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1、(10)授权公告号 CN 102433381 B (45)授权公告日 2013.07.31 CN 102433381 B *CN102433381B* (21)申请号 201110379161.2 (22)申请日 2011.11.25 C12Q 1/68(2006.01) C12N 15/11(2006.01) (73)专利权人 中国热带农业科学院环境与植物 保护研究所 地址 571737 海南省儋州市宝岛新村 (72)发明人 黄武仁 符悦冠 朱文静 韩冬银 胡好远 张方平 牛黎明 代鹏 马光昌 张敬宝 CN 101555521 A,2009.10.14, CN 101693924 B,201。
2、1.09.21, (54) 发明名称 基于 COI 特异引物的螺旋粉虱分子鉴定技术 (57) 摘要 本发明属于应用生物技术领域， 本发明 提供一种当前危害和扩散很快的入侵昆虫 螺旋粉虱的快速鉴定的专用引物及其螺旋 粉虱分子鉴定的使用方法。本发明提供的 螺旋粉虱特异性引物对， 其上游序列为 P1 ： 5 -AAGATATATTTTCCAATTTTATCCC-3 ； 下游引物为 P2 ： 5 -TCGTATAGAATTAAGAATGTTAGGT-3 ， 可以用 来对螺旋粉虱与其它粉虱科昆虫的鉴别， 本发明 的技术方案不仅能提高螺旋粉虱鉴别的效率和准 确性， 同时操作简便快捷， 具有广泛的适用性， 。
3、不 仅可以用于单头昆虫的鉴定， 同时可用于多种昆 虫混杂在一起检测。检测灵敏度高， 检测限可达 DNA 浓度 1ng/l， 通过本发明方法能够快速准确 判断粉虱科昆虫中是否混有螺旋粉虱的存在， 具 有重要的理论意义和实用价值。 (51)Int.Cl. (56)对比文件 审查员 范盈 权利要求书 1 页 说明书 4 页 序列表 1 页 附图 1 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利 权利要求书1页 说明书4页 序列表1页 附图1页 (10)授权公告号 CN 102433381 B CN 102433381 B *CN102433381B* 1/1 页 2 1. 一对螺旋粉虱。
4、快速分子检测的特异性引物， 其特征在于引物 DNA 的序列为 ： P1 ： 5 -AAGATATATTTTCCAATTTTATCCC-3 ； P2 ： 5 -TCGTATAGAATTAAGAATGTTAGGT-3 上述的引物对在螺旋粉虱总 DNA 中可以特异性扩增出 443bp 大小的产物。 2. 螺旋粉虱鉴定方法， 步骤包括 ： 权利要求 1 所述螺旋粉虱快速分子检测特异性引物用法包括 ： (1) 粉虱科昆虫的总 DNA 提取， 按常规方法进行， 用灭菌的去离子水将样品的 DNA 浓度 稀释到 0.1g/ml 0.4g/ml ； (2)聚合酶链式反应 ： 扩增用引物P1和P2， 进行聚合酶链。
5、式反应， 得到聚合酶链式反应 产物 ； (3)PCR 反应产物的电泳分析 ； (4) 鉴定结果的判断 ： 根据电泳显示的 PCR 扩增条带的有无来判断， 若有明显清晰的 443bp 大小的条带， 则可判断为是螺旋粉虱， 反之若无此条带或条带不清楚， 或片段大小非 443bp 大小， 则非螺旋粉虱类昆虫。 权 利 要 求 书 CN 102433381 B 2 1/4 页 3 基于 COI 特异引物的螺旋粉虱分子鉴定技术 技术领域 0001 本发明属于应用生物技术领域， 具体地说涉及应用于螺旋粉虱分子鉴定的专用引 物及鉴定螺旋粉虱的方法。 背景技术 0002 粉虱是农林重要害虫之一， 属于同翅目，。
