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1、(10)授权公告号 (45)授权公告日 (21)申请号 201410608337.0 (22)申请日 2014.11.03 C07D 307/94(2006.01) A61K 31/343(2006.01) A61P 25/00(2006.01) A61P 25/28(2006.01) (73)专利权人 南昌大学 地址 330031 江西省南昌市红谷滩新区学府 大道 999 号 (72)发明人 毛水春 章海燕 郭跃伟 刘定权 (74)专利代理机构 南昌新天下专利商标代理有 限公司 36115 代理人 施秀瑾 (54) 发明名称 生育螺醌在制备神经保护药物中的应用 (57) 摘要 本发明涉及一种。
2、化合物 生育螺醌及其 制备方法和用途。该化合物是从总状蕨藻中采用 提取、 减压浓缩、 萃取、 硅胶柱色谱法以及凝胶柱 色谱法纯化而得到的 - 生育螺醌， 其结构是由 理化常数测定及波谱数据分析而确定的。经初步 的活性筛选试验证明 ： 该化合物对 淀粉样蛋白 2535(A25-35) 损伤的 SH-SY5Y 细胞具有显著的 保护作用， 可用于制备神经保护剂和防止阿尔茨 海默症药物。 (51)Int.Cl. 审查员 赵冬梅 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利 权利要求书1页 说明书3页 附图1页 CN 104387353 B 2016.06.22 CN 104387353 B 。
3、1. 生育螺醌在制备保护经A 25-35损伤的SH-SY5Y细胞的药物中的用途。 2. 生育螺醌在制备神经保护药物和防治阿尔茨海默症药物的用途。 权利要求书 1/1 页 2 CN 104387353 B 2 生育螺醌在制备神经保护药物中的应用 技术领域 0001 本发明涉及一种从总状蕨藻中提取 生育螺醌及其制备方法； 本发明还涉及该化 合物为对A 25-35损伤的SH-SY5Y细胞具有保护作用的活性成分， 从而它可用于制备神经保护 药物和防治阿尔茨海默症药物。 背景技术 0002 总状蕨藻Caulerparacemosa(Forsskl)J.Agardh系绿藻门(Chlorophyta) 绿藻。
4、纲(Chlorophyceae)管藻目(Siphonales)蕨藻科(Caulerpaceae)蕨藻属 （Caulerpa） 海洋植物， 主要分布于热带和亚热带海域， 生长在潮间带以下的岩石、 珊瑚礁上 或者中、 低潮带的沙地上。 在我国海域也有广泛分布， 主要集中于福建东山、 台湾、 海南、 西 沙、 广东沿海。 国内外研究表明， 总状蕨藻中含有倍半萜类、 二萜类、 甾体类、 甘油酯类、 芳香 类、 酰胺类及生物碱类等成分(Alarif,W.M.etal,Clean:Soil,Air,Water, 2010,38(5-6),548557； Wang,H.etal,BotanicaMarina。
5、,2007,50(3),185190; Ayyad,S.-E.N.etal,AlexandriaJournalofPharmaceuticalSciences,1994,8 (3),217219;Anjaneyulu,A.S.R.etal,JournalofNaturalProducts,1992, 55(4),496499)。 其中多数萜类化合物含有天然界罕见的1,4-二乙酰氧基 （醛基） 丁二烯 结构片断， 而生物碱类则为结构奇特的双吲哚类化合物。 现代药理学研究表明， 从总状蕨藻 中发现的次级代谢产物经常表现出很强的抗菌、 抗炎、 抗病毒、 杀虫、 抗肿瘤及毒鱼等多样 的生物活性 （An。
