一种检测甲型H1N1流感病毒的试剂盒及专用引物和靶序列.pdf

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1、(10)授权公告号 CN 101591715 B (45)授权公告日 2011.08.10 CN 101591715 B *CN101591715B* (21)申请号 200910087632.5 (22)申请日 2009.07.01 C12Q 1/70(2006.01) C12Q 1/68(2006.01) C12N 15/11(2006.01) C12R 1/93(2006.01) (73)专利权人 中国人民解放军军事医学科学院 基础医学研究所 地址 100094 北京市海淀区太平路 27 号 (72)发明人 徐东刚 李伍举 蔡欣 付文亮 曹源 邹民吉 (74)专利代理机构 北京众合诚成知。

2、识产权代理 有限公司 11246 代理人 史双元 CN 101376912 A,2009.03.04, 朱泽轶 .A /H1N1 流感的流行特点及防 治 .医学研究杂志 .2009, 第 38 卷 ( 第 5 期 ),4-6. Masahiro Ito et al.Rapid detection and typing of influenza A and B by loop-mediated isothermal amplification: Comparison with immunochromatography and virus isolation.Journal of Virologi。

3、cal Methods .2006, 第 135 卷 272275. Leo L. M. Poon et al.Detection of Human Influenza A Viruses by Loop-Mediated Isothermal Amplification.JOURNAL OF CLINICAL MICROBIOLOGY .2005, 第 43 卷 ( 第 1 期 ),427430. (54) 发明名称 一种检测甲型 H1N1 流感病毒的试剂盒及专 用引物和靶序列 (57) 摘要 本发明公开了一种属于病原体基因快速诊断 领域的检测甲型 H1N1 流感病毒的专用引物和包 括该引物。

4、的检测甲型 H1N1 流感病毒的试剂盒以 及该引物所对应的靶序列。本发明的专用引物所 对应的靶序列， 其碱基序列如 SEQ ID No.1 所示， 该试剂盒利用基因反转录和等温扩增技术原理， 对甲型 H1N1 病毒核酸进行快速检测， 检测结果可 肉眼判定， 也可利用电泳进行分析。 该试剂盒具有 快速、 敏感、 特异和操作方便的特点。 (51)Int.Cl. (56)对比文件 审查员 杨佳倩 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利 权利要求书 1 页 说明书 9 页 附图 2 页 CN 101591715 B1/1 页 2 1.一种检测甲型H1N1流感病毒的专用引物， 由4条特异。

5、性引物组成， 其特征在于， 所述 4 条特异性引物的序列分别为 ： 引物 F1 核苷酸序列如序列表中 SEQ ID No.2 所示， 引物 B1 核苷酸序列如序列表中 SEQ ID No.3 所示， 引物 F2 核苷酸序列如序列表中 SEQ ID No.4 所 示， 引物 B2 核苷酸序列如序列表中 SEQ ID No.5 所示。 2. 一种检测甲型 H1N1 流感病毒的试剂盒， 其特征在于， 包括含有权利要求 1 所述专用 引物的反应预混液。 3. 根据权利要求 2 所述的检测甲型 H1N1 流感病毒的试剂盒， 其特征在于， 所述反应 预混液为下述成分的混合液且各成分的终浓度为 ： 引物 F。

6、1 1.76M ； 引物 B 1 1.76M ； 引 物 F2 0.29M ； 引 物 B2 0.29M ； dNTP 2.05mM ； 1.47Bst DNA 聚 合 酶 缓 冲 液 ； MgSO411.76mM ； 甜菜碱 1.47M。 4. 根据权利要求 3 所述的检测甲型 H1N1 流感病毒的试剂盒， 其特征在于， 所述试剂盒 还包括 Bst DNA 聚合酶、 RNA 酶抑制剂、 AMV 反转录酶和无 RNA 酶的 ddH2O。 5. 根据权利要求 4 所述的检测甲型 H1N1 流感病毒的试剂盒， 其特征在于， 所述试剂盒 还包括 SYBR Green I。 6. 根据权利要求 5 所。

