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1、(10)申请公布号 CN 102277322 A (43)申请公布日 2011.12.14 CN 102277322 A *CN102277322A* (21)申请号 201110224295.7 (22)申请日 2009.07.16 CCTCC No.M208252 2008.12.11 200910100875.8 2009.07.16 C12N 1/20(2006.01) C12P 13/04(2006.01) C12R 1/06(2006.01) (71)申请人 浙江工业大学 地址 310014 浙江省杭州市下城区朝晖六区 (72)发明人 郑裕国 柳志强 张涛 徐建妙 薛亚平 郑仁朝 。
2、沈寅初 (74)专利代理机构 杭州天正专利事务所有限公 司 33201 代理人 黄美娟 冷红梅 (54) 发明名称 节杆菌及其催化亚氨基二乙腈制备亚氨基二 乙酸 (57) 摘要 本发明提供了微生物催化亚氨基二乙腈制备 亚氨基二乙酸的方法及菌株， 所述的方法是利用 产腈水解酶的菌株， 经产酶培养得到腈水解酶， 以 腈水解酶做为生物催化剂生物催化亚氨基二乙腈 制备得到亚氨基二乙酸。该发明为采用生物催化 亚氨基二乙腈生产亚氨基二乙酸提供了基础， 具 有重要应用前景。 (62)分案原申请数据 (83)生物保藏信息 (51)Int.Cl. (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利。
3、要求书 1 页 说明书 7 页 CN 102277325 A1/1 页 2 1.节杆菌(Arthrobacter nitroguajacolicus)ZJUTB06-99， 保藏于中国典型培养物保 藏中心， 地址 ： 中国.武汉.武汉大学， 430072， 保藏编号CCTCCNo ： M 208252， 保藏日期2008 年 12 月 11 日。 2. 一种利用权利要求 1 所述节杆菌 CCTCC No ： M 208252 催化亚氨基二乙腈制备亚氨 基二乙酸的方法， 所述方法如下 ： (A) 将所述节杆菌 CCTCC No ： M 208252 接种至产酶培养基， 加入诱导剂 a 于 100。
4、 200r/min、 20 35条件下进行发酵培养 2 5d ； 所述诱导剂 a 为正丁腈、 异丁腈或己 内酰胺 ； 所述产酶培养基终浓度组成为 ： 甘油 8g/L， 酵母膏 6g/L， NaCl 1g/L， K2HPO45g/L， MgSO40.2g/L， 溶剂为水， pH 值 7.0 ； 所述诱导剂 a 的终浓度为 5g/L ； (B) 取亚氨基二乙腈配制成质量浓度 0.5 6的水溶液， 调初始 pH 为 7.0 7.5， 作为酶催化反应底物溶液 ； 以步骤 (A) 发酵获得的湿菌体、 细胞破碎获得的粗酶液或经固 定化得到的固定化细胞作为酶源， 酶源加入量以湿菌体计为 0.1 10g 湿菌。
5、体 /10mL 底物 溶液 ； 控制反应温度为 30、 反应 pH 为 6.0 9.0， 进行转化反应 8 16h， 反应结束后， 反 应液经分离纯化得到亚氨基二乙酸。 3. 如权利要求 2 所述的方法， 其特征在于所述的步骤 (B) 取亚氨基二乙腈配制成质量 浓度 0.5 6的水溶液， 以氨水、 NaOH 或 HCl 水溶液调 pH 为 7.0 7.5。 4. 如权利要求 2 所述的方法， 其特征在于所述的步骤 (A) 所述的发酵培养在 30条件 下进行发酵培养 3d。 5. 如权利要求 2 所述的方法， 其特征在于所述的步骤 (B) 所述的控制反应温度为 30， 进行转化反应 10h。 权。
6、 利 要 求 书 CN 102277322 A CN 102277325 A1/7 页 3 节杆菌及其催化亚氨基二乙腈制备亚氨基二乙酸 ( 一 ) 技术领域 0001 本发明涉及一种产腈水解酶的微生物催化亚氨基二乙腈制备亚氨基二乙酸的方 法， 以及筛选获得的具有腈水解酶活性的菌株。 ( 二 ) 背景技术 0002 亚氨基二乙酸 (IDA) 是一种比较重要的化工原料， 具有很强的络合能力能和多种 金属离子络合而形成螯合物， 和铜离子可以形成蓝色的鳌合物， 常用作络合剂和表面活性 剂， 常用于有机合成， 也是草甘膦 (Glyphosate) 生产的重要中间体。由于其分子中含有亚 氨基和羧基， 化学。