6、 粉虱科 Homoptera ： Aleyrodidae， 是一类 体型微小的植食性刺吸类害虫， 粉虱体型最大不超过 3mm。成虫两性均有翅， 翅面覆白色蜡 粉。粉虱分布于世界各大动物区， 主要是热带和亚热带， 粉虱的寄主植物很广泛， 寄主植物 多为木本植物， 也包括许多农作物， 成幼虫主要寄生于植物叶背面。 粉虱的为害包括直接和 间接两个方面。直接为害即是从寄主植物叶内大量吸取汁液造成寄主营养缺乏， 影响寄主 的正常生理活动 ； 粉虱的间接为害方式一方面是其排出的大量蜜露招致灰尘污染叶面和霉 菌寄生， 影响寄主的光合作用和外观品质， 在蔬菜花卉生产上更是严重的问题 ； 另一方面是 粉虱作为植。
7、物病毒的传播媒介引起病毒病的大发生， 如烟粉虱可传播棉花烟草胡椒等的卷 叶病毒在温室大棚中粉虱传播的病毒病似乎是比粉虱本身为害更严重的问题 0003 螺旋粉虱属粉虱科 Family Aleyrodidae， 复孔粉虱属 Aleurodicus， 英文名为 Spirallingwhitefly， 是一种危险性入侵害虫， 正向世界各热带地区扩散。 原产于中美洲和 加勒比地区。 1905年在西印度群岛的马提尼克岛的番石榴上首次被记录， 此后分别向东、 西 蔓延， 随后几年在古巴、 巴西、 厄瓜多尔、 秘鲁， 非洲西北角的加纳利群岛等地陆续被发现， 再分别逐渐蔓延至太平洋地区及非洲西岸地区。1978 。
8、年在夏威夷瓦胡岛 (Oahu) 首次在榄 仁树上发现螺旋粉虱， 1981 年在夏威夷的所有主要岛屿上都有此虫， 其寄主多达 64 种植 物， 包括椰子树、 石榴和柑桔等。同年在萨摩亚和关岛发现此虫。1983 年菲律宾发现此虫。 1985 年在马来西亚的沙捞越该虫大爆发， 主要危害水果和蔬菜。1987 年巴布亚新几内亚报 道此虫危害番石榴和芒果。1988 年台湾省高雄县大寮乡番石榴植株上发现螺旋粉虱， 该虫 入侵台湾后快速扩散， 每到一处便造成该地植物受损， 蔬菜、 果树、 行道树及景观树种都被 危害。1989 年该虫在印度尼西亚发现， 可危害大豆等 14 科 22 种植物。1992 年在非洲大。
9、 陆首先于尼日利亚发现此虫， 然后到达多哥， 在西班牙柠檬上也大爆发， 在西班牙该虫不是 柑桔的主要害虫， 但可以危害棕榈和香蕉。1993 年传到贝宁、 加纳和刚果。印度于 1993 1994年的旱季螺旋粉虱大规模发生， 危害木薯。 2006年4月， 在中国海南省陵水县椰林镇首 次发现了螺旋粉虱寄生于番石榴(Psidium guajavaL.)和印度紫檀(Pterocarpus indicus Willd.)。随后进行广泛调查， 发现这种粉虱几乎已遍布海南各市县。目前在中国大陆地区 和香港尚未发现有此虫出现的报道。 0004 鉴于螺旋粉虱的寄主植物广泛， 已经报道的寄主植物多达 109 科 7。
10、43 种， 包括蔬 菜、 果树、 观赏植物和行道树等， 为害广， 繁殖快， 给人们造成严重损失， 防治也比较困难。 目 前在中国的为害还仅限于台湾和海南， 严格植物检疫， 防止此虫的进一步扩散是防治该虫 的一项重要措施。 但由于粉虱科昆虫是一类体型微小的植食性昆虫。 与其它昆虫类群相比， 目前的粉虱分类比较困难， 粉虱的分类系统和种类鉴定， 是依据于第四龄幼虫 ； 粉虱的一些 说 明 书 CN 102433381 B 3 2/4 页 4 种类， 形态变异很大， 其形态随寄主不同而改变， 不易区分。一些近缘种从外部形态上极难 区分， 必须依靠非形态特征进行鉴别。 粉虱是世界性的害虫， 其直接造成。