7、述的检测甲型 H1N1 流感病毒的试剂盒， 其特征在于， 所述试剂盒 还包括阳性模板和阴性模板。 7. 一种非诊断目的的检测甲型 H1N1 流感病毒的方法， 其特征在于， 以被检测样品的总 RNA 为模板， 利用权利要求 2-6 任一项所述的检测甲型 H1N1 流感病毒的试剂盒进行环介导 反转录等温扩增反应， 然后鉴定被检测样品是否为甲型 H1N1 流感病毒阳性。 8. 根据权利要求 7 所述的方法， 其特征在于， 所述环介导反转录等温扩增反应的程序 为 62反应 60min ； 然后 80加热 2min 终止反应。 9. 根据权利要求 7 所述的方法， 其特征在于， 所述鉴定被检测样品是否为。

8、甲型 H1N1 流 感病毒阳性的方法为下述方法中的一种或多种 ： (1) 利用反应沉淀浊度来判定， 见白色沉淀为阳性 ； (2) 反应产物中加入荧光染料 SYBR Green I 来判定， 呈绿色为阳性 ； (3) 通过电泳分析判定， 见梯状条带为阳性。 权 利 要 求 书 CN 101591715 B1/9 页 3 一种检测甲型 H1N1 流感病毒的试剂盒及专用引物和靶序 列 技术领域 0001 本发明涉及一种检测流感病毒的试剂盒， 具体涉及一种检测甲型 H1N1 流感病毒 的试剂盒、 专用引物和该引物所针对的靶序列。 背景技术 0002 自 2009 年 4 月中下旬起， 源自北美的甲型 。

9、H1N1 流感疫情开始在全球多个国家蔓 延， 截至北京时间六月九日十四时， 世界卫生组织确认全球七十四个国家和地区共有 25288 例甲型 H1N1 流感确诊病例， 其中包括死亡病例 139 例。至此， 中国内地共报告 101 例甲型 H1N1 流感确诊病例。甲型 H1N1 流感已对人类健康产生严重威胁， 严重危害了人们健康， 并 造成重大的经济损失。快速、 准确地进行流感病毒的检测是防控甲型 H1N1 流感的关键， 一 方面为防治提供依据和争取时间， 另外可以减轻或消除社会恐慌心理。 因此快速、 敏感和特 意的检测试剂盒的研制具有重大应用价值和社会意义。 0003 2000 年， 日本学者 。

10、Notomi 等发明了一种新的恒温核酸扩增方法 (Notomi T. 等， Nucleic Acids Res， 2000， 28， E63)， 即环介导等温扩增法 (Loop-mediatedisothermal amplification)， 其特点是针对靶基因的多个区域设计特异引物， 利用一种链置换 DNA 聚 合酶在等温条件 65下进行反应， 通过引物独特的反转设计， 对自身进行链置换扩增， 通常 60 分钟内即可完成反应。不需要模板的热变性、 退火、 长时间温度循环等过程。其扩增效 率较高， 可在 60 分钟内将靶序列扩增 109 1010倍， 一般能检测到 10 拷贝以下的样品。由。

11、 于其引物分别针对多个不同的区域， 任何一个不匹配反应就无法进行， 因此出现非特异性 扩增的情况极少。相关方法已用于早期 SARA 疾病的诊断和肺炎结核杆菌等检测 (PoonL. L. 等， Clin Chem， 2004， 50(6) ： 1050-1052 ； Boehme， C.C. 等， Clin.Microbiol.， 2007， 45， 1936-1940)。通过逆转录酶环介导等温扩增法 (reverse transcriptionloop-mediated isothermal amplification) 已运用于 HIV-1 病毒 (Kelly A. 等， Journalof。

12、 Virological Methods， 2008， 151， 264-270)， 禽流感病毒 H5、 H5N 1 和 H9 等的快速诊断 (Imai M. 等， Vaccine， 2006， 24(44-46) ： 6679-6682 ； Imai M. 等， J VirolMethods， 2007， 141(2) ： 173-80 ； Chen HT等， J Virol Methods， 2008， 151(2) ： 200-3)。 该方法对于低浓度的病毒数 量或无症状的病毒携带者的检测比 RT-PCR 好， 目前尚未见到利用反转录和等温扩增一体 化检测甲型 H1N1 流感病毒核酸试剂。