7、性质很活泼， 广泛应用于电镀、 染料、 医药、 电子等领域。是一种重要的化 工中间体。 0003 目前制备亚氨基二乙酸一般采用化学方法， 根据原料的不同主要有氯乙酸法、 氮 川三乙酸法、 氨代氯乙酸法、 氢氰酸法、 一乙醇胺法、 二乙醇胺法等。 传统的化学方法存在产 生成本高、 污染严重、 对设备要求高， 或者使用剧毒的氢氰酸等弱点。利用生物催化亚氨基 二乙腈生产亚氨基二乙酸与化学水解法相比， 其优势在于 ： (1) 反应条件温和。化学水解法 需要在 100左右进行， 必须配备加热和温控装置， 反应条件苛刻， 能耗高而且对设备要求 高。而生物催化法一般都是在常温下进行， 反应条件温和， 设备成。
8、本相对较低。(2) 原料消 耗大幅度减少， 基本不产生可溶性盐。 利用腈水解酶一步水解生成亚氨基二乙酸， 省去了碱 解和酸化工艺， 避免了 NaOH 和浓盐酸的大量使用。生物法中利用 NH4OH 调节转化体系 的 pH 值， 在产物回收中采用再生技术， 可以有效减少可溶性盐的排放。(3) 废水排放少。按照 目前的化学水解工艺， 生产每吨亚氨基二乙酸将至少产生废水 8 吨。采用生物法后， 以腈水 解酶酶活力 10 万单位计算 ( 回用 5 次 )， 生产每吨亚氨基二乙酸的废水量可控制在 2 吨以 下， 且废水中不存在盐类等难处理杂质， 可生化性强。 0004 利用腈转化酶生物催化亚氨基二乙腈制备。
9、亚氨基二乙酸， 可以克服化学法生产亚 氨基二乙酸的缺陷。 生物催化是迄今为止人类所知道的最高效、 最具选择性的催化体系， 可 以提供许多传统化学方法不能或者不易合成得到的手性化合物的合成方法， 显示出优良的 化学选择性、 区域选择性和立体选择性。 而且， 生物转化反应条件温和、 反应产物纯度高、 容 易分离和纯化， 在农药中间体的生产中， 显示出巨大的发展潜力。 ( 三 ) 发明内容 0005 本发明目的是微生物产酶培养得到腈水解酶催化亚氨基二乙腈制备得到亚氨基 二乙酸的制备方法。本发明所另一目的是提供筛选得到的产腈水解酶的微生物。 0006 本发明采用的技术方案是 ： 0007 节杆菌 (A。
10、rthrobacter nitroguajacolicus)ZJUTB06-99， 保藏于中国典型培养物 保藏中心， 地址 ： 中国 . 武汉 . 武汉大学， 430072， 保藏编号 CCTCCNo ： M 208252， 保藏日期 2008 年 12 月 11 日。 0008 上述菌株由浙江工业大学生物工程研究所从土壤中分离获得。 说 明 书 CN 102277322 A CN 102277325 A2/7 页 4 0009 本发明还涉及利用前述菌株微生物催化亚氨基二乙腈制备亚氨基二乙酸的方法， 所述的方法是利用产腈水解酶的菌株， 经产酶培养得到腈水 解酶， 以该酶为生物催化剂催 化亚氨基。
11、二乙腈制备得到亚氨基二乙酸。 生物催化亚氨基二乙腈生产亚氨基二乙酸的过程 如下 ： 0010 0011 本发明所述的制备亚氨基二乙酸的方法具体如下 ： 0012 (A)将所述节杆菌CCTCC No ： M 208252接种至产酶培养基， 加入诱导剂a于100 200r/min、 20 35条件下进行发酵培养 2 5d ； 所述诱导剂 a 为正丁腈、 异丁腈或己 内酰胺 ； 所述产酶培养基终浓度组成为 ： 甘油 8g/L， 酵母膏 6g/L， NaCl 1g/L， K2HPO45g/L， MgSO40.2g/L， 溶剂为水， pH 值 7.0 ； 所述诱导剂 a 的终浓度为 5g/L ； 001。
12、3 (B) 取亚氨基二乙腈配制成质量浓度 0.5 6的水溶液， 调初始 pH 为 7.0 7.5， 作为酶催化反应底物溶液 ； 以步骤 (A) 发酵获得的湿菌体、 细胞破碎获得的粗酶液或 经固定化得到的固定化细胞作为酶源， 酶源加入量以湿菌体计为 0.1 10g 湿菌体 /10mL 底物溶液 ； 控制反应温度为 30、 反应 pH 为 6.0 9.0， 进行转化反应 8 16h， 反应结束 后， 反应液经分离纯化得到亚氨基二乙酸。 0014 上述步骤(A)所述的发酵培养优选在30条件下进行发酵培养3d ； 步骤(B)所述 的控制反应温度优选为 30， 进行转化反应 10h。 0015 本发明所。
