一种鸭催乳素基因分型试剂盒.pdf

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1、(10)授权公告号 (45)授权公告日 (21)申请号 201420546953.3 (22)申请日 2014.09.22 C12M 1/34(2006.01) C12Q 1/68(2006.01) (73)专利权人 江苏省家禽科学研究所 地址 225125 江苏省扬州市邗江区仓颉路 58 号 专利权人 江苏腾达源农牧有限公司 (72)发明人 朱文奇 李慧芳 束婧婷 陈文峰 宋卫涛 朱春红 单艳菊 宋迟 徐文娟 陶志云 张静 肖芹 (74)专利代理机构 北京东正专利代理事务所 ( 普通合伙 ) 11312 代理人 张亦华 (54) 实用新型名称 一种鸭催乳素基因分型试剂盒 (57) 摘要 本实。

2、用新型公开了一种鸭催乳素基因分型试 剂盒， 包括盒体、 与盒体铰接的盒盖， 盒体包括工 具盒和实验盒， 实验盒分为储存盒和盛放盒， 盛放 盒内安装管架 ； 储存盒盒内固定隔离垫， 隔离垫 上开有孔腔， 孔腔内分别放置用于盛放上下游引 物混合物P的第一试剂瓶、 用于盛放LDR探针混合 物L的第二试剂瓶、 用于盛放DNA Tag酶的第三试 剂瓶及用于盛放 DNA 连接酶的第四试剂瓶。本实 用新型的有益效果为 ： 通过使用上下游引物混合 物 P、 LDR 探针混合物 L、 DNA Tag 酶及 DNA 连接酶 等试剂， 利用 LDR 方法检测鸭催乳素多位点基因 的基因型， 实现了通过分子生物学技术检。

3、测出影 响鸭产蛋性能的基因位点和突变， 为育种提供更 为完整和准确的理论依据。 (51)Int.Cl. (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)实用新型专利 权利要求书1页 说明书5页 附图3页 (10)授权公告号 CN 204185487 U (45)授权公告日 2015.03.04 CN 204185487 U 1/1 页 2 1. 一种鸭催乳素基因分型试剂盒， 包括盒体 (1)、 与盒体铰接的盒盖 (2)， 盒体包括工 具盒(3)和实验盒(4)， 工具盒位于实验盒下方， 其特征在于， 实验盒分为储存盒(5)和盛放 盒 (6)， 盛放盒内安装管架 (7) ； 其中， 储存盒内固定隔离。

4、垫 (8)， 隔离垫上开有孔腔， 孔腔内分别放置用于盛放上下游 引物混合物 P 的第一试剂瓶 (10)、 用于盛放 LDR 探针混合物 L 的第二试剂瓶 (11)、 用于盛 放 DNA Tag 酶的第三试剂瓶 (12) 及用于盛放 DNA 连接酶的第四试剂瓶 (13)。 2.根据权利要求1所述的鸭催乳素基因分型试剂盒， 其特征在于， 管架包括底板(14)、 隔板 (15) 及固定在底板上的支杆 (16)， 隔板穿接在支杆上， 隔板与支杆转动连接 ； 隔板上 开有插管孔 (17)。 3. 根据权利要求 2 所述的鸭催乳素基因分型试剂盒， 其特征在于， 盛放盒的侧板 (18) 内壁上开有用于限定隔。

5、板转动的限位槽 (19)。 4. 根据权利要求 3 所述的鸭催乳素基因分型试剂盒， 其特征在于， 盛放盒的侧板通过 安装在盒体上的滑轨 (20) 与盒体滑动连接。 5. 根据权利要求 1 所述的鸭催乳素基因分型试剂盒， 其特征在于， 工具盒与盒体滑动 连接， 且工具盒内放置 PCR 反应液管 (21)。 6. 根据权利要求 1 所述的鸭催乳素基因分型试剂盒， 其特征在于， 隔离垫上安装与孔 腔对应的标签盒 (22)， 标签盒内放置标签。 7. 根据权利要求 1 所述的鸭催乳素基因分型试剂盒， 其特征在于， 工具盒外侧连接提 手 (9)。 权 利 要 求 书 CN 204185487 U 2 1。