13、盒的报道。 0004 目前， 检测甲型H1N1流感病毒使用的试剂盒主要利用PCR方法和实时定量RT-PCR 方法。 PCR方法灵敏度和特异性均要低于环介导等温扩增法， 且操作步骤繁琐， 反应时间长 ； 而实时定量 RT-PCR 方法检测需要昂贵的实时定量 PCR 仪， 且结果需要计算机分析。 发明内容 0005 本发明的目的在于提供一种检测甲型 H1N1 流感病毒的专用引物。 0006 本发明的目的也在于提供一种含有上述专用引物的检测甲型 H1N1 流感病毒的试 说 明 书 CN 101591715 B2/9 页 4 剂盒。 0007 本发明的目的还在于提供上述专用引物的靶序列。 0008 一。

14、种检测甲型 H1N1 流感病毒的专用引物， 由 4 条特异性引物组成， 所述 4 条特异 性引物的序列分别为 ： 引物F1具有序列表中SEQ ID No.2的核苷酸序列， 引物B1具有序列 表中SEQ ID No.3的核苷酸序列， 引物F2具有序列表中SEQ IDNo.4的核苷酸序列， 引物B2 具有序列表中 SEQ ID No.5 的核苷酸序列。 0009 一种检测甲型 H1N1 流感病毒的试剂盒， 包括含有上述专用引物的反应预混液。 0010 所述反应预混液为下述成分的混合液且各成分的终浓度分别为 ： 引物F11.76M ； 引物 B1 1.76M ； 引物 F2 0.29M ； 引物 B。

15、2 0.29M ； dNTP 2.05mM ； 1.47Bst DNA 聚合 酶缓冲液 ； MgSO4 11.76mM ； 甜菜碱 1.47M。 0011 所述试剂盒还包括 Bacillus stearothermophilus(Bst)DNA 聚合酶、 RNA 酶抑制 剂、 AMV 反转录酶和无 RNA 酶的 ddH2O。 0012 所述试剂盒还包括 SYBR Green I。 0013 所述试剂盒还包括阳性模板和阴性模板。 0014 以检测 20 份样品的试剂盒为例， 试剂盒组份包括 ： 40U/L RNase 抑制剂， 8U/L Bst DNA 聚合酶和 5U/L AMV 反转录酶， 各。

16、 1 管， 每管 21L ； 无 RNA 酶 ddH2O 1 管 100L ； 500SYBR Green I 1管42L ； 阳性模板、 阴性模板各1管25L， 浓度分别为1.4110-21M 和 1.310-20M ； 反应预混液 20 管， 各 17L。其中， 反应预混液中各成分的终浓度为 ： 引 物 F1 1.76M ； 引 物 B1 1.76M ； 引 物 F2 0.29M ； 引 物 B2 0.29M ； dNTP 2.05mM ； 1.47Bst DNA 聚合酶缓冲液 ； MgSO4 11.76mM ； 甜菜碱 1.47M。其中， 阳性模板为 HA1 RNA， 阴性模板为大肠杆菌。

17、 RNA。 0015 一种检测甲型 H1N1 流感病毒的方法， 以被检测样品的总 RNA 为模板， 利用本发明 的检测甲型 H1N1 流感病毒的试剂盒进行环介导反转录等温扩增反应， 然后鉴定被检测样 品是否为甲型 H1N1 流感病毒阳性。 0016 所述被检测样品为疑似甲型 H1N1 流感病毒感染者的呼吸道样本或血清， 如呼吸 道分泌物、 痰液、 鼻拭子、 咽拭子、 鼻腔吸取物、 鼻腔冲洗液等。采用常规方法或 RNA 提取试 剂盒从样本中提取病毒总 RNA。 0017 所述环介导反转录等温扩增反应的 25L 体系中包括 ： 17L 反应预混液， 2L 样品总 RNA， 1L Bst DNA 聚。