13、述的产腈水解酶的微生物由如下方法筛选获得， 所述方法包括初筛和复 筛 ： 0016 (1) 初筛 ： 将待筛选菌株接种至初筛培养基， 25 37培养 1 4d， 挑取菌落中 产生黄色变色圈的菌株， 接种到 LB 斜面培养基， 25 30培养 2 5d 后取菌株进行复筛 ； 所述初筛培养基终浓度组成如下 ： 亚胺基二乙腈 5g/L， 酵母膏 6g/L， NaCl1g/L， K2HPO41g/L， MgSO41g/L， 溴钾酚紫 1g/L， 琼脂粉 20g/L， 溶剂为水， pH 7.0 ； 即所述初筛培养基每 1L 按如 下组成配制 ： 亚胺基二乙腈 5g， 酵母膏 6g， NaCl 1g， K。
14、2HPO41g， MgSO41g， 溴钾酚紫 0.1g， 琼脂 粉 20g， 溶剂为水， pH 7.0 ； 0017 优选步骤 (1) 初筛所述的培养温度 28 30， 培养 3 4d。 0018 (2) 复筛 ： 将初筛获得的菌株接种至复筛培养基， 100 200r/min、 25 35下培 养 2 7d， 收集菌体测定亚氨基二乙酸的生成量， 收集生成亚氨基二乙酸含量大于 10的 微生物 ； 所述复筛培养基终浓度组成如下 ： 甘油 8g/L、 酵母膏 6g/L、 NaCl 1g/L、 K2HPO45g/L、 MgSO40.2g/L， 正丁腈 5g， 溶剂为水， pH 7.0， 即所述复筛培养。
15、基每 1L 按如下组成配制 ： 甘油 8g、 酵母膏 6g、 NaCl 1g、 K2HPO45g、 MgSO40.2g， 诱导剂 b 5g， 溶剂为水， pH 7.0。 0019 优选步骤 (2) 复筛所述的培养温度为 30 32。 0020 本发明所述的诱导剂 a 与诱导剂 b 所表示的都是微生物培养过程中的诱导剂， 这 里 a 和 b 只是用以区分诱导剂出现在不同步骤。 0021 本发明的有益效果主要体现在 ： 提供了一种利用产腈水解酶的菌株经产酶培养， 得到腈水解酶， 以该酶为生物催化剂催化亚氨基二乙腈制备得到亚氨基二乙酸的方法， 可 高效生产亚氨基二乙酸， 本发明还提供了可产腈水解酶的。
16、微生物的筛选方法， 并获得了多 种产腈水解酶的菌株， 为采用生物催化亚氨基二乙腈生产亚氨基二乙酸提供了基础， 具有 说 明 书 CN 102277322 A CN 102277325 A3/7 页 5 重要应用前景。 ( 四 ) 具体实施方式 0022 下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述， 但本发明的保护范围并不仅限于 此 ： 0023 实施例 1 ： 产腈水解酶菌种的初筛 0024 初筛培养基每 1L 按如下组成配制 ： 酵母膏 6g， NaCl 1g， K2HPO41g， MgSO41g， 琼脂粉 20g， pH 7.0 水补足至 1000mL， 灭菌后冷却到 50加入 5g 亚氨基。
17、二乙腈和 1g 溴甲酚紫， 混 匀到平板。 0025 收集细菌进行筛选， 涂布于平板上， 在温度 28 30， 培养 3 4d， 挑取菌落中产 生黄色变色圈的菌株， 接种到 LB 斜面培养 (25 28 ) ； 0026 黄色变色圈的微生物菌株有 ： 边缘假单胞菌 ZJB09121(Pseudomonas marginalis ZJB09121)、 恶 臭 假 单 胞 菌 ZJB09134(Pseudomonas putia ZJB09134)、 恶 臭 假 单 胞 菌 ZJB09129(Pseudomonas putia ZJB09129)、 恶臭假单胞菌 ZJB09135(Pseudomo。
18、nas putia ZJB09135)、 荧光假单胞菌 ZJB09137(Pseudomonas fluorescens ZJB09137)、 产酸克雷 伯氏菌 ZJB09123(Kelbsiella ocytoca ZJB09123)、 弗氏红球菌 ZJB09124(Rhodococcus wratislaviensis ZJB09124)、 嗜 吡 啶 红 球 菌 ZJB09126(Rhodococcus pyridinivorans ZJB09126)、 紫 红 红 球 菌 ZJB09125(Rhodococcus rhodochrous ZJB09125)、 赤 红 球 菌 ZJB09。
