一种枯草芽孢杆菌及其在香蕉组织培养中的应用.pdf

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1、(10)授权公告号 CN 101591629 B (45)授权公告日 2011.08.24 CN 101591629 B *CN101591629B* (21)申请号 200910111797.1 (22)申请日 2009.05.19 CGMCC No:3043 2009.04.19 C12N 1/20(2006.01) C12Q 1/04(2006.01) A01H 4/00(2006.01) C12R 1/125(2006.01) (73)专利权人 福建省农业科学院植物保护研究 所 地址 350013 福建省福州市晋安区新店镇埔 党村 (72)发明人 陈福如 杨秀娟 杜宜新 甘林 阮宏椿 。

2、(74)专利代理机构 福州元创专利商标代理有限 公司 35100 代理人 蔡学俊 US 2008/0152684 A1,2008.06.26, 全文 . CN 101250495 A,2008.08.27, 全文 . CN 101186887 A,2008.05.28, 全文 . JP 昭 59-212416 A,1984.12.01, 全文 . 孙正祥 等 . 香蕉枯萎病拮抗细菌的分离筛 选与鉴定 .中国生物防治 .2008, 第 24 卷 ( 第 2 期 ),143-147. 付业勤 等 . 内生拮抗细菌 BEB2 的分子鉴 定及其对香蕉枯萎病的抑制作用 .热带作物学 报 .2009, 第。

3、 30 卷 ( 第 1 期 ),80-85. 殷晓敏 等 . 香蕉内在拮抗细菌研究 菌株 B215 的分离及分子鉴定 .热带作物学 报 .2008, 第 29 卷 ( 第 5 期 ),636-640. (54) 发明名称 一种枯草芽孢杆菌及其在香蕉组织培养中的 应用 (57) 摘要 本发明提供一种枯草芽孢杆菌及其在香蕉组 织培养中的应用技术。本发明采用的枯草芽孢杆 菌T122F具有促生、 抗病作用。 利用枯草芽孢杆菌 的促生性和诱导抗性等功能， 通过将枯草芽孢杆 菌 T122F 培养液及其代谢产物添加于香蕉组织培 养基中， 然后接入香蕉组织培养材料培养， 即可快 速获得长势、 耐毒、 耐病性等。

4、有明显提高的健康香 蕉苗。 实施本发明操作简便， 获得的香蕉健康苗出 苗率高， 实施本发明对缩短香蕉组培苗培养周期， 节约生产成本具有良好的经济效益， 对拓展枯草 芽孢杆菌应用范围及开发一种新型的香蕉组织培 养基进行香蕉种质资源抗性改良和创新利用具有 重要的实践价值。 (83)生物保藏信息 (51)Int.Cl. (56)对比文件 审查员 徐莉 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利 权利要求书 1 页 说明书 9 页 附图 4 页 CN 101591629 B1/1 页 2 1. 一种枯草芽孢杆菌， 其特征在于 ： 所述枯草芽孢杆菌 (Bacillus subtilis)T1。

5、22F 菌 株， 其16srDNA序列如序列表中SEQ ID NO.1所示 ； 所述枯草芽孢杆菌T122F菌株的保藏号 为 CGMCC No.3043。 2. 一种如权利要求 1 所述的枯草芽孢杆菌的用途， 其特征在于 ： 所述枯草芽孢杆菌 T122F 菌株用于香蕉组织培养。 3.根据权利要求2所述的枯草芽孢杆菌的用途， 其特征在于 ： 所述枯草芽孢杆菌T122F 菌株在香蕉组织培养中的具体步骤为 ： (1)T122F 无菌培养液制作 ： 将所述 T122F 菌株在 28条件下用常规的细菌 NB 液体培 养基振荡培养 3 天， 培养液双层滤纸过滤后， 于 121条件下灭菌 20min 后备用 。

6、； (2) 香蕉组织培养基的制作 ： 在 MS 基础培养基配方上， 配制香蕉丛生芽增殖培养基、 丛 生芽分化培养基和分生苗生根培养基 ： 所述丛生芽增殖培养基为 ： MS 培养基 1000ml+6- 苄 基氨基嘌呤 6-BA 5mg+ 萘乙酸 NAA2mg ； 所述丛生芽分化培养基为 ： MS 培养基 1000ml+6- 苄 基氨基嘌呤 6-BA 3mg+ 萘乙酸 NAA 1mg ； 所述分生苗生根培养基为 ： MS 培养基 500ml+6- 糠 基氨基嘌呤 KT 1mg+ 萘乙酸 NAA 1mg+ 活性炭粉 2g+ 纯水 500ml ； 所述各培养基于 121条 件下灭菌 20min 后备用。