6、/5 页 3 一种鸭催乳素基因分型试剂盒 技术领域 0001 本实用新型涉及生物技术领域， 具体而言， 涉及一种鸭催乳素基因分型试剂盒。 背景技术 0002 在高度工业化的现代养禽业中， 就巢性已经成为影响禽类产蛋量的重要因素。催 乳素 (Prolactin， PRL) 是垂体前叶嗜酸细胞分泌的多肽类激素， 在家禽中， 催乳素是母禽 就巢孵卵行为和调控生殖活动的关键激素， 近年来的研究表明， 催乳素基因是控制鸭就巢 的关键基因， 不同的基因型对鸭的就巢性状指标会有不同的影响， 有些会降低鸭产蛋性能， 而有些又会促进产蛋性能， 所以必须利用各种分子生物学技术尽可能多的检测出影响鸭产 蛋性能的基因。

7、位点和突变， 为育种提供更为完整和准确的理论依据。 0003 针 对 上 述 问 题， 现 有 技 术 一 般 应 用 连 接 酶 检 测 反 应 (ligase detection reaction， LDR) 进行检测， 连接酶检测反应是利用高温连接酶实现对基因多态性位点的识 别， 通过多通道荧光定量PCR仪(Multiplex PCR)获得含有待检测突变位点的基因片段， 高 温连接酶一旦检测到 DNA 与互补的两条寡聚核苷酸接头对应处存在着基因点突变类型的 碱基错配， 则连接反应就不能进行， 最后通过测序仪电泳读取检测结果， 从而得到影响鸭产 蛋性能的 PRL 基因位点和突变。该检测技术。

8、具有特异性高、 检测快速、 通用性强、 适用范围 广、 成本低廉等特点， 因此该技术广泛被应用。 0004 但是， 目前市场上各种应用于上述检测技术的试剂盒均没有规定成型的结构， 大 多均为实验者自己设计， 因此应用于该检测技术的试剂盒种类丰富， 有些试剂盒中的某些 试剂具有容易氧化、 见光分解或低温存放的特点， 对保存条件要求较高， 另外在实验检测过 程中， 试剂在多次使用中容易造成交叉污染， 这样将严重影响实验的准确性， 从而导致检测 不够精确， 另外检测时耗时耗力， 操作繁琐， 检测困难。 0005 因此， 目前尚无文献报道检测鸭催乳素基因位点和突变的试剂盒。 实用新型内容 0006 为。

9、解决现有试剂盒没有规定成型的结构， 大多均为实验者自己设计， 因此应用于 该检测技术的试剂盒种类丰富， 有些试剂盒中的某些试剂具有容易氧化、 见光分解或低温 存放的等缺陷， 本实用新型的目的在于提供一种鸭催乳素基因分型试剂盒。 0007 为达到上述目的， 本实用新型实施例中提供了一种鸭催乳素基因分型试剂盒， 包 括盒体、 与盒体铰接的盒盖， 盒体包括工具盒和实验盒， 工具盒位于实验盒下方， 实验盒分 为储存盒和盛放盒， 盛放盒内安装管架 ； 0008 其中， 储存盒内固定隔离垫， 隔离垫上开有孔腔， 孔腔内分别放置用于盛放上下游 引物混合物 P 的第一试剂瓶、 用于盛放 LDR 探针混合物 L。

10、 的第二试剂瓶、 用于盛放 DNA Tag 酶的第三试剂瓶及用于盛放 DNA 连接酶的第四试剂瓶。 0009 本技术方案中， 本实用新型结构简单， 将试剂、 工具及管架分开放置， 防止实验中 试剂存在交叉污染， 另外工具盒用于盛放实验中常需的工具或实验容器， 盛放盒内放置管 说 明 书 CN 204185487 U 3 2/5 页 4 架， 用于将实验中用到的试管放置在管架上， 操作简单， 使用方便， 另外上下游引物混合物 P、 LDR 探针混合物 L、 DNA Tag 酶及 DNA 连接酶可以统一储存， 便于携带， 通过该试剂盒可利 用基因分子标记来检测鸭催乳素基因位点和突变， 使用方便， 。