18、合酶， 1L AMV 反转录酶， 1L RNase 抑制剂， 3L 无 RNA 酶 ddH2O。 0018 所述环介导反转录等温扩增反应的程序为 62反应 60min ； 然后 80加热 2min 终止反应。 0019 所述鉴定被检测样品是否为甲型 H1N1 流感病毒阳性的方法为下述方法中的一种 或多种 ： 0020 (1) 利用反应沉淀浊度来判定， 见白色沉淀为阳性 ； 0021 (2) 反应产物中加入荧光染料 SYBR Green I 来判定， 呈绿色为阳性 ； 0022 (3) 通过电泳分析判定， 见梯状条带为阳性。 0023 一种上述专用引物的靶序列， 所述靶序列的碱基序列如 SEQ 。

19、ID No.1 所示。上述 的专用引物是通过甲型H1N1流感病毒核酸HA区的保守序列， 即上述的靶序列设计出来的。 说 明 书 CN 101591715 B3/9 页 5 0024 本发明的有益效果 ： 不需要其他昂贵的器材， 只需要一个恒温水浴锅就能进行 ； 结果鉴定方法简单 ； 检测时间短， 特异性强， 灵敏度高， 可用于临床和科研。 附图说明 0025 图 1 是 PCR 扩增甲型 H1N1 病毒 HA1 片段的电泳结果 ； 0026 M ： DL2000 ； 1 ： HA1 基因 0027 图 2 是反转录等温扩增一体化方法灵敏度检测结果 ； 0028 M ： DL2000 ； 1 9。

20、 ： 模板浓度 2.2108 2 拷贝， 浓度依次相差 10 倍 ； 0029 10， 11 ： 阴性对照， ddH2O 质控对照 0030 图 3 是 RT-PCR 灵敏度检测结果 ； 0031 M ： DL2000 ； 1 ： 阴性对照 ； 2 9 ： 模板浓度 2.2108 2 拷贝， 浓度依次相差 10 倍 0032 图 4 是反转录等温扩增一体化检测试剂盒特异性结果 ； 0033 M ： DL2000 ； 1-3 ： 3 株不同亚型的春季 H1N1 流感病毒 RNA ； 4-6 ： 3 株不同亚型的春 季 H3N2 流感病毒RNA ； 7 ： 以人全血提总RNA为模板检测 ； 8 ：。

21、 质控阳性对照 ； 9 ： 系统以ddH2O 为模板阴性对照 ； 10 ： 大肠杆菌总 RNA 为模板阴性对照。 具体实施方式 0034 以下实施例未说明的实验步骤参照 分子克隆实验指南 第二版， 或参照相应试剂 盒的说明书。 0035 实施例 1 设计用于检测甲型 H1N1 病毒的靶序列和专用引物 0036 (1) 设计用于检测甲型 H1N1 病毒的靶序列 0037 根据 Genebank 报道的甲型 H1N1 基因的序列， 序列号 GI ： 227977103， 运用生物信 息学分析整个流感病毒库， 并筛选出特异的针对甲型H1N1核酸HA区靶序列HA1， 位于HA全 基因的第 301 位碱。

22、基至第 580 位碱基。其碱基序列如 SEQ ID No.1 所示。 0038 (2) 设计用于检测甲型 H1N1 病毒靶序列的特异引物 0039 方法如下 ： 根据 Genebank 中序列号为 GI ： 227977103 的甲型 H1N1 流感病毒核酸 HA 区段基因序列和上述筛选出的特异针对 H1N1 基因的 HA 区靶序列 HA1， 应用引物设计与 特异性分析为一体的软件工具 BioSun 设计检测甲型 H1N1 病毒的 4 条特异性的专用引物 ： 0040 F1 ： GCCATGAACTTGTCTTGGGGAGAGAGCAATTGAGCTCAGT(SEQID No.2) ； 004。

23、1 B1 ： CAAAGGTGTAACGGCAGCATGAATTTCCTTTTTTAACTAGCCA(SEQ ID No.3) ； 0042 F2 ： ACCCAGGAGATTTCATCG(SEQ ID No.4) ； 0043 B2 ： CTTTCCCTTTATCATTAATGTAGGA(SEQ ID No.5)。 0044 实施例 2 本发明试剂盒阳性对照 HA1RNA 片段的制备 0045 (1)pMD-20T-HA1 质粒的构建 0046 将购自上海生工生物工程技术服务有限公司的重组表达质粒 pBluescript IISK(+)-HA1取1ul， 采用CaCl2方法转化感受态细胞DH。

