角瓶中光自养生产 DHA 的潜能， DHA 含量最高的 是隐甲藻 Crypthecodiniumcohnii(19.9 )， 然后是 Amphidinium carterax(17.0 ) 和 Thraustochytrium aureum(16.1)。 张秋会等为了筛选高产DHA藻株， 对8种海洋微藻进 行培养， 通过气相色谱测定 DHA 高产株等鞭金藻， 其 DHA 产量为 3.2mg/L ； 赵玉巧等以海水 中分离得到产 DHA 的酒香酵母为出发菌株， 对其进行诱变处理， 选择吸光值相对较高的菌 株， 采用有机溶剂萃取法测定油脂含量， 其中得。

11、到一株菌油脂含量达 50.4。 0004 近年来， 科学工作者开展了利用海洋微生物发酵生产 DHA 的研究。目前国内 已公开有三篇涉及微藻发酵生产长链多不饱和脂肪酸 DHA 方法的专利 ( 公开号分别为 CN1101034A、 CN1264967C、 CN1986822)， 其中 CN1264967C 以裂殖弧菌为研究对象， 生物量 14 25g/L， DHA 占菌体含量 18 35 ； CN1101034A 以隐甲藻为生产菌， 生物量只有 4 8g/L ； 前两篇专利产量均较低， 无技术优势。CN1986822 为 2007 年刚公开的专利， 公开了一 种隐甲藻发酵产 DHA 的培养方法， 。

12、生物量 20 40g/L， 海藻细胞含油量 20 50， 但较国 外发酵水平仍有较大差距， 主要原因与所选菌种、 发酵工艺有关， 难以抵抗国外先进技术带 说 明 书 CN 101591617 B2/6 页 4 来的竞争压力。 发明内容 0005 本发明所要解决的技术问题是提供了一株高产二十二碳六烯酸的生产菌株。 0006 本发明还要解决的一个技术问题是提供上述菌株的诱变筛选方法， 该方法是一种 基于微生物代谢途径分析的全新的理性筛选技术。 0007 本发明最后要解决的技术问题是提供上述生产菌株在制备生产二十二碳六烯酸 中的应用。 0008 为解决上述技术问题， 本发明采用的技术方案如下 ： 0。

13、009 本发明通过诱变筛选获得一株高产 DHA 的海洋微藻为 HX-308， 其分类命名为隐甲 藻 (Crypthecodinium cohnii)。 0010 目前该菌株保藏于武汉大学中国典型培养物保藏中心 ( 简称 CCTCC) ； 地址 ： 武汉 武汉大学 ； 邮编 ： 430072 ； 登记入册的编号 ： CCTCC NO ： M 208246 ； 保藏日期 ： 2008 年 12 月 8 日。以此菌作为生产菌株。 0011 CCTCC NO ： M 208246 菌株具有下述特征 ： 0012 (1) 菌落形态 ： 0013 将菌种稀释涂布在固体培养基上， 20 25培养， 菌落呈乳。

14、白色， 边界光滑圆润。 0014 (2) 菌体形态 ： 0015 将菌种至光学显微镜下观察， 球状单细胞， 直径 5-18m， 有鞭毛。 0016 (3) 底物 ： 0017 可以利用葡萄糖作为底物。 0018 (4) 代谢 ： 0019 主要代谢产物为不饱和脂肪酸， 包括 DHA、 EPA 等。该菌株在 20 30均能生 长， 25 28为最适生长温度， DHA 积累最适温度为 25 ； 菌体适合在中性 pH 培养液中 生长， 发酵过程中 pH 基本恒定， 在 5 8 之间。 0020 上述 DHA 高产菌隐甲藻 CCTCC NO ： M 208246 的诱变筛选方法包括如下步骤 ： 002。