11、每次可进行多个基因的检测， 提高了检测效率， 检测的准确率提高。 0010 进一步的， 管架包括底板、 隔板及固定在底板上的支杆， 隔板穿接在支杆上， 隔板 与支杆转动连接 ； 隔板上开有插管孔。本技术方案中， 管架用于放置试管， 防止试管倾倒导 致液体洒出， 当试管较多时， 便于区分， 管架上可以放置多个试管， 清洗后的试管也可以放 置在管架上， 防止试管随便放置， 导致丢失。 0011 进一步的， 盛放盒的侧板内壁上开有用于限定隔板转动的限位槽。限位槽用于限 定隔板转动， 防止隔板倾斜， 甚至将试管内的液体洒出等情况的发生， 操作简单， 便于实验 的进行。 0012 进一步的， 盛放盒的侧。

12、板通过安装在盒体上的滑轨与盒体滑动连接。本技术方案 中， 侧板通过滑轨滑动到一侧， 便于将管架取出， 也方便观察试管内的反应。 0013 进一步的， 工具盒与盒体滑动连接， 且工具盒内放置 PCR 反应液管。工具盒可以 通过滑道、 导轨、 轨道等形式从盒体内抽出， 类似抽屉的结构， 这样可以根据使用情况， 选择 所需的实验用具， 使用方便， PCR 反应液管用于基因分型检测实验时使用， 使用方便， 操作简 单。 0014 进一步的， 隔离垫上安装与孔腔对应的标签盒， 标签盒内放置标签。 在隔离垫的标 签盒上放置标签， 可以很方便的辨别试剂， 防止实验时弄混试剂， 保证了试验的正常检测， 使用方。

13、便， 操作简单。 0015 优选的， 工具盒外侧连接提手。实验时， 提手更方便的将工具盒拉开， 便于操作。 0016 本实用新型所述的第一试剂瓶内盛放用于PRL基因PCR扩增的上下游引物混合物 P， 其中 P 详细信息如下 ： 0017 上游引物序列 5 -CTGCATCTGTGGACATTGCT-3 ； 0018 下游引物序列 5 -AGAAGCCGCTTGTTTTGTTC-3 。 0019 本实用新型所述的第一试剂瓶内盛放用于PRL基因LDR反应的LDR探针混合物L， 其中 L 表示用于 LDR 反应的三根探针的混合物， 具体信息如下 ： 0020 a 探针序列 : 0021 5 P-P-。

14、TACTAAATTCAGTAGGTCTTCATGCTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT-FAM-3 ； 0022 b 探针序列 : 0023 5 -TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTCATTCCAGGAGCGCAG(CT)ACTCCCAG-3 ； 0024 c 探针序列 : 0025 5 -TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTCATTCCAGGAGCGCAG(CT)ACTCCCAA-3 。 0026 本实用新型的有益效果为 ： 该试剂盒结构简单， 便于实验操作， 另外通过使用上下 游引物混合物 P、 LDR 探针混合物 L、 DNA Tag 酶及 DN。

15、A 连接酶等试剂， 利用 LDR 方法检测鸭 PRL 多位点基因的基因型， 从而实现了通过分子生物学技术检测出影响鸭产蛋性能的基因 位点和突变， 为育种提供更为完整和准确的理论依据， 测试快速、 准确， 成本低廉， 避免了采 用传统方法耗时、 耗力和易出错的缺点 ； 另外工具与试剂分开放置， 试剂瓶统一储存在储存 盒内， 打开即可使用， 防止实验中试剂存在交叉污染， 实用性强。 说 明 书 CN 204185487 U 4 3/5 页 5 附图说明 0027 图 1 为本实用新型实施例所述的一种鸭催乳素基因分型试剂盒的立体结构示意 图 ； 0028 图 2 为本实用新型实施例所述的一种鸭催乳素。

16、基因分型试剂盒的结构示意图 ； 0029 图 3 为本实用新型实施例所述的一种鸭催乳素基因分型试剂盒的截面图。 0030 图中， 0031 1、 盒体 ； 2、 盒盖 ； 3、 工具盒 ； 4、 实验盒 ； 5、 储存盒 ； 6、 盛放盒 ； 7、 管架 ； 8、 隔离垫 ； 9、 提手 ； 10、 第一试剂瓶 ； 11、 第二试剂瓶 ； 12、 第三试剂瓶 ； 13、 第四试剂瓶 ； 14、 底板 ； 15、 隔板 ； 16、 支杆 ； 17、 插管孔 ； 18、 侧板 ； 19、 限位槽 ； 20、 滑轨 ； 21、 PCR 反应液管 ； 22、 标签盒。 具体实施方式 0032 下面通过。