24、5， 利用含有氨苄青霉素抗性的LB 固体培养基筛选出重组克隆， 提取质粒。以提取的含有 HA1 的 pBluescript II SK(+)-HA1 的质粒为模板， 以 F2 即碱基序列为 SEQ ID No.4 和 B2 即碱基序列为 SEQ ID No.5 为引物， PCR 扩增 HA1 片段， 反应体系为 20L ： 说 明 书 CN 101591715 B4/9 页 6 0047 pBluescript II SK(+)-HA1 质粒 (0.5g) ： 1L 0048 F2(5M) ： 0.5L 0049 B2(5M) ： 0.5L 0050 dNTP(2.5mM) ： 1.6RNA 。

25、0051 10PCR buffer ： 2L 0052 Taq 酶 (5U/L) ： 0.2L 0053 ddH2O ： 加到 20L 0054 94， 2min ； 然后94， 30sec ； 55， 30sec ； 72， 30sec反应30个循环 ； 72延伸 7min。 0055 扩增产物经 1.5的琼脂糖凝胶电泳鉴定， 扩增片段长度为 243bp， 结果见图 1， 经 纯化后的 HA1 片段与购自 Takara 生物技术有限公司的 pMD-20T 载体进行连接， 采用 CaCl2 方法转化感受态细胞 DH5， 利用蓝白斑筛选重组克隆， 提取质粒， 并用 pMD-20T 载体上游 引物。

26、 ： 5 -GAGCGGATAACAATTTCACACAGG-3 (SEQ ID No.6) 与 HA1 片段的下游引物 5 -C TTTCCCTTTATCATTAATGTAGGA-3 (SEQ ID No.5)， 进行 PCR 扩增， 以筛选和鉴定 HA1 片段正 向插入的重组载体 pMD-20T-HA1， 正向插入时扩增的片段长度为 317bp， 并对 PCR 鉴定为正 向插入的重组载体进行测序鉴定。该 PCR 的扩增条件和反应体系与上述的以 pBluescript II SK(+)-HA1质粒为模板扩增HA1片段相同， 仅模板和引物不同。 PCR产物经1.5琼脂糖 凝胶电泳鉴定。 005。

27、6 其中质粒 DNA 的提取、 酶切反应、 感受态细胞 DH5 的制备及转化等操作均参照 分子克隆实验指南 第二版 (J. 萨姆布鲁克 E.F. 弗里奇等， 科学出版社， 1996)。 0057 (2)HA1 基因的转录 0058 将鉴定正向插入的重组 pMD-20T-HA1 质粒用 BamH I 酶切后回收做为模板， 用 SP6RNA 聚合酶进行转录反应， 以下反应试剂购自 Takara， 反应体系如下 ： 0059 pMD-20T-HA1 线性化回收产物 ： 1ul 0060 二硫苏糖醇 (DTT)(100mM) ： 2ul 0061 0.1 BSA ： 2ul 0062 10SP6RNA。

28、 聚合酶缓冲液 ： 2ul 0063 NTP 混合物 (10mM) ： 4ul 0064 RNA 酶抑制剂 (40U/L) ： 0.5ul 0065 SP6RNA 聚合酶 (10-50U/L) ： 1ul 0066 ddH2O ： 5.5ul 0067 反应条件 37， 1h， 得到相应的 HA1 RNA。然后加入 1uL 的 DNAase I(5U/L) 消 化DNA， 37， 30min， 之后按照RNA提取试剂盒(购自博迈德生物技术有限公司)中纯化RNA 步骤进行 RNA 纯化。 0068 实施例 3 利用本发明试剂盒检测甲型 H1N1 病毒的方法 0069 (1)、 检测甲型 H1N1。