15、1 (1) 种子的培养 ； 0022 (2) 种子液的预处理 ； 0023 (3) 对步骤 (2) 得到的种子处理液进行诱变 ； 0024 (4) 筛选 ： 0025 (4a) 初筛 ： 初筛平板采用添加了红四氮唑染色剂 (TCC) 的固体培养基， 20 30， 培养 2 5 天， 挑出生长速率较快、 被红四氮唑染色剂染色较深、 较大的菌落， 保证筛 选出的菌株具有高的生长活力和高的脂肪酸积累效率， 以待复筛 ； 0026 (4b) 复筛 ： 复筛平板采用添加了菌种 EMP 途径抑制剂或呼吸抑制剂的固体培养 基， 将初筛得到的菌株接种于复筛平板中， 20 30， 培养 2 5 天， 挑选出生长。

16、速率较快、 较大的菌落 ； 由于复筛平板中添加了菌种 EMP 途径抑制剂， 因而能够存活下来的菌种的菌 体 NADPH 积累较出发菌株强， 对脂肪酸的积累具有积极的作用 ； 0027 (4c) 再筛 ： 将复筛得到的菌株转接到种子培养基中进行传代培养， 分别进行摇瓶 发酵， 20 30， 培养 2 5 天， 以摇瓶发酵后的脂肪酸含量和二十二碳六烯酸含量为筛选 说 明 书 CN 101591617 B3/6 页 5 指标， 获得二十二碳六烯酸的高产菌株。 0028 步骤 (1) 中， 种子的培养方法为 ： 将具有二十二碳六烯酸产生能力的微生物接种 于种子培养基中， 接种量为 0.2 2 (v/v。

17、)， 20 30培养 20 50 小时， 待种子生长至 对数期。 其中， 所述的种子培养基包括碳源、 氮源、 无机盐离子和微量元素， 其中碳源为葡萄 糖， 氮源为酵母膏， 无机盐离子为钠盐、 镁盐、 钾盐、 磷酸盐和钙盐中的任意一种或多种， 微 量元素为 Mn2+、 Co2+、 MnO42+、 Ni2+和 Fe2+中的任意一种或多种。 0029 步骤 (2) 中， 种子液的预处理方法为 ： 将步骤 (1) 得到的种子液， 用 20 40g/L 的 人工海水、 或 pH 7.4 的磷酸盐缓冲液稀释， 接于已经灭菌处理过的平铺有玻璃珠的三角 瓶中， 室温下振荡处理210min， 使藻体细胞分散， 。

18、用灭过菌的28层纱布、 或脱脂棉、 或 1 3 层擦镜纸过滤， 即得种子处理液。 0030 步骤 (3) 中， 所述的诱变方法为紫外诱变、 化学诱变和紫外化学复合诱变中的任 意一种或几种。 0031 所述的紫外诱变方法为 ： 将步骤 (2) 得到的种子处理液， 均匀涂布于空白的无菌 平板上， 保证菌液厚度为 1 3mm， 黑暗条件下进行紫外诱变。诱变条件 ： 紫外灯 20 30W， 照射距离 20 35cm， 照射时间为 1 30min。最后红灯条件下， 取出平板， 用 20 40g/L 的人工海水、 或 pH 7.4 的磷酸盐缓冲液稀释后进行平板涂布。 0032 所述的化学诱变方法为 ： 将。

19、步骤 (2) 得到的种子处理液与化学诱变剂混合， 20 30、 150 200rpm 下， 振荡处理 10 40min， 然后离心机中 5000 12000rpm 转速下离心 3 15min， 弃上清液， 用 20 40g/L 的人工海水、 或 pH 7.4 的磷酸盐缓冲液重悬洗涤细 胞， 离心弃上清， 重复重悬和离心操作 2 5 次， 最后用 20 40g/L 的人工海水、 或 pH 7.4 的磷酸盐缓冲液稀释后平板涂布。所述的化学诱变剂为亚硝基胍 (NTG) 或甲基磺酸乙 酯 (EMS)。化学诱变剂先经丙酮及 20 40g/L 的人工海水、 或 pH 7.4 磷酸盐缓冲液溶解 配成溶液， 。