11、的为害和所传播病 毒病造成的损失是非常严重的， 准确识别和鉴定粉虱种类是采取治理对策的基础。由于粉 虱体型微小， 识别比较困难， 螺旋粉虱在热带及亚热带地区传播甚快， 造成严重危害， 在我 国螺旋粉虱被列为检疫性有害生物。 0005 张桂芬等报道了基于RAPD技术研制的螺旋粉虱的特异性SCAR引物及其检测方法 (CN101693924A)， 但其针对的是单头昆虫， 其试用的粉虱类的种类较少， 且其灵敏度也没有 报道， 因此研究建立一种高效、 快速、 准确、 灵敏且专一性强的螺旋粉虱的鉴别方法仍然十 分必要迫在眉睫。 发明内容 0006 本发明克服以往粉虱科昆虫鉴定方法存在的缺陷， 提高螺旋粉虱。
12、鉴定结果的准确 度， 是一种易于操作、 灵敏度高的螺旋粉虱的检测和诊断方法。 该方法可以直接应用于生产 实践， 对于螺旋粉虱的鉴定和控制具有十分重要的意义。 0007 本发明的技术方案如下 ： 首先从采集的各种粉虱科昆虫提取总 DNA， 利用一对引 物进行 PCR 扩增一段 COI 基因片段， 通过克隆转化后对该 DNA 片段进行序列分析， 建立各种 类粉虱科昆虫的序列数据库， 在比较数据库 DNA 的基础上， 设计一种螺旋粉虱的特异引物， 通过分析在特定条件下的聚合酶链式反应的产物结果， 从而达到快速， 准确鉴定螺旋粉虱 的目的。 0008 对需要鉴定的粉虱科昆虫样品， 提取其总 DNA， 。
13、在给定的条件下， 用设计的特异引 物进行 PCR 扩增， 通过琼脂糖凝胶电泳比较 PCR 扩增产物结果， 可以鉴定出螺旋粉虱。螺旋 粉虱可以在 443bp 处产生一条清晰地条带， 而非螺旋粉虱昆虫不能产生条带， 或者不能产 生清晰地条带。本发明设计的用于鉴别螺旋粉虱的分子鉴定方法， 采用如下步骤 ： 0009 1.粉虱科昆虫的总DNA提前， 按常规昆虫DNA提取方法进行， 用灭菌的去离子水将 样品的 DNA 浓度稀释到 0.1g/ml-0.4g/ml. 0010 2. 扩增 DNA 片段， 进行聚合酶链式反应， 即用特异的引物进行扩增， 特异的引物对 序列为 0011 P1 ： 5 -AAGA。
14、TATATTTTCCAATTTTATCCC-3 ： P2 ： 5 -TCGTATAGAATTAAGAATGTTAGGT-3 0012 3. 进行琼脂糖凝胶电泳分析， 使用 DNA marker 检测 PCR 片段大小 0013 4. 鉴定结果的判断 ： 若出现明显清晰的 443bp 大小的条带， 则可判断为是螺旋粉 虱， 反之若无此条带或条带不清楚， 则非螺旋粉虱类昆虫 0014 本发明的效果是 ： 可解决判断螺旋粉虱和其它粉虱科昆虫判断的难题， 即使是在 多头粉虱科昆虫里面混有一头昆虫， 通过总 DNA 的提取， 用本方法仍然可以检测出来， 提高 一对螺旋粉虱鉴定所需的特异引物， PCR 反。
15、应条件， 以及一段螺旋粉虱的特征 DNA 碱基序 列。通过对螺旋粉虱 DNA 浓度的测定， 研究发现在 DNA 稀释到 1ng/l 的浓度条件下， 仍然 能够检测出来， 灵敏度高。粉虱科昆虫由于体型较小， 在多种粉虱科昆虫混在一起的条件 下， 通过形态很难判断是哪类昆虫， 尤其对于非昆虫专业人士更加难以区别， 急需找到一种 可靠的鉴别方法。本发明利用螺旋粉虱和其它粉虱科昆虫 DNA 碱基序列的差异， 建立一种 快速、 简便得分子鉴别方法， 对于螺旋粉虱的防治以及检疫具有重大价值。 说 明 书 CN 102433381 B 4 3/4 页 5 附图说明 0015 图 1 是用特异性引物扩增粉虱科。