29、 病毒的专用试剂盒 0070 检测 20 份样品的试剂盒的各组分及其组分来源或配制方法 ： 0071 40U/L RNase 抑制剂， 购自宝生物工程 ( 大连 ) 有限公司， 1 管， 共 21L ； 0072 8U/L Bst DNA 聚合酶， 购自百灵克生物技术公司， 1 管， 共 21L ； 说 明 书 CN 101591715 B5/9 页 7 0073 5U/L AMV 逆转录酶， 购自宝生物工程 ( 大连 ) 有限公司， 1 管， 共 21L ； 0074 无 RNA 酶 ddH2O， 1 管， 共 100L ； 0075 500SYBR Green I， 购自得比林科技有限公司。

30、， 1 管， 共 42L ； 0076 1.4110-21M 的阳性模板和 1.310-20M 的阴性模板， 各 1 管， 均为 25L ； 其中， 阳 性模板HA1 RNA的制备方法如实施例2， 阴性模板大肠杆菌RNA采用博迈德生物技术有限公 司的 RNA 提取试剂盒提取总 RNA。 0077 反应预混液 20 管， 各 17L， 配制如下 ： 每 17L 所述反应预混液中含有 10Bst DNA 聚合酶缓冲液， 2.5L ； 10mM dNTP， 3.5L ； 5M 甜菜碱， 5L ； 100mMMgSO4， 2L ； 浓度为 30M 的引物 F1 和引物 B1 各 1L， 浓度为 5M 。

31、的引物 F2 和引物 B2 各 1L。 0078 (2)、 检测方法 0079 A、 病毒 RNA 的提取 0080 取疑为甲型 H1N1 流感病患者的咽拭子， 使用 Qiagen 公司的viralRNA Mini kit 提取试剂盒提取病毒总 RNA。 0081 B、 环介导反转录等温扩增反应 0082 样品总 RNA ： 2L 0083 反应预混液 ： 17L 0084 Bst DNA 聚合酶 ： 1L 0085 AMV 反转录酶 ： 1L 0086 RNA 酶抑制剂 ： 1L 0087 ddH2O ： 3L 0088 混匀， 做好标记， 在水浴锅中 62反应 60min， 然后 80， 。

32、2min 终止反应。 0089 阳性对照反应产物见白色沉淀， 阴性对照透明。 被检测样品见白色沉淀， 表明样品 中含有甲型 H1N1 流感病毒。 0090 为了进一步确定结果的可靠性， 又采用了另外两种方法进行鉴定。如下 ： 0091 电泳鉴定 0092 配制 1的琼脂糖凝胶， 将反应产物上样、 电泳， 结果判定时， 阳性对照见梯状条 带， 阴性对照无条带出现。被检测样品中出现梯状条带， 表明样品中含有甲型 H1N1 流感病 毒。 0093 SYBR Green I 染色鉴定 0094 向反应产物中加入 2L 的 500SYBR Green I 混匀， 阳性对照反应液呈绿色， 阴 性对照无色，。

33、 被检测样品呈绿色， 表明样品中含有甲型 H1N1 流感病毒。 0095 实施例 4 反转录等温扩增一体化方法的灵敏度检测试验 0096 以得到的 HA1 RNA 片段为阳性模板， 紫外定量 HA1 RNA 浓度为 40ng/ul， 计算拷贝 数按如下公式 ：为 2.21011个拷贝数 /ul。并 进行梯度稀释从 2.21011-2.2 个拷贝， 以 10 倍梯度稀释样品， 浓度从高到低依次为 1-12 号管， 以稀释好的不同梯度拷贝的样本为模板分别用反转录等温扩增一体化检测方法和 RT-PCR 方法进行检测， 反转录等温扩增一体化检测方法扩增产物为梯状条带， RT-PCR 方法 扩增 243。

34、bp 的片段， 反应体系如下 ： 说 明 书 CN 101591715 B6/9 页 8 0097 反转录等温扩增一体化方法， 使用实施例 3 所述的试剂盒 ： 模板分别取按梯度稀 释的样品 4 12 号， 模板分别为 2.2108 2.2 拷贝， 62， 60min， 80， 2min， 反应体系 (25L) 如下 ： 0098 模板 ： 2L 0099 反应预混液 ： 17L 0100 Bst DNA 聚合酶 ： 1L 0101 AMV 反转录酶 ： 1L 0102 RNA 酶抑制剂 ： 1L 0103 ddH2O ： 3L 0104 RT-PCR 方法 ： 模板分别取按梯度稀释的样品 4。