7、 ； (3) 含 T122F 培养液的香蕉组织培养基制作 ： 将步骤 (1) 的 T122F 菌株培养液按 10 的体积比分别添加至 50的香蕉丛生芽增殖培养基、 丛生芽分化培养基和分生苗生根培养 基， 混匀冷却后备用 ； (4) 香蕉组培材料的培养 ： 步骤 1) 丛生芽继代增殖培养 ： 在含 T122F 菌株培养液的香蕉丛生芽增殖培养基中， 每 瓶移入香蕉丛生芽组织 5 块， 于 28 30， 光强 2000Lx、 10h 光 /14h 暗条件下培养 ； 培养 12 15 天后， 丛生芽转增殖下一代 ； 步骤2)丛生芽分化培养 ： 取步骤1)的丛生芽， 在丛生芽分化培养基中于2830， 光。

8、强 2000Lx、 10h 光 /14h 暗条件下培养 20 天后， 丛生芽分化成合格苗后移入生根培养基中 生根培养 ； 步骤 3) 分化苗生根培养 ： 取步骤 2) 分化苗移入含 T122F 菌株培养液的香蕉生根培养 基中， 每瓶移香蕉分化苗 8 株， 于 28 30， 光强 2000Lx、 12h 光 /12h 暗条件下培养， 培 养 20 天后， 分化苗长出良好的根、 茎和叶。 4. 根据权利要求 3 所述的枯草芽孢杆菌的用途， 其特征在于 ： 所述步骤 (4) 中丛生芽 继代增殖培养步骤中， 每瓶含培养基 30ml， 移入香蕉丛生芽 10 个 ； 所述丛生芽分化培养步 骤中， 每瓶含培。

9、养基30ml移入继代增殖后的丛生芽10个， 所述分化苗生根培养步骤每瓶含 培养基 30ml。 权 利 要 求 书 CN 101591629 B1/9 页 3 一种枯草芽孢杆菌及其在香蕉组织培养中的应用 技术领域 0001 本发明技术领域属于农学门类的植物保护学和植物细胞工程学 ； 更具体涉及一种 枯草芽孢杆菌及其在香蕉组织培养中的应用。 背景技术 0002 大量使用化学农药防治植物病害已造成对环境和人类健康的危害， 利用安全而环 境友好的生物或化学诱导因子来激活植物的防御反应就是一种有效的策略。 枯草芽孢杆菌 (Bacillussubtilis) 是一类嗜温、 好氧或兼性厌氧的腐生细菌， 在自。

10、然界中分布广泛， 极易 分离培养， 对人畜无害， 不污染环境。能够产生对热、 紫外线、 电磁辐射有很强抗性的芽孢， 耐受各种不良的环境条件。产生多种抗菌素 ( 如抗真菌肽、 脂肽抗生素、 小分子的多糖物 质、 大分子的抗菌蛋白)和酶(如蛋白酶、 淀粉酶、 酯酶、 几丁质酶及乙酰基氨基葡糖苷酶等 细胞壁降解酶)， 具有广谱抗菌活性和极强的抗逆能力。 对植物多种病原菌(如香蕉枯萎病 菌、 小麦白粉病菌， 稻瘟病菌、 棉花立枯病菌、 大豆根腐病菌、 番茄灰霉病菌、 辣椒炭疽病菌 等 ) 产生抑制， 目前已经在黄瓜、 辣椒、 香蕉、 水稻、 小麦、 玉米、 棉花等农作物主要病害上表 现出很好的防治效果。

11、。 0003 所有的植物具有多种潜在的有效的保护机制， 诱导抗性(induced resistance)是 指利用物理的、 化学的以及生物的方法， 预先处理植物， 诱导植物启动自身的防御机制， 增 强对外界的抵抗能力。诱导抗性也是枯草芽孢杆菌防治植物病害的一种重要机制， 枯草芽 孢杆菌能诱导植物体内的多种防卫反应， 诱导一些植物防卫基因的表达、 增加与抗性有关 保护酶的活性及植保素、 木质素、 酚类化合物的含量， 产生许多新的抗病菌物质， 从而提高 植株对多种病原菌的系统抗性， 这种诱导系统抗性通常具有广谱性、 系统性和非特异性。 枯 草芽孢杆菌不仅含有植物生长素及类似代谢物如细胞分裂素、 玉。

12、米素、 脱落酸、 赤霉酸等， 而且还能诱导植物内源生长激素 ( 吲哚乙酸、 赤霉素、 玉米素 ) 和叶绿素含量增加， 促进植 物生长， 提高植株对外界环境的适应性和抗逆性。 枯草芽孢杆菌的应用很广泛， 国内外在农 业领域中多以该菌制成菌剂， 以生物农药形式用于农业生产， 对农业生态安全和减少环境 污染起着重要的意义。 发明内容 0004 本发明的目的是提供一种枯草芽孢杆菌及其在香蕉组织培养中的应用， 将培养出 的枯草芽孢杆菌 T122F 用于香蕉组织培养中， 在材料来源上经济方便， 技术上操作简便， 具 有香蕉组培苗生长安全， 出苗快、 整齐， 育苗时间短， 成本低等优点。 获得的香蕉组培苗生。

