一种有机磷水解酶重组表达菌株高密度发酵方法及产品保存方法 【技术领域】
本发明涉及一种有机磷水解酶MPH生产菌株的高密度发酵方法及有机磷水解酶MPH的液体保存条件，属于应用环境微生物和农业领域。
背景技术
农药是农业生产的物质保障，其使用大大减少了农作物的损失和虫媒传染病的发生，提高了农业生产的经济效益。随着人口的不断增长，粮食需求将越来越趋于紧张，农药的使用在很长的时期内将是不可避免的。我国自1990年开始，农药产量位于世界第二位。有机磷杀虫剂在80年代以来，销售额一直居各类农药之首。有机磷农药是乙酰胆碱酯酶的不可逆抑制剂，使乙酰胆碱不能分解为乙酸和胆碱，对人和哺乳动物及其它一些有益生物具有较高的毒性，在某些环境条件下，也会有较长的残存期，并在动物体内产生蓄积作用。我国近年来由于高度农药的大量、不合理使用，引发了严重的环境污染和农作物农药残留，使得农药中毒事件频繁发生，并且引发食品安全问题而制约我国的农产品出口。农药残留问题已经引起了人们的高度重视，农药降解与环境修复已经成为全世界关注的焦点。
虽然有机磷杀虫剂在碱性条件下很容易被水解，但是，由于化学水解依赖于有机磷杀虫剂的水溶性，所以该方法效率低，而且强碱溶液会对环境形成新一轮的污染。近年来大量的研究成果表明，生物方法是环境污染治理和自然环境恢复的最理想方法。环境污染物形态和结构的改变，可以通过化学反应或生物作用来实现。尽管化学反应也会使有机污染物的结构发生转化，但这种转化通常是细微的，产物与母体化合物在结构上和毒性上经常很相似。而生物作用的实质是在生物酶的催化作用下进行一系列生化反应。酶促反应很迅速，通常很彻底，可使许多有机物降解为对人体无害的二氧化碳和水。
1980年首次分离出的Pseudomonas diminuta MG和Flavobacterium sp.ATCC27 551是最初研究的两株有机磷农药降解菌，许多降解性能已得到详细阐述。这两株菌所生产的有机磷水解酶的基因opd和酶学性质已经了解得非常透彻，并且该酶的系列研究表明，酶的比活很高，具有极高的酶解速度，而且对于水解产物有高度的键不专一性，底物范围很广，能够断裂P-O，P-F，P-CN等化学键，除了有机磷农药(以及对硫磷、对氧磷、蝇毒磷、二嗪磷)可被其降解外，它还可以降解杀林，索曼等战争有机磷神经毒剂。Walter W等人分离了另外两株具有有机磷降解活性的革兰氏阴性菌Flavobacteriumsp.菌株SC和菌株B1，并对它们的降解酶分别进行了纯化和性质分析，并与Flavobacterium sp.ATCC27551中的有机磷降解酶作了比较。1991年，De frank等从一株嗜盐细菌中纯化得到一种有机磷农药降解酶，分子量为60KD，可被Mg2+和Co2+激活，能够将解磷氟键的有机磷化合物。1993年，Cheng TC等从假单胞菌中纯化得到一种有机磷农药降解酶，分子量为53KD，能降解磷氟键和磷碳键的有机磷化合物。国内所报道的关于有机磷农药降解菌，有武汉病毒所分离到的Pseudom onas sp.WBC-3、中国农科院生物技术所分离到的Pseudomonas pseudoalcaligenes C2-1和本实验室分离得到了一株能将有机磷降解为对硝基苯酚的菌株Plesiomonas sp.M6。