35、 12 号， 模板浓度分别为 2.2108 2.2 拷贝， 反应如下 ： 0105 模板 ： 2L 0106 Oligo dT primer(50M) ： 1L 0107 dNTP(10mM) ： 1L 0108 ddH2O ： 加到 10L 0109 65保温5min后， 迅速在冰上冷却2min。 离心数秒， 在管中加下列反转录反应液 ： 0110 5AMV 反转录酶缓冲液 ： 2L 0111 AMV 反转录酶 (5U) ： 1L 0112 RNA 酶抑制剂 (40U) ： 1L 0113 ddH2O ： 加到 20L 0114 42， 30min， 75， 15min， 4， 冷却。取 2。

36、L 反转录产物进行 PCR 反应， 反应体系 (20L) 如下 ： 0115 模板 ： 2L 0116 引物 F2(5M) ： 0.5L 0117 引物 B2(5M) ： 0.5L 0118 2.5mMdNTP ： 1.6L 0119 10PCR buffer ： 2L 0120 Taq 酶 ： 0.2L 0121 ddH2O ： 加到 20L 0122 94， 2min ； 然后反应 30 个循环 94， 30sec ； 55， 30sec ； 72， 30sec ； 72延伸 7min。 0123 两种方法的扩增产物均使用 1的琼脂糖凝胶电泳进行鉴定， 结果如图 2 和 3 所 示， 反转。

37、录等温扩增一体化方法检测 HA1 RNA 阳性模板灵敏度可达到 2 个拷贝， 比常规 PCR 方法检测高 100 倍。 0124 实施例 5 反转录等温扩增一体化方法检测试剂盒特异性检测试验 0125 模板病毒 RNA 的来源 ： 3 株不同亚型的春季 H1N1 流感病毒 RNA， 3 株不同亚型的春 季 H3N2 流感病毒 RNA， 均来自河北疾病预防控制中心 ； 人全血总 RNA 是以来自北京儿研所 采集的正常人全血为材料， 采用博迈德生物技术有限公司的 RNA 提取试剂盒提取总 RNA ； 0126 大肠杆菌 DH5 购自 Takara， 也采用博迈德生物技术有限公司的 RNA 提取试剂。

38、盒 说 明 书 CN 101591715 B7/9 页 9 提取总 RNA。 0127 以实施例 2 制备的甲型 H1N1 流感病毒的 HA1RNA 为阳性对照、 系统以 ddH2O 为阴 性对照检测该试剂盒非特异性。反应体系 (25L) 如下 ： 0128 模板 ： 2L 0129 反应预混液 ： 17L 0130 Bst DNA 聚合酶 ： 1L 0131 AMV 反转录酶 ： 1L 0132 RNA 酶抑制剂 (40U) ： 1L 0133 ddH2O ： 加到 25.0L 0134 反应在 62进行， 反应时间 60 分钟， 结束后 80加热 2 分钟， 各取 2L 样品电泳 鉴定。结。

39、果如图 4 所示， 除 HA1 RNA 阳性对照有梯度条带外， 其余均为阴性。 0135 参考文献 0136 1.Notomi， T.， Okayama， H.， Masubuchi， H.， Yonekawa， T.， Watanabe， K.， Amino， N.， Hase， T.， Loop-mediated isothermal amplification of DNA， Nucleic Acids Res.， 2000， 28， E63. 0137 2.Poon L L， Leung C S， Tashiro M， et al.Rapid detection of the seve。

40、re acute respiratory syndrome(SARS)coronavirus by a loop-mediated isothermal amplification assayJ.Clin Chem， 2004， 50(6) ： 1050-1052. 0138 3.Boehme C.C.， Nabeta P.， Henostroza G.， Raqib R.， Rahim Z.， Gerhardt M.，Sanga E.， HoelscherM.，Notomi T.，Hase T.，Perkins M.D.，Operational feasibility of using lo。