19、127(Rhodococcus rubber ZJB09127)、 藤黄微球菌 ZJB09131(Micrococcus luteus ZJB09131)、 耐 盐 短 杆 菌 ZJB09132(Brevibacterium halotoerans ZJB09132)、 敏 捷 食 酸 菌 ZJB09122(Acidovorax facilis ZJB09122)、 粪 产 碱 杆 菌 ZJB09138(Alcaligenes faecalis ZJB09138)、 节杆菌(Arthrobacter mtroguajaolius)ZJUTB06-99(即CCTCC No ： M 208252)。
20、。 0027 实施例 2 ： 产腈水解酶菌种的复筛 0028 将实施例 1 中有筛选到的可产生变色反应且黄色变色圈大的菌株， 接种到复筛培 养基中， 30 32， 100 200r/min， 500mL 三角瓶装液量 150mL， 发酵培养 3d， 发酵液离心 得到粗酶液或湿菌体。各取 1g 湿菌体， 置于 500ml 三角瓶中， 加入 50ml 2 (w/w) 的反应 底物亚氨基二乙腈水溶液， 30摇床 150r/min 条件下反应 60min， 离心去除菌体， 测定亚氨 基二乙酸的生成量， 计算转化率， 结果见表 1。 0029 复筛培养基每 1L 按如下组成配制 ： 甘油 8g， 酵母膏。
21、 6g， NaCl 1g， K2HPO45g， MgSO40.2g， 正丁腈 5g， pH 值 7.0， 水补足至 1000mL ； 诱导剂正丁腈也可以异丁腈或己内酰胺 代替。 0030 表 1 ： 产腈水解酶菌种的复筛结果 0031 序号 菌株名称 转化率 ( ) 1 边缘假单胞菌 (Pseudomonas marginalis)ZJB09121 26.5 2 敏捷食酸菌 (Acidovorax facilis)ZJB09122 21.9 3 产酸克雷伯氏菌 (Kelbsiella ocytoca)ZJB09123 22.3 4 弗氏红球菌 (Rhodococcus wratislavien。
22、sis)ZJB09124 23.6 5 紫红红球菌 (Rhodococcus rhodochrous)ZJB09125 24.7 说 明 书 CN 102277322 A CN 102277325 A4/7 页 6 6 嗜吡啶红球菌 (Rhodococcus pyridinivorans)ZJB09126 30.0 7 赤红球菌 (Rhodococcus rubber)ZJB09127 23.3 8 恶臭假单胞菌 (Pseudomonas putia)ZJB09129 24.4 9 恶臭假单胞菌 (Pseudomonas putia)ZJB09135 23， 9 10 藤黄微球菌 (Micro。
23、coccus luteus)ZJB09131 24.7 11 耐盐短杆菌 (Brevibacterium halotoerans)ZJB09132 25.8 12 恶臭假单胞菌 (Pseudomonas putia)ZJB09134 13.1 13 荧光假单胞菌 (Pseudomonas fluorescens)ZJB09137 14.3 14 粪产碱杆菌 (Pseudomonas aeruginosa)ZJB09138 54.8 15 节杆菌 (Arthrobacter nitroguajacolicus)ZJUTB06-99 26.4 0032 实施例 3 ： 产腈水解酶微生物的培养及生物。
24、催化制备亚氨基二乙酸 0033 产酶培养基每 1L 按如下组成配制 ： 甘油 8g、 酵母膏 6g、 NaCl 1g、 K2HPO45g、 MgSO40.2g， 水补足至 1000mL ； 另加入诱导剂正丁腈 5g。 0034 产酶培养基分装于 500mL 三角瓶中， 装液量 100mL/ 瓶， 用灭菌锅热灭菌 20min， 温 度为 121。 0035 将实施例 1 中获得的菌株， 分别接种 1 环经斜面活化培养的菌种到添加了诱导剂 的产酶培养基中， 在摇瓶转速为 200r/min， 温度为 30下、 培养 3d， 收集湿菌体作为腈水解 酶粗酶。在 100mL 3 (w/w) 的亚氨基二乙腈。