13、长 健壮， 根系发达， 抗毒素、 抗病能力强， 均可达到瓶苗假植质量标准。 实施本项发明对开发一 种新型的香蕉组织培养基， 对香蕉种质资源抗性改良和创新利用具有重要作用。对拓展枯 草芽孢杆菌在香蕉组织培养中的应用新领域和香蕉抗病育种研究新途径也具有重要的实 践意义。 0005 本发明的枯草芽孢杆菌 (Bacillus subtilis)T122F 菌株， 其 16s rDNA 序列如序 说 明 书 CN 101591629 B2/9 页 4 列表中 SEQ IDNO.1 所示。 0006 本发明的枯草芽孢杆菌 (Bacillus subtilis)T122F 菌株， 已经于 2009 年 4 。

14、月 19 日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心， 其简称 CGMCC， 保藏编号为 ： CGMCCNo.3043。 0007 本发明的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)T122F菌株形态学鉴定 ： 如下表1中 所示 ： 0008 表 1 细胞形态和生理生化试验结果 0009 0010 本发明的枯草芽孢杆菌的选育方法 ： 所述枯草芽孢杆菌 T122F 菌株从香蕉枯萎病 病区健康香蕉植株体内分离筛选获得。 0011 本发明的枯草芽孢杆菌 T122F 菌株用于香蕉组织培养。 0012 本发明的显著优点为 ： 0013 本发明采用选育的一株枯草芽孢杆菌 T122F， 将该。

15、一定浓度枯草芽孢杆菌 T122F 培养液均匀地添加到香蕉组织培养基 ( 含增殖培养基、 分化培养基、 生根培养基 )， 然后接 入相应的香蕉培养材料(愈伤组织、 丛生芽、 分化苗)， 使之在含有枯草芽孢杆菌T122F代谢 产物的香蕉组织培养基中健康生长， 通过比较香蕉不同生长时期培养材料的生长情况和抗 毒素、 抗病性情况之后， 发现使用该技术可明显提高香蕉丛生芽增殖和苗分化能力， 提高香 蕉丛生芽和组培苗的抗毒素、 抗病能力， 使香蕉植株在组培苗期就可获得诱导抗性。 0014 本发明使用的 T122F 菌株是从香蕉枯萎病病区健康香蕉植株体内分离筛选获得 的一种具有促生、 控病作用的香蕉内生芽孢。

16、杆菌， 该菌株经中国科学院微生物研究所通过 常规细胞形态、 生理生化及 16SrRNA 序列测定， 鉴定 T122F 菌株为枯草芽孢杆菌。与来自香 蕉体内的芽孢杆菌及其它来源的枯草芽孢杆菌相比， 该 T122F 菌株对香蕉枯萎病具有较强 的抗菌活性和生防效果， 能明显促进香蕉丛生芽组织和植株生长， 提高香蕉苗保护酶的活 性， 并在香蕉体内迅速定殖和繁殖， 增强植株对病害的抗性， 是值得深入研究和具有开发潜 力的一个菌株。 说 明 书 CN 101591629 B3/9 页 5 0015 关于枯草芽孢杆菌诱导作物抗病性和促生性， 目前大多基于一些作物种子和植株 水平上的研究与应用， 未见在香蕉细。

17、胞、 组织水平上的诱导应用。 香蕉细胞工程组培技术使 香蕉种苗实现了工厂化生产， 对香蕉产业的发展起着举足轻重的作用。本发明经过多年实 验研究， 得出在香蕉组织培养过程添加枯草芽孢杆菌 T122F 的培养滤液， 一方面能明显促 进香蕉丛生芽组织的生长， 提高丛生芽增殖和苗分化能力， 另一方面还能提高香蕉丛生芽 和分化苗的耐毒素、 耐病能力。本发明对进一步提高香蕉组培苗的出苗率， 缩短育苗时间， 节药成本， 提高香蕉组培苗的抗病能力具有重要的作用。 0016 本发明采用该枯草芽孢杆菌 T122F 进行香蕉组织培养， 使用的菌株 T122F 培养原 料简单， 使用方法上操作简便， 能使香蕉丛生芽、。