20、使得浓度为 0.001 0.05g/mL， 再用 0.22m 或 0.44m 无菌滤膜过滤， 化学诱 变剂溶液与种子处理液的用量体积比为 1 5 9。 0033 所述的紫外化学复合诱变为 ： 将步骤 (2) 得到的种子处理液先进行紫外诱变在进 行化学诱变， 或者， 先进行化学诱变再进行紫外诱变。 紫外诱变的方法以及化学诱变的方法 如前所述。 0034 步骤 (4a) 中， 固体培养基中红四氮唑染色剂的加入量为 0.5 2 (v/v)。 0035 步骤 (4b) 中， 所述的 EMP 途径抑制剂为碘乙酸或碘乙酸钠， 所述的呼吸抑制剂为 丙二酸， 固体培养基中 EMP 途径抑制剂或呼吸抑制剂的加入。

21、量为 0.02 0.08g/L。其中碘 乙酸、 碘乙酸钠或丙二酸等的预处理方法为去离子水溶解后再利用 0.22m 或 0.44m 无 菌滤膜过滤， 避光保存。 0036 本发明诱变筛选方法的创新之处在于， 筛选剂的选择是通过对微生物代谢途径分 析后， 确定制约脂肪酸合成的关键点为还原力 NADPH 和前体物质乙酰辅酶 A 的足量供应。 本发明重点分析的途径包括微生物糖酵解途径、 三羧酸转运体系、 脂肪酸合成途径等， 发现 在糖酵解途径中、 TCA 循环及柠檬酸裂解途径中可以利用碘乙酸、 碘乙酸钠及丙二酸对部分 关键酶的抑制， 增加还原力及前体物质的供应。本发明的诱变筛选方法适用于海洋隐甲藻 (。

22、Crypthecdodinium)、 裂殖弧菌属 (Schizochytrium)、 破囊弧菌属 (Thraustochytrium)、 被孢霉 (Mortierella) 等一系列脂肪酸生产菌的微生物选育工作。 说 明 书 CN 101591617 B4/6 页 6 0037 上述二十二碳六烯酸生产菌株在发酵生产二十二碳六烯酸中的应用。具体生 产方法为 ： 将发酵培养基在 115 121的高温下灭菌 15 35min， 冷却后备用， 将菌株 CCTCCNO ： M 208246 按 5 30 (v/v) 的接种量接种于发酵培养基中 ( 菌株 CCTCC NO ： M 208246 先进行种子。

23、培养 )， 20 30， 培养 3 5 天。所述的发酵培养基为 pH5.0 8.0 的能提供碳源、 碳源、 无机盐及微量元素的液体培养基。 0038 本发明所用的培养基优选配方如下 ： 0039 种子培养基 ： 葡萄糖， 20 60g/L ； 酵母膏， 0.5 5g/L ； KH2PO4， 1 10g/L ； NaCl， 10 40g/L ； MgSO47H2O， 2 20g/L ； KCl， 02 2g/L ； FeSO4， 0.001 0.01g/L。 0040 固体培养基 ： 葡萄糖， 20 60g/L ； 酵母膏， 0.5 5g/L ； KH2PO4， 1 10g/L ； NaCl， 。

24、1040g/L ； MgSO4 7H2O， 220g/L ； KCl， 0.22g/L ； FeSO4， 0.0010.01g/L ； 琼脂， 20 40g/L。 0041 发酵培养基 ： 葡萄糖， 15 50g/L ； 酵母膏， 0.5 5g/L ； KH2PO4， 1 10gL ； NaCl， 1040g/L ； MgSO4 7H2O， 220g/L ； KCl， 0.22g/L ； CaCl2， 0.020.5g/L ； NaHCO3， 0.1 2g/L ； FeSO4， 0.001 0.01g/L ； 谷氨酸钠， 5 50g/L。 0042 有益效果 ： 本发明筛选出的一株 DHA 高。