25、水溶液中加入 5g 湿菌体进行水解反应， 控制 温度30、 搅拌转速200r/min， 氨水自动流加调节pH 7.0， 水解10h后测定产物亚氨基二乙 酸的产率并计算转化率， 结果见表 2。 0036 表 2 ： 产腈水解酶菌种亚氨基二乙酸的产率及转化率 0037 序号 菌株名称 转化率 ( ) 1 边缘假单胞菌 (Pseudomonas marginalis)ZJB09121 23.7 2 敏捷食酸菌 (Acidovorax facilis)ZJB09122 25.1 3 产酸克雷伯氏菌 (Kelbsiella ocytoca)ZJB09123 20.8 4 弗氏红球菌 (Rhodococc。
26、us wratislaviensis)ZJB09124 24.5 5 紫红红球菌 (Rhodococcus rhodochrous)ZJB09125 26.2 6 嗜吡啶红球菌 (Rhodococcus pyridinivorans)ZJB09126 30.7 7 赤红球菌 (Rhodococcus rubber)ZJB09127 23.9 8 恶臭假单胞菌 (Pseudomonas putia)ZJB09129 23.1 9 恶臭假单胞菌 (Pseudomonas putia)ZJB09135 24.2 10 藤黄微球菌 (Micrococcus luteus)ZJB09131 24.8 1。
27、1 耐盐短杆菌 (Brevibacterium halotoerans)ZJB09132 25.7 12 恶臭假单胞菌 (Pseudomonas putia)ZJB09134 13.0 13 荧光假单胞菌 (Pseudomonas fluorescens)ZJB09137 14.7 14 粪产碱杆菌 (Pseudomonas aeruglnosa)ZJB09138 54.9 15 节杆菌 (Arthrobacter nitroguajacolicus)ZJUTB06-99 26.5 0038 实施例 4 ： 游离细胞生物催化生产亚氨基二乙酸 0039 为了考察实施例1中获得的细菌菌株所产腈水解。
28、酶的稳定性， 按实施例3的方法， 对实施例 1 中获得的细菌菌株进行游离细胞反复分批酶水解试验， 水解 10h 后测定亚氨基 二乙酸的含量， 并离心收集菌体， 离心收集的菌体再用于水解反应， 反复 3 次。试验结果如 表 3。 0040 表 3 ： 产腈水解酶菌种的游离细胞反复分批酶水解试验结果 0041 说 明 书 CN 102277322 A CN 102277325 A5/7 页 7 0042 实施例 5 ： 固定化细胞生物催化生产亚氨基二乙酸 0043 为了进一步考察实施例 1 中获得的细菌菌株所产腈水解酶的稳定性， 对部分菌株 进行细胞固定化， 并进行反复分批酶水解试验。 0044 。
29、称取按实施例 3 培养的边缘假单胞菌 ZJB09121(Pseudomonas marginalis ZJB09121)、 恶 臭 假 单 胞 菌 ZJB09134(Pseudomonas putia ZJB09134)、 恶 臭 假 单 胞 菌 ZJB09129(Pseudomonas putia ZJB09129)、 恶臭假单胞菌 ZJB09135(Pseudomonas putia ZJB09135)、 荧光假单胞菌 ZJB09137(Pseudomonas fluorescens ZJB09137)、 产酸克雷 伯氏菌 ZJB09123(Kelbsiella ocytoca ZJB09。
30、123)、 弗氏红球菌 ZJB09124(Rhodococcus wratislaviensis ZJB09124)、弗 氏 红 球 菌 ZJB09126(Rhodococcus pyridinivorans ZJB09126)、 紫 红 红 球 菌 ZJB09125(Rhodococcus rhodochrous ZJB09125)、 赤 红 球 菌 ZJB09127(Rhodococcus rubber ZJB09127)、 藤黄微球菌 ZJB09131(Micrococcus luteus ZJB09131)、 耐盐短杆菌 ZJB09132(Brevibacterium halotoer。