6、janeyulu,A.S.R.etal,Phytochemistry,1991,30(9),3041- 3042;Anjaneyulu,A.S.R.etal,JournaloftheIndianChemicalSociety, 1991,68(8),480;Capon,R.J.Phytochemistry,1983,22(6),1465-1467; Nielsen,P.G.etal,Phytochemistry,1982,21(7),16431645;Doty,M.S.et al,Nature,1966,211(5052),990） 。 发明内容 0003 本发明在于提供一种化合物 生育螺醌及。
7、其制备方法和用途。 该化合物是从总状 蕨藻中采用提取、 减压浓缩、 萃取、 硅胶柱色谱法以及凝胶柱色谱法纯化而得到的 生育螺 醌， 其结构是由理化常数测定及波谱数据分析而确定的。 经药理试验研究表明， 该化合物对 A 25-35损伤的SH-SY5Y细胞具有显著的保护作用。 0004 因此， 本发明的一个目的是提供一种从总状蕨藻中制备化合物 生育螺醌的方 法。 0005 本发明的另一个目的是提供化合物 生育螺醌的用途。 具体地说， 该化合物对A 25-35损伤的SH-SY5Y细胞具有显著的保护作用， 可用于制备神经保护剂和防治阿尔茨海默 症的药物。 0006 根据本发明的第一个目的， 本发明提供。
8、一种从总状蕨藻中采用提取、 减压浓缩、 萃 取、 硅胶柱色谱法以及凝胶柱色谱法制备化合物 生育螺醌的方法， 具体步骤如下： 说明书 1/3 页 3 CN 104387353 B 3 0007 1） 制备提取物浸膏 0008 将冷冻的总状蕨藻 （C.racemosa） 常温下解冻， 用乙醇按常规渗漉提取三次， 每次 24小时， 得提取液， 将提取液减压浓缩回收乙醇， 得粗浸膏； 0009 2） 分离纯化 0010 (1)将上述粗浸膏分散于水中成混悬液， 将混悬液依次用石油醚、 乙酸乙酯和正 丁醇分别萃取三次， 所得萃取液浓缩分别得到石油醚提取浸膏、 乙酸乙酯提取浸膏和正丁 醇提取浸膏； 0011。
9、 (2)将乙酸乙酯浸膏进行硅胶柱层析， 以石油醚/丙酮梯度洗脱， 根据TLC显色合 并相似流份得到5个组分A、 B、 C、 D、 E； 其中组分C即石油醚/丙酮体积比8:2和7:3洗脱部分依 次经SephadexLH-20凝胶柱层析 （以二氯甲烷/甲醇洗脱） 、 硅胶柱层析 （以石油醚/二氯甲 烷体积比为6:44:6梯度洗脱） ， 得到化合物 生育螺醌， 化学名为 -tocospirone， 化学结 构式为： 0012 0013 在上述制备方法中， 在制备提取物浸膏步骤中， 所述提取采用的乙醇为95%乙醇。 0014 在上述制备方法中， 在分离纯化步骤中， 所述SephadexLH-20凝胶柱。
10、层析中用的 二氯甲烷/甲醇洗脱浓度为体积比1:1。 0015 根据本发明的第二个目的， 本发明提供了 生育螺醌的用途。 0016 本发明采用MTT法测试了 生育螺醌拮抗A 25-35引起的神经母细胞瘤SH-SY5Y细胞 存活率下降的活性。 实验证实， 生育螺醌对上述模型中的SH-SY5Y细胞损伤具有明显的保 护作用。 0017 因此， 本发明的 生育螺醌可用作制备保护神经细胞(例如， 经A 25-35损伤的SH- SY5Y细胞)的药物， 进而可用作制备神经保护药物和防治阿尔茨海默症药物。 附图说明 0018 图1： 生育螺醌在不同浓度下对A 25-35诱发的SH-SY5Y细胞损伤的细胞存活率柱。