自从可以从黄杆菌Flavobacterium sp.和假单胞菌Pseudomonas diminuta MG将OPH提纯后，人们便开始尝试将有机磷水解酶用于农药降解。生物技术要真正造福于人类，必须走产业化的道路，在工业微生物上，选育或构建一株优良菌株仅仅是个开始，在大规模培养方面，要使优良菌株的潜力充分发挥处来，必须优化其发酵过程，以获得较高的产物浓度、较高的底物转化率和较高的生产强度。
本实验室克隆了新的有机磷水解酶基因(mpd)，已对该基因表达的有机磷水解酶(MPH)做了进一步的研究。该有机磷水解酶已在大肠杆菌中进行了表达并纯化，同时该酶的性质也得到了进一步的研究。为了使该酶更好的应用于环境修复，避免投加降解菌剂进行生物修复产生的一系列问题，就应该对酶的生产表达和酶制剂的研发作进一步的研究。本专利以该目的为出发点，争取为有机磷水解酶的工业化生产及酶制剂地应用提供理论基础和材料。
【发明内容】
技术问题
本发明的目的是通过高密度发酵提高有机磷水解酶(MPH)的单位培养体积的产量，降低生产成本，并优化该酶的保藏条件，为该酶的工业化生产提供技术基础。
技术方案
本发明的技术方案是通过以下途径实现的：
一种有机磷水解酶MPH重组表达菌株高密度发酵方法，该菌株为Eshcherichia coliBL21(DE3)pETMb，包括：
1)发酵罐工作体积5L，接种量体积比10％，种子液为LB培养基培养12h的摇瓶培养液；
2)pH通过添加10％的NaOH或者10％的HCl自动控制在7.0，溶解氧通过调节空气流量和搅拌速率控制在30％；
3)发酵罐培养基g/L：甘油10、蛋白胨5、酵母粉5、Na2PHO4·12H2O 23.28、KH2PO44.76、NaCl 0.5、MgSO4·7H2O 0.25，121℃高温灭菌30min，冷却后添加过滤除菌的MnSO4溶液至终浓度0.05mmol/L；
4)发酵过程中发酵3～5小时期间以250ml/h恒速流加100g重量比为20％的甘油；诱导前温度37℃，5～10小时期间每隔1h补加50ml质量比20％的无菌乳糖诱导，诱导温度30℃；培养12h后终止发酵，获得成熟的有活性的有机磷水解酶MPH。
上述生产有机磷水解酶产品的保存方法，包括：通过添加保护剂使终浓度体积比为5％的乙醇和终浓度质量体积比为5％的氯化钠使得酶的保藏条件能够提高到90天以上。
其中通过添加保护剂使终浓度为重量体积比15％的NaCl和重量体积比10％的乙醇，该配方条件下可以使有机磷水解酶在质量比50％高浓度餐具洗洁剂存在条件下保持稳定活性。
有益效果
1高密度发酵 高密度发酵是一个降低发酵成本重要的手段。大肠杆菌是迄今为止遗传背景最清楚的菌株，广泛应用于基因工程的研究中，从原核生物中得到的酶，可以方便地在大肠杆菌中得到重组表达。高密度发酵大肠杆菌可以获得较高的生物量，显著提高目的基因表达产物的浓度，目前在高密度液体培养大肠杆菌发面的研究已经取得了很多发展。液体培养基的流动性是限制大肠杆菌生长的唯一障碍的理论是基于E.coli在营养物质存在的情况下能够保持连续分裂，并且细菌在生长过程中不分泌任何有毒性的或生长抑制物质。影响高密度发酵的因素非常多，如细菌生长所需的营养物质、发酵过程中生长抑制物的积累、溶氧浓度、培养温度、发酵液的pH值、补料方式和发酵液流变学特性等。本发明大肠杆菌高密度发酵培养基以基础盐培养基为出发点，通过单因素及多因素正交试验优化含有重组质粒pETMb的大肠杆菌重组表达菌株的发酵培养基及发酵条件，对碳源、氮源、pH、磷酸盐、金属离子、通气量、乳糖浓度等因素进行了系统优化，得到用于该生产菌株进行高密度培养所需的培养条件，可以在较低的生产成本下得到较高的发酵密度以及高的有机磷水解酶产量。通过本专利发明的高密度培养基和发酵条件可以使菌体培养密度显著提高，通过12个小时培养菌体光密度值就可以达到29个OD，每毫升酶活达到18.5个IU以上。与传统Luria-Bertani培养基比成本下降了90％以上。