25、产菌隐甲藻 Crypthecdodinium cohnii HX-308(CCTCC NO ： M 208246)， 该菌株生长活力旺盛、 耗糖速率快、 产油率高、 DHA 含量高达 出发菌株的 1.53 倍、 生理生化稳定、 具有稳定的遗传性能， 同时本发明的菌种经液体培养 发酵可生产不饱和脂肪酸， 不饱和脂肪酸含量达到20.4g/L， 其中DHA的含量达到8.16g/L， 是生产天然 DHA 的优良藻株， 具备优异的工业化生产前景。本发明还提供了一种全新的诱 变筛选方法， 是从代谢途径分析出发的， 通过这种筛选方法， 可以实现菌种筛选的高通量， 节约筛选成本， 提高工作效率， 目的性明确。。

26、 具体实施方式 ： 0043 根据下述实施例， 可以更好地理解本发明。然而， 本领域的技术人员容易理解， 实 施例所描述的具体的物料配比、 工艺条件及其结果仅用于说明本发明， 而不应当也不会限 制权利要求书中所详细描述的本发明。 0044 以下实施例所用的培养基配方如下 ： 0045 种 子 培 养 基 ：葡 萄 糖， 40g/L ；酵 母 膏， 2g/L ； KH2PO4， 4g/L ； NaCl， 25g/L ； MgSO47H2O， 10g/L ； KCl， 1g/L ； FeSO4， 0.003g/L。 0046 固 体 培 养 基 ：葡 萄 糖， 40g/L ；酵 母 膏， 2g/L。

27、 ； KH2PO4， 4g/L ； NaCl， 25g/L ； MgSO47H2O， 10g/L ； KCl， 1g/L ； FeSO4， 0.003g/L ； 琼脂， 20g/L。 0047 发 酵 培 养 基 ： 葡 萄 糖， 40g/L ； 酵 母 膏， 4g/L ； KH2PO4， 4g/L ； NaCl， 12.5g/L ； MgSO47H2O， 5g/L ； KCl， 0.5g/L ； CaCl2， 0.1g/L ； NaHCO3， 0.5g/L ； FeSO4， 0.003g/L ； 谷 氨 酸 钠， 40g/L。 0048 实施例 1 ： 种子的培养。 0049 将具有二十二碳。

28、六烯酸产生能力的隐甲藻 (ATCC 30772) 接种于种子培养基中， 接种量为 1 (v/v)， 25条件下培养三代， 取培养 40h 的第三代菌液。 0050 实施例 2 ： 种子液的预处理。 0051 将实施例 1 得到的菌液 1mL， 用 9mL 浓度为 30g/L 的无菌人工海水稀释， 接于已经 说 明 书 CN 101591617 B5/6 页 7 灭菌处理过的平铺有玻璃珠的三角瓶中， 室温下振荡处理 5min， 使藻体细胞分散， 用灭过菌 的 6 层纱布过滤， 梯度稀释， 计数， 至细胞浓度为 1.5104个 /mL。 0052 实施例 3 ： 紫外诱变 0053 将实施例 2 。

29、得到的菌液涂布在无菌平板上， 保证菌液厚度约 2 3mm， 距 30W 紫外 灯 30cm 处分别进行诱变 1、 3、 5、 9、 15min， 得到 5 株待筛选菌株。 0054 实施例 4 ： 化学诱变 0055 将实施例 2 得到的菌液 0.9mL 以体积比 9 1 的比例与化学诱变剂 NTG 母液混 合处理， 其中 NTG 母液的配置方法为 ： 分别取 0.01g、 0.015g、 0.02gNTG 溶于 0.1mL 丙酮以 及 0.9mL 30g/L 的无菌人工海水中， 无菌滤膜过滤。每个 NTG 梯度的处理样品处理 20min、 30min、 40min， 通过 3 次重悬和离心终。

30、止诱变反应， 得到 9 株待筛选菌株。 0056 实施例 5 ： 紫外化学复合诱变。 0057 将实施例4得到的经化学诱变的菌株， 分别涂布在无菌平板上， 再在距30W紫外灯 30cm 处分别进行诱变 1、 3、 5、 9、 15min， 得到 45 株待筛选菌株。 0058 实施例 6 ： 筛选。 0059 a， 将实施例3得到的菌株， 黑暗条件下用30g/L的无菌人工盐水梯度稀释， 涂布在 添加了 1 (v/v)TCC 的固体培养基中， 培养 2 天后， 挑取 50 株长势较好且被 TCC 染色较深 的菌株， 以待复筛。 0060 b， 将通过初筛的 50 株菌株转至添加有 0.02g/L。