18、 再生苗培养时间周期缩短、 生长健壮， 对促 进香蕉苗安全生长、 工厂化快速出苗、 节约生产成本具有重要作用和良好的经济效益 ； 获得 的香蕉组培苗生长健壮， 出苗整齐， 根系发达， 抗毒素、 抗病能力强， 在香蕉组培苗期即可完 成并获得功能菌株 T122F 对香蕉植株的诱导抗性作用， 使香蕉植株具备并提高对病害、 毒 素等条件下的抗逆能力， 可达到瓶苗假植质量标准。实施本项发明对开发一种新型的香蕉 组织培养基， 对香蕉种质资源抗性改良和创新利用具有重要作用。对拓展枯草芽孢杆菌在 香蕉组织培养中的应用新领域和香蕉抗病育种研究新途径也具有重要的实践意义。 附图说明 0017 图 1 是本发明的含。

19、 T122F 的培养基， 其中 a ： T122F 菌株 NB 培养液 ； b ： 香蕉增殖培 养基 ； c ： 含 10 T122F 菌株培养液香蕉增殖培养基 ； d ： 香蕉生根培养基 ； e ： 含 10 T122F 菌株培养液香蕉生根培养基。 0018 图2是本发明的香蕉芽各阶段长势状况， 其中a ： 丛生芽在含10T122F菌株培养 液增殖培养基中 (20 天 ) 的长势 ； b ： 丛生芽在含 10 BS08 菌株培养液增殖培养基中 (20 天 ) 的长势 ； c ： 丛生芽在空白增殖培养基中 (20 天 ) 的长势 ； d ： 丛生芽在含 10 T122F 菌 株培养液分化培养基。

20、中 (20 天 ) 的长势 ； e ： 丛生芽在空白分化培养基中 (20 天 ) 的长势。 0019 图 3 是采用本发明的 T122F 菌株进行香蕉培养和不采用 T122F 菌株进行香蕉培养 的对比状况， 其中 a ： 经 10 T122F 菌株培养液诱导处理的香蕉再生苗在 25粗毒液浸泡 72h后的症状(示耐毒性好， 叶片正常) ； b ： 未经任何处理的香蕉再生苗在25粗毒液浸泡 72h后的症状(示耐毒性差， 部份叶片萎蔫， 根变黑易断) ； c ： 经10T122F菌株培养液诱导 处理的香蕉再生苗在 25粗毒液浸泡 120h 后的症状 ( 示耐毒性好， 少数叶片萎垂、 失绿 ) ； d。

21、 ： 未经任何处理的香蕉再生苗在 25粗毒液浸泡 120h 后的症状 ( 示耐毒性差， 全部叶片 萎蔫， 失绿， 根变黑易断 ) ； e ： 经 10 T122F 菌株培养液诱导处理的香蕉再生苗枯萎病菌孢 子接种 60d 后的症状 ( 示耐病性好， 植株叶片黄化少， 球茎内部组织变褐面积少 ) ； f ： 未经 任何处理的香蕉再生苗枯萎病菌孢子接种60d后的症状(示耐病性差， 植株叶片黄化多， 有 的叶片枯死亡， 球茎内部组织变褐面积大 )。 0020 图 4 是经过本发明 T122F 菌株培养和未经过 T122F 菌株培养的香蕉苗长势比较， 其中 a ： 经 10 T122F 菌株培养液诱导。

22、处理的香蕉苗在温棚长势 ( 示叶色浓绿、 高大 ) ； b ： 未经任何处理的的香蕉苗在温棚长势 ( 示生长正常 )。 说 明 书 CN 101591629 B4/9 页 6 具体实施方式 0021 枯草芽孢杆菌的选育步骤为 ： 0022 从香蕉枯萎病病区采集健康香蕉植株， 取其假茎中间部位组织约 4g 用灭菌水冲 洗晾干后， 用 70 (V/V) 酒精表面消毒 30S 后， 再用 0.1升汞溶液 ( 取升汞 1 克加 1000 毫升蒸馏水即可得到 0.1的升汞溶液， ) 表面消毒 3.0min， 无菌水冲洗 3 次后晾干。每样 品加 10ml 无菌水碾碎， 静止 15min 后， 取 50u。

23、l 涂于 KB 培养基平板中， 28黑暗培养 48 72h， 根据枯草芽孢杆菌的菌落形态、 颜色等挑取单菌落， 按常规方法用 NA 培养基进行菌株 纯化和保存。 0023 菌株对香蕉枯萎病病原菌的生物测定采用平板对峙生长法， 即在直径为 9cm 的 PDA平板中央用接种环点接一小环菌株菌落(28下， NA上培养24h)， 同时在平板边缘接入 直径为8mm的病原真菌菌块， 28下黑暗培养57d， 进一步筛选获得对病菌生长抑制作用 明显的香蕉内生细菌 T122F。 0024 其中分离用的 KB 培养基配方为 ： 蛋白胨 20.0g， MgSO47H2O 1.5g， K2HPO4H2O 1.8g， 。