2液体保护剂开发 液体剂型有机磷水解酶的产业化关键是足够长的货架期，常规酶制剂在液体保存条件下容易腐败，使得酶活降低甚至完全丧失活性。本发明通过不同种类、浓度保护剂的添加，考察有机磷水解酶的保存效果，通过保护剂的组合得到最佳保护剂配方。通过与不同的洗洁精产品进行复配并结合保护剂配方，使得有机磷水解酶能够在高浓度表面活性剂中稳定保存。本专利发明的低成本有机磷水解酶液体剂型保护剂，使得该酶制剂在4℃条件下货架期延长至90天以上，酶活保持90％以上，并可以与商业化洗洁精进行复配，保持其在高浓度表面活性剂中的活力。
【附图说明】
图1生产菌分批补料培养条件下的生长曲线和产酶曲线。
【具体实施方式】
(一)发酵培养基及发酵条件优化
所用菌株为Eshcherichia coli BL21(DE3)pETMb(公知公用，Guoping Fu，Zhongli Cui，Tingting Huang and Shunpeng Li，Expression，purification，and charac-terization of a novel methyl parathion hydrolase.Protein Expression and Purification，2004，36：170-176)。有机磷水解酶基因mpd(编码MPH蛋白)在大肠杆菌中表达的速度远远高于翻译后加工的速度，由于信号肽结构引起的疏水性，表达产物大部分在被加工前即沉淀下来，该表达菌株不宜作为制备有机磷水解酶工程菌株。Eshcherichia coli BL21(DE3)pETMb是通过基因工程手段将mpd信号肽编码区去除后构建于表达质粒pET29a(+)得到表达质粒pETMb，将pETMb转化至E.coli BL21(DE3)所获得的有机磷水解酶重组表达菌株。
保藏及种子培养基皆为含50mg/L卡那霉素的LB培养基。摇瓶基础培养基(g/L)：Na2PHO4·12H2O 14.6、KH2PO4 3.0、NaCl 0.5；NH4Cl 1.0、MgSO4·7H2O 0.25。发酵条件的优化在三角瓶中利用单因子法顺序进行，每项优化的结果都用于以后的实验，以菌体浓度和MPH的表达量为指标，30℃，180r/min，乳糖2g/L，培养10h。
分别采用单因素实验优化碳源、氮源、微量金属元素种类及浓度、磷酸根离子浓度、乳糖浓度及投加时间、诱导前菌体培养温度和诱导温度等，每组实验重复3次。按照三因素三水平，碳源浓度(g/L)，A1＝5，A2＝10，A3＝15；氮源浓度(g/L)，B1＝5，B2＝10，B3＝15；乳糖浓度(g/L)，C1＝3，C2＝4，C3＝5安排正交表L9(34)，以酶活单位IU/mL为指标，每组实验重复3次。
酶活测定采用细胞破碎液上清进行，将经过诱导的菌体培养液100ml，12000r/min离心3min，将沉淀用PBS(40mmol/L，pH7.0)洗涤，然后用10mlPBS重悬混匀，加入PMSF至终浓度0.1％，超声波破碎细胞：超声3s，停3s，破碎细胞总时间6min。12000r/min离心10min，收获上清即为粗酶液。操作过程保持破碎液于4℃，超声破碎时尽量避免泡沫的产生。