11、 状图。 具体实施方式 0019 实施例1 生育螺醌的制备 0020 (1)将冷冻的中国总状蕨藻 （C.racemosa）（采自广东湛江沿海） 5kg （干重） 分 别用30L95%乙醇渗漉提取三次， 每次渗漉1天， 合并提取液； 0021 (2)将上述提取液在温度 45减压浓缩回收乙醇， 得粗浸膏350g； 将该提取物 浸膏分散于水中成混悬液， 将混悬液依次用石油醚 （1.5L） 、 乙酸乙酯 （1.5L） 和正丁醇 （1L） 分别萃取三次， 所得萃取液减压浓缩分别得到石油醚提取浸膏 （38g） 、 乙酸乙酯提取浸膏 （160g） 和正丁醇提取浸膏 （120g） ； 说明书 2/3 页 4 。
12、CN 104387353 B 4 0022 (3)将乙酸乙酯浸膏进行硅胶柱层析， 以石油醚/丙酮梯度洗脱， 根据TLC显色合 并相似流份得到5个组分 （A-E） ； 其中组分C即石油醚/丙酮体积比8:2和7:3洗脱部分依次经 SephadexLH-20凝胶柱层析 （二氯甲烷/甲醇体积比1:1洗脱） 、 硅胶柱层析 （石油醚/二氯甲 烷体积比为6:44:6梯度洗脱） ， 得到化合物 生育螺醌。 0023 实施例2 生育螺醌对A 25-35诱导SH-SY5Y胞损伤的保护作用 0024 1、 实验样品及实验方法 0025 被测样品溶液的配制： 测试样品为上述实施例1中制备的纯品化合物 生育螺醌。 准。
13、确称取适量样品， 用DMSO配制成所需浓度的溶液， 供药理活性测试。 0026 细胞系及细胞的继代培养： 活性测试采用SH-SY5Y细胞系(购自美国ATCC (Americantypeculturecollection)。 用含10FBS的DMEM培养基， 在37通入5 二氧化碳的培养箱中继代培养。 0027 细胞活性测试方法(MTT法)： 本发明采用MTT法， 测试评价了被测试样品对A 25-35导致SH-SY5Y细胞活力下降的保护作用。 活细胞线粒体中脱氢酶能够代谢还原黄色的 溴化3-(4， 5-二甲基噻唑)-2， 5-二苯基四氮唑为蓝紫色的不溶于水的甲簪(formazan)， 甲簪的多少。
14、可通过酶标仪测定其吸收度求得。 由于formazan的量与活细胞成正比， 所以可 根据吸收度求出活细胞的数目， 从而了解被测样品对细胞的影响。 0028 活性测试时， 取对数生长期的SH-SY5Y细胞， 用新鲜的DMEM培养基配制成密度为 每毫升5104个细胞的细胞悬液， 按每孔100 L接种于96孔板中， 培养24h后加入药液10 L/孔， 对每个浓度均设六个复孔， 另设空白对照和模型组。 细胞在37、 5二氧化碳条件下 培养2h后， 除空白对照组外， 每孔加入A 25-35(最终浓度为1 M)损伤细胞， 37、 5CO2条 件下培养24h后， 每孔加入MTT溶液10L(5mg/mL)， 继。
15、续培养4h后， 仔细去上清， 加入 DMSO100 L/孔， 然后用酶标仪测OD570/630值。 按下列公式计算被测物对细胞的保护作用： 0029 存活率%=100给药组OD/对照组OD 0030 结果评价： 被测样品组的存活率越高， 测试样品对细胞的保护作用越强。 0031 2、 实验结果 0032 生育螺醌对A25-35诱导SH-SY5Y胞损伤的保护作用活性结果见图1。（#P 0.01相比于空白对照组， *P0.01相比于模型组)： 生育螺醌在10 M浓度时对A 25-35引起的SH-SY5Y细胞损伤有明显的保护作用。 0033 3、 结论 0034 生育螺醌在低浓度下对神经母细胞瘤细胞具有明显的保护作用， 从而可用作制 备神经保护药物和防治阿尔茨海默症药物。 0035 实施例3 0036 取实施例1所得化合物， 添加常用药物辅料， 制成片剂、 胶囊、 口服剂等剂型。 说明书 3/3 页 5 CN 104387353 B 5 图 1 说明书附图 1/1 页 6 CN 104387353 B 6 。