31、 的碘乙酸的固体培养基中。25 条件下平板培养2天， 观察平板， 挑选25株较早长出且菌落比较大的菌株， 分别转接至种子 培养液中， 以留备用。 0061 c， 将平板筛选获得菌株分别接种至发酵培养基中， 发酵 3 天， 待糖耗尽， 分别测定 细胞干重、 脂肪酸含量以及 DHA 含量， 各指标比较， 获得 5 株 DHA 产量较高的菌株， 分别命名 为 HX-1、 HX-2、 HX-3、 HX-4、 HX-5。 0062 采用本实施例的上述a、 b、 c三步方法处理实施例4得到的菌株， 最终获得5株DHA 产量较高的菌株， 分别命名为 HX-6、 HX-7、 HX-8、 HX-9、 HX-10。

32、。 0063 采用本实施例的上述a、 b、 c三步方法处理实施例5得到的菌株， 最终获得5株DHA 产量较高的菌株， 分别命名为 HX-302、 HX-304、 HX-306、 HX-308、 HX-310。 0064 实施例 7 ： 菌株遗传稳定性考察。 0065 实施例 6 所获得的 15 株 DHA 产量较高的菌株进行遗传稳定性考察。将每个菌株 连续传 10 代， 每代均接入发酵培养基发酵， 发酵培养条件 ： 20 30、 150 170rpm 培养 3 天， 残糖降至 5g/L 左右时结束发酵， 菌株显示稳定的发酵性能。其中产量较高、 稳定性最 好的菌株为 HX-308。初糖浓度为 1。

33、20g/L 条件下， 生物量可稳定在 35g/L 左右， 油脂总含量 在 20.4g/L 左右， DHA 占总油脂的 35 40， DHA 的含量在 8.16g/L 左右。 0066 实施例 8 ： 菌株改造前后发酵性能比较。 0067 将菌株 HX-308 进行实验室 250mL 摇瓶培养。初始糖浓度 120g/L， 发酵 3 天。对比 诱变前后发酵结果， 见表 1 ： 0068 表 1 菌株诱变前后发酵结果对比 0069 说 明 书 CN 101591617 B6/6 页 8 生物量 油脂 含量 DHA 占总油脂 DHA 产量 发酵 时间 DHA 产率 原始菌株 21g/L 14g/L 2。

34、8 5.32g/L 96h 0.063g/Lh 菌株 HX-308 37g/L 20.4g/L 40 8.16g/L 75h 0.1088g/Lh 0070 由上表得， 诱变后菌株生长活性增高， 发酵时间明显缩短， DHA 产率由 0.063g/L h 增长至 0.1088g/Lh。 0071 实施例 9 ： 摇瓶发酵。 0072 将诱变获得的稳定菌株 HX-308 接种到种子培养基中， 培养 40h， 备用。 0073 将上述种子液以 5 (v/v) 的接种量接入到经过 121灭菌 30min 的 100mL 发酵 培养基中， 发酵培养条件为 ： 温度为2030、 转速为150rpm170r。

35、pm。 发酵75h， 得到菌 体生物量为 38g/L， 油脂含量为 21.7g/L， 其中 DHA 占总油脂的 40， 即 DHA 产量为 8.68g/ L。 0074 实施例 10 ： 5L 发酵罐发酵。 0075 将实施例 9 得到的种子液以 10 (v/v) 的接种量接入已经灭菌的装有 3L 发酵培 养基的5L发酵罐中， 发酵过程中以植物油为消泡剂， 于25、 1vvm的通气比率、 150rpm的搅 拌转速下发酵培养 3 4 天。结果见表 2 ： 0076 表 2 5L 发酵罐发酵发酵培养结果 0077 生物量 油脂含量 DHA 占总油脂 DHA 产量 发酵时间 DHA 产率 40g/L 22.5g/L 40 9.00g/L 75h 0.12g/Lh 说 明 书 。