反应体系：50ul 10000ppm甲基对硫磷，一定量酶液(＜3μg/μl)，以巴比妥钠-Cl缓冲液(40mmol/L，pH8.8)补至终体积5ml，混匀，25℃反应10min。
测定体系：从反应体系中取0.5ml反应液至4.5ml Gly-NaOH缓冲液(50mmol/L，pH10.0)中，混匀反应10min，测定OD410，求出产物对硝基苯酚的生成量。
酶活单位定义：在25℃下每分钟水解1μmol甲基对硫磷即产生1μmol对硝基苯酚所需要的酶量。
1碳源种类及浓度的优化
在基础培养基中，以多种不同的单糖、二糖及多糖(4g/L)作为唯一碳源，观察对菌体生长和MPH表达的影响。结果如表1所示，葡萄糖和果糖对产酶产生了负面影响，这与文献的结果一致，这和碳源代谢的抑制相关；乳糖的利用受其代谢途径的影响，菌体生长量很少。选择甘油为最适碳源，在浓度0～25g/L的范围内进行浓度梯度实验，结果表明甘油在5～10g/L时菌体生长、酶的表达以及酶的比活性较好。
表1碳源对菌体生长和MPH表达的影响
2氮源种类及浓度的优化
7种不同的氮源(10g/L)对菌体生长和产酶的影响不同。结果见表2，酵母粉获得较高菌体和MPH产量的原因，是由于其含有多种菌体生长需要的维生素和生长因子以及矿质元素，这与文献报道一致。酵母粉与蛋白胨混配(1∶1)，单位体积酶活最高(2.68IU/mL)，高于使用单一酵母粉或蛋白胨作氮源。
表2不同氮源对菌体生长和MPH表达的影响
3金属离子种类及浓度的优化
分别添加7种不同二价金属离子的硫酸盐(0.05mmol/L)，结果见表3所示，添加适量Mn2+使菌液中MPH活性增加，Co2+对菌体生长有很强的抑制作用。其他金属离子对菌体生长和MPH表达没有太大影响。分别添加0.025～0.1mmol/L MnSO4，0.05mmol/L的MnSO4培养的菌体，MPH活性最高，过多的Mn2+会强烈抑制菌体的生长和酶的活性。将以不同浓度培养的菌体作总蛋白SDS-PAGE，可以观察到Mn2+的不同浓度对于MPH的表达量没有影响，初步认为是由于Mn2+影响了MPH活性。
表3不同二价金属离子对菌体生长和MPH表达的影响
4磷酸盐浓度的优化
磷酸盐是微生物生长和维持溶液渗透压的必需物质，且对于质粒的稳定性的保持和表达有利。磷酸盐的含量能够影响大肠杆菌表达质粒复制的速率，当磷酸根浓度过低时由于不能满足生长需要，菌体密度较低；但当浓度过高时，早期细菌生长过于旺盛，导致菌体较早衰老，使菌体密度仍受大影响不能达到很高。保持PHO42-与H2PO4-的摩尔比为2∶1.1，使培养基PH保持7.0左右，观察一定浓度范围的磷酸盐对细胞生长和MPH表达的影响。0.02～0.3mol/L范围内菌体生长没有显著变化，而MPH表达差异明显，0.1mol/L左右的磷酸根离子为最适浓度。
5诱导前菌体培养温度和诱导温度的优化
温度会影响菌体生长速率、扩散速率、生化反应速率、酶系的活性与稳定性、基质的吸收与利用等。结果表明，37℃诱导前培养，30℃诱导能够获得较高的酶产量和菌体生长量，30℃的较低温度诱导可以减少包涵体的形成而获得较多的具有活性的外源蛋白。
表4不同的诱导前温度和诱导温度对菌体生长和MPH表达的影响
6乳糖浓度和诱导前培养时间的优化
分别添加1～20g/L乳糖诱导，结果显示4g/L乳糖诱导效果较好。当乳糖浓度高于8g/L，MPH表达降低，菌体生长无抑制现象，这可能是由于高浓度的乳糖分解会产生较多的葡萄糖和半乳糖，葡萄糖的降解阻遏效应得以表现。