24、甘油 10.0ml， 琼脂 16.0 18.0g， 蒸馏水 1000.0ml， Ph7.2。 0025 培养用的 NA 固体培养基配方为， NA ： 蛋白胨 5.0g， 牛肉浸膏 3.0g， 葡萄糖 2.5g， 琼 脂 16.0 18.0g， 蒸馏水 1000.0ml， Ph7.0 7.2。 0026 培养用的 NB 液体培养基配方为， NB ： 蛋白胨 5.0g， 牛肉浸膏 3.0g， 葡萄糖 2.5g， 蒸 馏水 1000.0ml， Ph7.0 7.2。 0027 对峙培养用的 PDA 培养基配方为 ： 马铃薯 200.0g， 蛋白胨 5.0g， 葡萄糖 20.0g， 琼 脂 16.0 1。

25、8.0g， 蒸馏水 1000.0ml， Ph7.0 7.2。 0028 枯草芽孢杆菌 T122F 菌株在香蕉组织培养中的应用步骤依序包括 ： 0029 (1)T122F 菌株培养液的制作 ： 菌株在 28条件下用常规的细菌液体培养基振荡 培养， 培养液过滤和灭菌后备用。 0030 (2) 香蕉组织培养基的制作 ： 在 MS 基础培养基配方上， 配制香蕉丛生芽增殖培养 基、 丛生芽分化培养基和分生苗生根培养基。 0031 (3)含T122F菌株培养液的香蕉组织培养基制作 ： T122F培养液按一定体积比均匀 地添加到香蕉组织培养基中。 0032 (4) 香蕉组培材料的培养 ： 在含 T122F 。

26、培养滤液的香蕉组织培养基中移入待培养 香蕉组培材料， 并于适宜条件下培养。 0033 (5) 试验结果比较 ： 香蕉组培材料在相应培养基中生长适宜天数后， 以未处理的 香蕉组培培养基为空白对照， 比较香蕉组培材料生长情况和抗性情况。 0034 (6) 健康香蕉组培苗获得 ： 快速获得经 T122F 培养液诱导处理的、 生长健壮、 抗性 能力强的香蕉组培生根苗。 0035 实施步骤 ： 0036 本发明实施例 1 之方法依序包括 ： T122F 菌株培养液制作、 香蕉组织培养基的制 作、 含 T122F 菌株培养液的香蕉组织培养基制作、 香蕉组培材料的培养、 试验结果比较、 健 康香蕉组培苗的获。

27、得。其中 T122F 菌株分离、 保存、 培养及香蕉组织培养属于常规的植物病 理学研究法和植物组织培养学研究法。 0037 (1)T122F 无菌培养液制作 ： 菌株在 28条件下用常规的细菌 NB 液体培养基振荡 说 明 书 CN 101591629 B5/9 页 7 培养 3 天， 培养液双层滤纸过滤后， 于 121条件下湿热灭菌 20min。( 图 1a)。 0038 (2) 香蕉组织培养基的制作 ： 在 MS 基础培养基配方上， 配制香蕉丛生芽增殖培养 基、 丛生芽分化培养基和分生苗生根培养基。其中丛生芽增殖培养基为 MS 1000ml+6- 苄基 氨基嘌呤 (6-BA)5mg+ 萘乙。

28、酸 (NAA)2mg( 图 1b) ； 丛生芽分化培养基为 MS 1000ml+6- 苄基 氨基嘌呤 (6-BA)3mg+ 萘乙酸 (NAA)1mg ； 分生苗生根培养基为 MS 500ml+6- 糠基氨基嘌呤 (KT)1mg+ 萘乙酸 (NAA)1mg 和活性炭粉 +2g+ 纯水 500ml( 图 1d)。各培养基于 121条件下 湿热灭菌 20min 后备用。 0039 (3) 含 T122F 培养液的香蕉组织培养基制作 ： T122F 菌株培养液按 10体积比分 别添加至 50的香蕉丛生芽增殖培养基、 丛生芽分化培养基和分生苗生根培养基， 混匀冷 却后备用 ； ( 图 1c， e)。 0。

29、040 (4) 香蕉组培材料的培养 ： 0041 步骤 1) 丛生芽继代增殖培养 ： 在含 T122F 菌株培养液的香蕉丛生芽增殖培养基 中， 每瓶(含培养基30ml)移入香蕉品种台蕉2号丛生芽组织5块(约10个芽)， 于28 30， 光强 2000Lx、 10h 光 /14h 暗条件下培养。培养 12 15 天后， 丛生芽即可转增殖下一 代 ( 图 2a， b， c)， 0042 步骤2)丛生芽分化培养 ： 丛生芽在分化培养基中于2830， 每瓶(含培养基 30ml)， 光强 2000Lx、 12h 光 /12h 暗条件下培养 20 天后， 丛生芽分化成合格苗后即可移入生 根培养基中生根培养。