41、op-mediated isothermalamplification for diagnosis of pulmonarytuberculosis in microscopy centers of developingcountries， J.Clin. Microbiol.， 2007， 45， 1936-1940. 0139 4.Kelly A.Curtis*， Donna L.Rudolph， S.Michele Owen， Rapid detection of HIV-1 byreverse-transcription， loop-mediated isothermal amplif。

42、ication(RT-LAMP)， Journal of VirologicalMethods， 2008， 151， 264-270. 0140 5.Imai M， Ninomiya A， Minekawa H， Notomi T， Ishizaki T， Tashiro M， Odagiri T.， LinksDevelopment of H5-RT-LAMP(loop-mediated isothermal amplification) system for rapiddiagnosis of H5 avian influenza virus infection， Vaccine， 20。

43、06， 24(44-46) ： 6679-82. 0141 6.Imai M， Ninomiya A， Minekawa H， Notomi T， Ishizaki T， Van Tu P， Tien NT， Tashiro M， Odagiri T.， Links Rapid diagnosis of H5N1 avian influenza virus infection by newly developedinfluenza H5 hemagglutinin gene-specific loop-mediated isothermal amplification method， J Vi。

44、rolMethods， 2007， 141(2) ： 173-80. 0142 7.Chen HT， Zhang J， Sun DH， Ma LN， Liu XT， Cai XP， Liu YS， Links Development of reversetranscription loop-mediated isothermal amplification for rapid detection of H9 avian influenzavirus， J Virol Methods， 2008， 151(2) ： 200-3. 0143 8.J. 萨姆布鲁克 E.F. 弗里奇等，分子克隆实验指。

45、南 第二版， 科学出版社， 1996。 说 明 书 CN 101591715 B8/9 页 10 0144 SEQUENCE LISTING 0145 中国人民解放军军事医学科学院基础医学研究所 0146 一种检测甲型 H1N1 流感病毒的试剂盒及专用引物和靶序列 0147 34 0148 6 0149 PatentIn version 3.5 0150 1 0151 280 0152 DNA 0153 Influenza A virus 0154 1 0155 agttcagaca atggaacgtg ttacccagga gatttcatcg attatgagga gctaagagag 。

46、60 0156 caattgagct cagtgtcatc atttgaaagg tttgagatat tccccaagac aagttcatgg 120 0157 cccaatcatg actcgaacaa aggtgtaacg gcagcatgtc ctcatgctgg agcaaaaagc 180 0158 ttctacaaaa atttaatatg gctagttaaa aaaggaaatt catacccaaa gctcagcaaa 240 0159 tcctacatta atgataaagg gaaagaagtc ctcgtgctat 280 0160 2 0161 40 0162。

47、 DNA 0163 Artificial Sequence 0164 0165 反转录等温扩增专用引物 1 0166 2 0167 gccatgaact tgtcttgggg agagagcaat tgagctcagt 40 0168 3 0169 43 0170 DNA 0171 Artificial Sequence 0172 0173 反转录等温扩增专用引物 2 0174 3 0175 caaaggtgta acggcagcat gaatttcctt ttttaactag cca 43 0176 4 0177 18 0178 DNA 0179 Artificial Sequence 01。

48、80 0181 反转录等温扩增专用引物 3 0182 4 说 明 书 CN 101591715 B9/9 页 11 0183 acccaggaga tttcatcg 18 0184 5 0185 25 0186 DNA 0187 Artificial Sequence 0188 0189 反转录等温扩增专用引物 4 0190 5 0191 ctttcccttt atcattaatg tagga 25 0192 6 0193 24 0194 DNA 0195 Artificial Sequence 0196 0197 用于鉴定 pMD-20T-HA1 的下游引物 0198 6 0199 gagcggataa caatttcaca cagg 24 说 明 书 CN 101591715 B1/2 页 12 图 1 图 2 图 3 说 明 书 附 图 CN 101591715 B2/2 页 13 图 4 说 明 书 附 图 。