7培养基pH值优化
通过调节培养基成分：Na2PHO4·12H2O和KH2PO4的比例，使培养基pH值为6-8。发现菌体的最适生长pH为7.5，但是MPH的表达量却在6.5时较高。
8条件优化的正交实验
按照三因素三水平，A：碳源浓度(A1＝5g/L，A2＝10g/L，A3＝15g/L)；B：氮源浓度(B1＝5g/L，B2＝10g/L，B3＝15g/L)；C：乳糖浓(C1＝3g/L，C2＝4g/L，C3＝5g/L)度，安排正交表L9(34)，采用优化后的培养条件，以摇瓶培养的方式，将种子液接入装液量为80mL的250mL三角瓶中进行培养，通过测定菌体密度和MPH表达量，以确定这些因素的最优组合。
表5正交实验直观分析
从直观分析表中，9个处理组合的MPH产量的结果可以看出，组合5(A2B2C1)中MPH含量最高(13.98IU/mL)，其次为组合7(A3B1C2)。从R值可以看出：A因素(乳糖)的R最大(6.47)，即A因素对结果的影响最大。其次是B因素(氮源)和C因素(乳糖)。
从方差分析表可以看出，碳源和氮源两个因素对结果的影响达到极限著水平，乳糖在一定范围内对结果影响不显著。也就是说，不同的碳源的选择对最后结果会有很显著的不同，其中，当碳源选择为A2时侯，效果最好。氮源的影响次之，但是也达到了显著水平。但是选择不同浓度的乳糖对结果没有显著影响。
(二)7L发酵罐中E.coli BL21(DE3)/pETMb的发酵工艺条件
发酵罐发酵条件按优化的结果进行。发酵罐为镇江东方生物公司GUJS-70型发酵罐。发酵罐工作体积5L，接种量10％，种子液为培养12h的摇瓶培养液，pH通过添加10％的NaOH或者10％的HCl自动控制在7.0左右，溶解氧通过调节空气流量和搅拌速率控制在30％左右，各数据由微机自动收集和记录。发酵罐培养基(g/L)：甘油10；蛋白胨5；酵母粉5；Na2PHO4·12H2O 23.28；KH2PO4 4.76；NaCl 0.5；MgSO4·7H2O 0.25；121℃高温灭菌30min，冷却后添加过滤除菌的MnSO4溶液至终浓度0.05mmol/L。诱导前温度37℃，诱导温度30℃，发酵过程中3～5h期以250ml/h恒速流间恒速流加100g甘油的补料，5～10h期间间歇补加50g乳糖的补料。
1发酵工艺条件
采用优化后的培养基成分，进行发酵罐分批补料培养，发酵过程中间隔1h测菌体生长密度并留样电泳。发酵3h后菌体光密度达到3，开始恒速流(250ml/h)加100g甘油(20％，W/W)的补料，5～10h期间间歇补加50g乳糖的补料，采用每隔1h补加50ml20％的无菌乳糖的方式补料。菌体开始表达外源蛋白并利用乳糖为碳源进行生长，比生长速率明显减小。培养12h后终止发酵，最终菌体密度29.71，干重12.65g(DCW)/L；细胞超声破碎液上清中，MPH酶活单位为18.69IU/mL，细胞可溶性总蛋白质含量为4.182mg/mL，获得成熟的有活性的MPH占细胞可溶性总蛋白的14.56％。
在补料分批培养中，重组大肠杆菌的生长可以划分为4个时期。第一阶段为延滞期，第二阶段为对数生长期，该阶段的比生长速率μ＝μmax，当初始培养基中碳源被耗完时，进入第三阶段的补料时期，将补料培养基按近指数的方式流加到发酵罐中，稳定比生长速率0.15h-左右；第四阶段为诱导期，经过适当的诱导时间，根据情况及时放罐，避免菌体自溶。
2发酵成本测算