30、 ( 图 2d， e)。 0043 步骤 3) 分化苗生根培养 ： 取步骤 2) 分化苗移入含 T122F 菌株培养液的香蕉生根 培养基中， 每瓶移香蕉分化苗8株， 于2830， 光强2000Lx、 12h光/12h暗条件下培养， 培养 20 天后， 分化苗即可长出良好的根、 茎和叶 ( 图 2f， g)。 0044 (5) 试验结果比较 ： 香蕉组培材料在相应培养基中生长后， 以未处理的香蕉组培 培养基为空白对照， 抽样调查 T122F 菌株培养液处理的丛生芽鲜重增加值、 增殖数、 合格苗 分化率、 生根苗鲜重、 生根苗株高及生根苗抗毒素、 抗病菌能力， 比较香蕉组培材料生长情 况和抗性情况。

31、 ( 图 3a， b， c， d， e， f)。 0045 (6) 健康香蕉苗获得 ： 快速获得经 T122F 培养液诱导处理、 生长健壮、 抗性能力强 的、 能达到瓶苗假植质量标准的、 成株期长势健康的香蕉苗 ( 图 4a， b， )。 0046 以下实施例进一步说明本发明， 但是本发明不仅限制于此。 0047 枯草芽孢杆菌 T122F 培养液对香蕉丛生芽组织诱导效应 0048 ( 对比试验 ) 0049 一、 材料与方法 0050 1、 供试芽孢杆菌培养液制备 0051 分别将本发明的枯草芽孢杆菌 T122F 和对照菌株枯草芽孢杆菌 ( 市售， 来源于土 壤 ) 菌株在 28条件下用常规 。

32、NB 液体培养基振荡培养 3 天， 培养液双层滤纸过滤后， 于 121条件下湿热灭菌 20min。 0052 2、 供试香蕉枯萎病菌及其粗毒素制备 0053 香蕉枯萎病菌(Fusarium oxysporum f.sp.cubense)4号生理小种， 分离自田间罹 病的香蕉， 病菌在 PSA 培养基培养 7d 后 (28 )， 用无菌水配成 1106个孢子 /mL 的孢子 悬浮液供接种用。病菌在查氏培养基中振荡培养 10d(28， 140rpm)， 过滤离心 (10000rpm， 说 明 书 CN 101591629 B6/9 页 8 10min) 后， 于 70下水浴 30min， 获得的培。

33、养滤液即为病菌粗毒素液。 0054 3、 含 T122F 菌株培养液的香蕉组织培养基制备 0055 在 MS 基础培养基配方上， 配制香蕉丛生芽增殖培养基、 丛生芽分化培养基和分 生苗生根培养基， 并在这三种培养基上添加 T122F 和 BS08 培养液， 使培养液最终体积比 为 10， 并以添加 NB 培养液 (5 40 ) 或未作任何处理的培养基为对照。其中丛生芽 增殖培养基为 MS1000ml+6- 苄基氨基嘌呤 (6-BA)5mg+ 萘乙酸 (NAA)2mg ； 丛生芽分化培养 基为 MS 1000ml+6- 苄基氨基嘌呤 (6-BA)3mg+ 萘乙酸 (NAA)1mg ； 分生苗生根。

34、培养基为 MS 500ml+6- 糠基氨基嘌呤 (KT)1mg+ 萘乙酸 (NAA)1mg 和活性炭粉 +2g+ 纯水 500ml。培养基 分装于香蕉组培玻璃瓶中， 每瓶装 30ml。 0056 4、 香蕉苗的诱导处理 0057 台蕉 2 号 (AAA) 丛生芽在含菌株培养滤液的增殖培养基中增殖 20 天， 在分化培养 基中分化成苗20天后， 移入含菌株培养滤液的生根培养基中生根20天， 即可获得芽孢杆菌 培养液诱导处理的再生苗。 诱导过程中观察香蕉丛生芽及其分化苗、 生根苗的长势， 调查处 理与未处理的香蕉丛生芽增殖率、 增重、 苗分化率 ( 苗高 2cm 以上 )、 生根苗的株重、 假茎高。

35、 等生长参数。各处理共调查 50 瓶， 试验两次。丛生芽增殖培养条件为 28 30， 光强 2000Lx、 10h光/14h暗。 丛生芽在分化和分化苗生根培养条件为2830， 光强2000Lx、 12h 光 /12h 暗。 0058 5、 香蕉再生苗毒素和病菌处理 0059 取方法 4 获得的香蕉再生苗 ( 伤根并保留根长 2cm) 浸在 25的毒素稀释液中， 浸液高度至假茎 2cm 处， 120h 后调查植株萎蔫情况， 计算再生苗萎蔫指数， 每处理 10 株苗， 3 次重复。苗龄 60 天的香蕉苗 ( 伤根并保留根长 3cm) 移于花盆中， 每盆 1 株， 每株香蕉灌 孢子悬浮液 ( 浓度为。