31、ans ZJB09132)、 敏捷食酸菌 ZJB09122(Acidovorax facilis ZJB09122、 粪产碱杆菌 ZJB09138(Alcaligenes faecalis ZJB09138)、 节杆菌 (Arthrobacter nitroguajacolicus)ZJUTB06-99 的菌体细胞， 用去离 子水配制成菌悬液， 将浓度为 2 (w/w) 海藻酸钠加热溶解， 冷却后将以湿菌体计的菌体细 胞与海藻酸钠溶液配成 6 (g 湿菌体 /ml 海藻酸钠溶液 ) 的均匀混合液， 并将混合液滴入 2(w/w)的CaCl2溶液中， 固定化12h ； 滤出颗粒， 用生理盐水洗净，。
32、 上述固定化的细胞再用 0.2 (w/v) 的戊二醛 -HCl 溶液 ( 含 30mM CaCl2) 室温下搅拌处理 24h， 之后用蒸馏水洗 3 次， 得到交联固定化细胞。将上述不同菌株的交联固定化细胞， 用于反复分批水解拆分， 反 复 3 次， 结果如表 4。 0045 表 4 ： 产腈水解酶菌种的游离细胞反复分批酶水解试验结果 说 明 书 CN 102277322 A CN 102277325 A6/7 页 8 0046 0047 0048 实施例 6 ： 游离酶生物催化生产亚氨基二乙酸 0049 将实施例 1 中经发酵获得的细菌菌体， 利用 0.9生理盐水洗涤 3 次， 收集菌体重 悬。
33、于Tris-HCl pH 7.0缓冲液中， 调节菌体浓度以湿菌体计为10(g/m1)， 利用超声波、 高 压破碎仪、 高压均质机对细胞进行破碎， 得到含有游离腈水解酶的粗酶液， 利用游离酶进行 生物催化反应。在 9m13 (w/w) 的亚氨基二乙腈水溶液中加入 1ml 粗酶液进行水解反应， 控制温度 30、 搅拌转速 200r/min， 氨水自动流加调节 pH 7.0， 水解 10h 后， 10000rpm 离心 20min 后， 测定上清液中产物亚氨基二乙酸的产率并计算转化率， 结果见表 5。 0050 表 5 ： 游离腈水解酶生物催化生产亚氨基二乙酸结果 0051 序号 菌株名称 转化率 。
34、( ) 1 边缘假单胞菌 (Pseudomonas marginalis)ZJB09121 22.9 2 敏捷食酸菌 (Acidovorax facilis)ZJB09122 26.7 3 产酸克雷伯氏菌 (Kelbsiella ocytoca)ZJB09123 22.3 4 弗氏红球菌 (Rhodococcus wratislaviensis)ZJB09124 24.1 5 紫红红球菌 (Rhodococcus rhodochrous)ZJB09125 27.2 6 嗜吡啶红球菌 (Rhodococcus pyridinivorans)ZJB09126 29.1 7 赤红球菌 (Rhodoc。
35、occus rubber)ZJB09127 24.7 8 恶臭假单胞菌 (Pseudomonas putia)ZJB09129 26.5 说 明 书 CN 102277322 A CN 102277325 A7/7 页 9 9 恶臭假单胞菌 (Pseudomonas putia)ZJB09135 28.3 10 藤黄微球菌 (Micrococcus luteus)ZJB09131 31.2 11 耐盐短杆菌 (Brevibacterium halotoerans)ZJB09132 25.6 12 恶臭假单胞菌 (Pseudomonas putia)ZJB09134 20.1 13 荧光假单胞菌。
36、 (Pseudomonas fluorescens)ZJB09137 15.3 14 粪产碱杆菌 (Pseudomonas aeruginosa)ZJB09138 55.9 15 节杆菌 (Arthrobacter nitroguajacolicus)ZJUTB06-99 28.7 0052 0053 通过以上实施例得出结论 ： 本发明所筛选获得的假单胞菌 (Pseudomonas)、 克雷伯 氏菌 (Kelbsiella)、 红球菌 (Rhodococcus)、 微球菌 (Micrococcus)、 杆菌 (Alcaligenes)、 短 杆菌 (Brevibacterium)、 节杆菌 (Arthrobacter)、 食酸菌 (Acidovorax) 等属的菌株及其突变 株， 对生产亚氨基二乙酸均有效， 无论游离细胞、 细胞破碎后的游离酶、 固定化细胞都有很好 的转化亚氨基二乙腈生产亚氨基二乙酸的效果。 这些菌株的游离细胞和固定化细胞所产的腈 水解酶的稳定性较好， 因此这些菌株可用于生物催化水解亚氨基二乙腈， 进而生产亚氨基二 乙酸。 说 明 书 CN 102277322 A 。