发酵培养基的原料成本估算：根据市场价格，甘油为7.8元/kg；酵母膏为6元/kg；蛋白胨为6元/kg；乳糖为6.5元/kg；NaCl为3元/kg；磷酸盐为20元/kg；MgSO4为0.5元/kg；每生产1L培养物，可获得18690IU的重组MPH，所需生产原料的成本为0.9213。每1000个IU的MPH所需的原料成本为0.049元人民币。而使用LB培养基摇瓶培养原始菌株M6，每生产1L培养物，获得130IU的MPH，所需成本为0.105元，每1000个IU的MPH所需的原料成本为0.808元人民币。
(三)有机磷水解酶的液体保存条件
液体酶制剂保存条件采用将酶与各种不同浓度添加剂进行混合后置于4℃保存，于不同时间取样测定活力的方式，确定保护剂种类。所用试剂为国产分析纯试剂。
用去离子水配置所需浓度两倍的各种溶液，磁力搅拌促溶，取3ml于7ml离心管中，4℃预冷，加入同等体积的粗酶液，缓慢颠倒离心管，混匀，置于4℃。
使用等体积的去离子水稀释粗酶液，取一定酶量测定酶活，作为初始对照。
间隔不同时间测定酶活，取样之前观察各管中液体的外观，比较透光度、分层情况、泡沫多少、沉淀、溶液均一性等。取样时缓慢颠倒离心管数次，以混匀溶液，取一定量混合液测定剩余相对活力(以初始酶活为100％)，作时间曲线。
餐具洗洁剂选取市场上销售的餐具洗洁剂20余种，取200μl于巴比妥钠-HCl反应体系中，混匀，加入一定量的酶液，观察其对酶活的影响，并测定加入不同餐洗不加酶液的反应体系的酶活。
选择20种餐具洗洁剂中对酶活影响较小的品种，与MPH以不同的体积比例混匀，放置于4℃，间隔不同时间测定酶活，取样之前观察各管中液体的外观，缓慢颠倒离心管数次，以混匀溶液，取一定量混合液测定剩余相对活力(以初始酶活为100％)，作时间曲线。
1重组MPH储存于不同溶液中的稳定性
将溶于pH7.0PBS的初酶液与不同溶液等体积混合，置于4℃，每天取样测定酶活(以与等体积去离子水混合的粗酶液的初始酶活为100％)，以与等体积去离子水混合的粗酶液作初始对照，结果见下表。
表6各种不同溶液对重组MPH长期保存的影响
由30d的保存结果得知，聚乙二醇6000、硼酸、NaCO3、NaCl、柠檬酸钠、甲酸钠、甘油、乙醇等物质，对重组MPH在液体中的稳定性有很好的保护作用，这些物质可能与蛋白质中特定的氨基酸在溶液中包覆形成一种特殊的分子结构，增加蛋白质的稳定性。
从外观上观察，硼酸、2％Na2CO3、5％NaCl、10％甲酸钠、甘油、乙醇等物质与酶的混合溶液，沉淀较少，无分层，清澈度较好；而其他混合溶液，由于MPH的变性失活，或是高浓度盐离子引起的沉淀较多，比较混浊。
2餐具洗洁剂复配保护剂的优化改良
在所选取的餐具洗洁剂中，除了“84好帮手天然活性洗洁灵”牌餐具洗洁剂(简称84)对酶活抑制较小以外，其余品牌餐具洗洁剂均为100％抑制酶活。测定其pH值发现，84的pH为中性，其余大部分为偏碱，有些甚至达10左右，这可能由于pH的影响和表面活性剂对MPH的抑制作用造成了MPH的失活。将“84天然活性洗洁灵”与等体积的粗酶液配比为以下制剂，4℃放置90d，每隔十天测定酶活一次，将稀释为等体积的粗酶液的初始活力为100％，观察酶活剩余情况，下表为90d后的相对剩余活力：
表6各种不同溶液对重组MPH长期保存的影响
由上表的结果可知，经过三个月的保存后，添加了NaCl和乙醇的加酶餐具洗洁净的酶活几乎没有损失，可以作为重组MPH的酶制剂配方，将其应用于实际生产过程中。