36、 1106/ml)100ml 于香蕉苗根部， 然后覆土， 各处理 10 株苗， 3 次重复。 接菌 60d 后调查香蕉苗发病情况， 试验温度条件为 28 35， 相对温度为 90左右， 试验 两次， 并以未经菌培养液诱导处理的香蕉苗作空白对照。 0060 二、 结果分析 0061 1、 菌株培养介质 (NB 培养基 ) 对香蕉丛生芽组织增殖的影响 0062 从表1可知， 与空白对照相比， 增殖培养基含NB培养基510(V/V)对香蕉丛 生芽增殖无明显影响， 但随 NB 培养液浓度的增加， 香蕉丛生芽增殖率明显下降。考虑高浓 度的菌株培养介质对香蕉丛生芽增殖有明显影响， 因而选用 T122F 菌。

37、株培养液的 10 (V/ V) 浓度进行香蕉丛生芽诱导较为适宜。 0063 表 1 NB 培养基不同浓度处理对香蕉丛生芽组织增殖的影响 (20 天 ) 0064 处理 芽增殖率 ( ) 空白对照 111.00Aa 5 NB 108.50Aa 10 NB 115.47Aa 说 明 书 CN 101591629 B7/9 页 9 20 NB 76.92Bb 30 NB 27.25Cc 40 NB 0Dd 0065 2、 T122F 培养液对香蕉丛生芽组织增殖和重量的影响 0066 从表 2 可知， 10 (V/V)T122F 培养液对香蕉丛生芽增殖和增重有促进作用， 与空 白对照相比能明显提高丛生。

38、芽增殖率和重量增加率。与对照菌株 BS08 培养液处理相比， T122F 培养液处理的芽较粗。 0067 表 2 10 T122F 培养液对香蕉丛生芽组织增殖和增重结果 0068 处理 出芽组织率 ( ) 芽增殖率 ( ) 重量增加 率 ( ) 芽长势 T122F 97.50Aa 172.00Aa 711.88Aa 芽粗 对照菌株 (BS08) 95.90Aa 159.52Aa 381.99Bb 芽细 空白对照 91.67Aa 111.00Bb 410.78Bb 正常 0069 3、 T122F 培养液对香蕉丛生芽组织增重和分化的影响 0070 从表 3 可知， 在分化培养基中， 10 (V/。

39、V)T122F 培养液对香蕉丛生芽增殖仍有明 显促进作用， 其处理的香蕉丛生芽分化成标准苗率为 51.97， 明显高于两种对照。T122F 培养液处理的分化苗较壮、 高、 叶色浓绿。 0071 表 3 10 T122F 培养液对香蕉丛生芽分化影响 0072 供试菌株 芽苗增殖率 ( ) 分化苗率 * ( ) 苗长势 T122F 125.63Aa 51.97Aa 苗壮、 高、 叶色浓 绿 对照菌株 (BS08) 104.17Bb 40.48Bb 苗偏弱、 叶色正常 空白 92.86Bc 45.95ABc 正常 说 明 书 CN 101591629 B8/9 页 10 0073 * 注 ： 分化标。

40、准苗指高为 2cm 以上的芽。 0074 4、 T122F 培养液诱导获得的香蕉再生苗长势及抗性能力 0075 从表 4 可知， 丛生芽经 T122F 培养液诱导增殖、 分化和生根后获得的香蕉再生苗 生根正常， 与空白对照相比， 诱导后的香蕉苗壮、 高、 叶色浓绿、 茎粗、 根系旺， 标准苗率达 100， 标准苗耐毒、 假植苗耐病能力均比空白对照好。 0076 表 4 T122F 培养液诱导处理后香蕉再生苗长势及抗性能力比较 0077 处理 株重 (g/ 株 ) 假茎高 (cm/ 株 ) 标准苗率 * ( ) 标准苗萎蔫指数 ( ) 假植苗病情指数 ( ) T122F 1.30Aa 4.43A。

41、a 100.00Aa 6.67Bb 61.90Bb 空白 0.82Bb 3.10Bb 82.37Bb 76.54Aa 82.14Aa 0078 * 注 ： 标准瓶苗为苗无污染， 根系粗状， 有2条以上的白色根 ； 假茎高约2.5-3cm， 茎 直径约 0.3cm， 假茎为绿色 ； 有 2 片以上的自然叶， 叶色浓绿。 0079 三、 结果评价 0080 1、 枯草芽孢杆菌T122F具有抗病、 促生功能， 其培养保存方便， 采用常规的NB细菌 培养基及冷冻、 冷藏保存均可。 0081 2、 T122F 培养液以 10体积比添加到香蕉丛生芽增殖培养基、 分化培养基和生根 培养基中， 有助于香蕉丛生。