16、昆虫电泳检测图谱， 其中泳道 M 为 DNA Marker， 泳道 F1 为螺旋粉虱， 泳道 F2 F15 按顺序依次为黑刺粉虱 Aleurocanthus sp， 柑桔刺 粉虱 Aleurocanthus citriperdus， 双钩巢粉虱 Paraleyrodes pseudonaranjae Martin， 一点红伯粉虱 Bemisia emillae， 温室粉虱 Trialeurodes vaporariorum， Pentaleyrodes cinnamomi(Takahashi)， 樟 盘 粉 虱 Palaealeurodicus machili(Takahashi)， 粉 背 。
17、刺 粉 虱 Aleurocanthus inceratus Silvestri， 九 里 香 裸 粉 虱 Dialeurodes sp， 番 荔 枝 褶 粉 虱 Aleurotrachelus anonae Corbett， 柑 桔 粉 虱 Dialeurodes citri(Ashmead)， 克 氏 裸 粉 虱 Dialeurodes kirkaldyi(Kotinsky)， Tuberaleyrodes sp.， 烟 粉 虱 Bemisia tabaci(Gennadius。 0016 图2为螺旋粉虱特异性扩增灵敏度测定电泳检测图谱， 其中泳道M为DNA marker ； 泳道 400、。
18、 200、 100、 50、 25、 12.5、 5、 2 和 1 分别表示扩增螺旋粉虱 DNA 使用浓度为 400ng/ l， 200ng/l， 100ng/l、 50ng/l、 25ng/l、 12.5ng/l、 5ng/l、 2ng/l 和口 1ng/ l。 具体实施方式 0017 1.粉虱科昆虫的总DNA提前， 按常规方法进行， 用灭菌的去离子水将样品的DNA浓 度稀释到 0.1ug/ml-0.4ug/ml. 0018 2. 聚合酶链式反应 ： 0019 ( 一 ) 聚合酶链式反应以 20ul 为参考， 各物品的用量分别为 ： 0020 0021 0022 ( 二 )PCR 反应条件 。
19、： 反应在 PCR 仪上进行， 反应条件如下 ： 0023 94预变性 5min， 然后按以下条件进行 28 个循环。 0024 94预变性 50 秒 0025 60退火 30 秒 0026 72延伸 50 秒 0027 循环结束后， 在 72保持 7 分钟补齐， 反应结束后在 4保存。 0028 ( 三 )PCR 反应的电泳监测 ： 取上述反应液 4l 与 1l 载样缓冲液混合， 用 2的 说 明 书 CN 102433381 B 5 4/4 页 6 琼脂糖进行电泳， EB 染色， 用凝胶成像系统进行自卫检测。 0029 4. 鉴定结果的判断 ： 若出现明显清晰的 443bp 大小的条带， 则可判断为是螺旋粉 虱， 反之若无此条带或条带不清楚， 则非螺旋粉虱类昆虫。 说 明 书 CN 102433381 B 6 1/1 页 7 0001 序 列 表 CN 102433381 B 7 1/1 页 8 图 1 图 2 说 明 书 附 图 CN 102433381 B 8 。