42、芽的殖增、 分化、 生根和再生苗生长， 提高香蕉苗的标准出苗率。 丛生芽在含 10 T122F 培养液的增殖培养基中培养 12 15 天即可转增殖下一代， 丛生芽 分化培养 20 天后， 分化苗比率明显高于枯草芽孢杆菌 BS08 培养液处理及空白对照。 0082 3、 T122F 培养液诱导处理的丛生芽增殖率高、 芽粗， 分化苗壮、 高、 叶色浓绿， 长势 均优于枯草芽孢杆菌 BS08 培养液处理及空白对照。由 T122F 培养液诱导处理获得的香蕉 再生苗生根正常， 苗壮、 高、 叶色浓绿、 茎粗、 标准苗率达 100， 标准苗耐毒、 假植苗耐病能 力均比空白对照好， 香蕉苗种于温棚中长势均良。

43、好。 0083 4、 采用本发明可缩短香蕉组培苗培养时间， 节约成本， 提高组培苗出苗率和标准 率， 优化组培苗长势， 提高组培苗的抗性， 对促进香蕉健康苗工厂化快速出苗具有重要作用。 0084 核苷酸序列表 0085 福建省农业科学院植物保护研究所 0086 一种枯草芽孢杆菌及其在香蕉组织培养中的应用 0087 1 0088 1 0089 0090 DNA 0091 枯草芽孢杆菌 (Bacillus subtilis) 0092 0093 该枯草芽孢杆菌 (Bacillus subtilis)T122F 菌株 16S rDNA 总长 1353。 说 明 书 CN 101591629 B9/9。

44、 页 11 0094 1 0095 tgctccatga ttcagcggcg gacgggtgag taatgcctag gaatctgcct ggtagtgggg 60 0096 gacaacgttt cgaaaggaac gctaataccg catacgtcct acgggagaaa gtgggggatc 120 0097 ttcggacctc acgctatcag atgagcctag gtcggattag ctagttgttg aggtaaaggc 180 0098 tcaccaaggc gacgatccgt aactggtctg ataggatgat cagtccacct gga。

45、actgaga 240 0099 cacggtccag actcctacgg gaggcagcag tggggaatat tggagaatgg gcgaaaggct 300 0100 gatccagcca tgccgcgtgt gtgaagaagg tcttcggatt gtaaagcact ttaagttggg 360 0101 aggaagggca gttagttaat accttgctgt tttgacgtta ccaacagaat aagcaccggc 420 0102 taacttcgtg ccagcagccg cggtaatacg aagggtgcaa gcgttaatcg gaa。

46、ttactgg 480 0103 gcgtaaagcg cgcgtaggtg gttcgttaag ttggatgtga aagccccggg ctcaacctgg 540 0104 gaactgcatc caaaactggc gagctagagt atggcagagg gtggtggaat ttcctgtgta 600 0105 gcggtgaaat gcgtagatat aggaaggaac accagtggcg aaggcgacca cctgggctaa 660 0106 tactgacact gatgtgcgaa agcgtgggga gcaaacagga ttagataccc tgg。

47、tagtcca 720 0107 cgccgtaaac gatgtcgact agccgttggg atccttgaga tcttagtggc gcagctaacg 780 0108 cattaagtcg accgcctggg gagtacggcc gcaaggttaa aactcaaatg aattgacggg 840 0109 ggcccgcaca agcggtggag catgtggttt aattcgaagc aacgcgaaga accttaccag 900 0110 gccttgacat gcagagaact ttccagagat ggattggtgc cttcgggaac tct。

48、gacacag 960 0111 gtgctgcatg gctgtcgtca gctcgtgtcg tgagatgttg ggttaagtcc cgtaacgagc 1020 0112 gcaacccttg ttcttagtta ccagcacgtt aaggtgggca ctctaaggag actgccggtg 1080 0113 acaaaccgga ggaaggtggg gatgacgtca agtcatcatg gcccttacgg cctgggctac 1140 0114 acacgtgcta caatggtcgg tacaaagggt tgccaagccg cgaggtggag 。

49、ctaatcccat 1200 0115 aaaaccgatc gtagtccgga tcgcagtctg caactcgact gcgtgaagtc ggaatcgcta 1260 0116 gtaatcgtga atcagaatgt cacggtgaat acgttcccgg gccttgtaca caccgcccgt 1320 0117 cacaccatgg gagtggtttg ctccagaagt agc 1353 说 明 书 CN 101591629 B1/4 页 12 图 1 说 明 书 附 图 CN 101591629 B2/4 页 13 图 2 说 明 书 附 图 CN 101591629 B3/4 页 14 图 3 说 明 书 附 图 CN 101591629 B4/4 页 15 图 4 说 明 书 附 图 。