17、具体的实施例并结合附图对本实用新型做进一步的详细描述。 0033 如图 1 所示， 本实用新型实施例所述的一种鸭催乳素基因分型试剂盒， 包括盒体 1、 与盒体铰接的盒盖2， 盒体包括工具盒3和实验盒4， 工具盒位于实验盒下方， 实验盒分为 储存盒 5 和盛放盒 6， 盛放盒内安装管架 7 ； 0034 其中， 储存盒内固定隔离垫 8， 隔离垫上开有孔腔， 孔腔内分别放置用于盛放上下 游引物混合物 P 的第一试剂瓶 10、 用于盛放 LDR 探针混合物 L 的第二试剂瓶 11、 用于盛放 DNA Tag 酶的第三试剂瓶 12 及用于盛放 DNA 连接酶的第四试剂瓶 13。 0035 该试剂盒结构。

18、简单， 使用方便， 试剂、 管架及工具分别放置在不同的盒内， 不仅做 到了实验所有用品统一储存， 而且防止实验时试剂存在交叉污染的情况发生， 另外工具清 洗后统一储存， 实验中通过使用上下游引物混合物 P、 LDR 探针混合物 L、 DNA Tag 酶及 DNA 连接酶等试剂， 利用LDR方法检测PRL基因多位点的基因型， 从而实现了通过分子生物学技 术检测出影响鸭产蛋性能的基因位点和突变， 为育种提供更为完整和准确的理论依据， 测 试精确度提高， 仅通过该试剂盒即可完成基因分型检测， 提高了检测效率， 省时省力， 实用 性强。 0036 如图 2 所示， 本技术方案中， 进一步所述的管架包括。

19、底板 14、 隔板 15 及固定在底 板上的支杆16， 隔板穿接在支杆上， 隔板与支杆转动连接 ； 隔板上开有插管孔17。 本技术方 案中， 进一步所述的盛放盒的侧板内壁上开有用于限定隔板转动的限位槽 19。本技术方案 中， 管架用于实验中防止试管或放置临时工具， 管架上的隔板可通过支杆进行转动， 便于观 察和取出试管， 使用方便， 操作简单， 提高了实验效率， 提高了实验精度。 0037 如图 3 所示， 本技术方案中， 进一步所述的盛放盒的侧板通过安装在盒体上的滑 轨 20 与盒体滑动连接。本技术方案中， 盛放盒内放置管架， 为方便取出管架进行清理， 侧 板可以通过安装在盒体上的滑轨滑动，。

20、 然后将盛放盒的侧板滑开， 将管架取出， 使用更加方 便。 0038 本技术方案中， 进一步所述的工具盒与盒体滑动连接， 且工具盒内放置 PCR 反应 液管 21。PCR 反应液管用于基因分型检测实验时使用， 存放方便， 实用性强， 无需使用时再 次寻找。 0039 本技术方案中， 进一步所述的隔离垫上安装与孔腔对应的标签盒 22， 标签盒内放 说 明 书 CN 204185487 U 5 4/5 页 6 置标签。 本技术方案中， 优选的所述工具盒外侧连接提手9。 在隔离垫的标签盒上放置标签， 可以很方便的辨别试剂， 防止实验时弄混试剂， 保证了试验的正常检测， 在工具盒外侧连接 提手， 是为。

21、了便于将工具盒打开， 使用方便， 操作简单。 0040 本实用新型所述的第一试剂瓶内盛放用于PRL基因PCR扩增的上下游引物混合物 P， 其中 P 详细信息如下 ： 0041 上游引物序列 5 -CTGCATCTGTGGACATTGCT-3 ； 0042 下游引物序列 5 -AGAAGCCGCTTGTTTTGTTC-3 。 0043 本实用新型所述的第一试剂瓶内盛放用于PRL基因LDR反应的LDR探针混合物L， 其中 L 表示用于 LDR 反应的三根探针的混合物， 具体信息如下 ： 0044 a 探针序列 : 0045 5 P-P-TACTAAATTCAGTAGGTCTTCATGCTTTTTT。

22、TTTTTTTTTTTTTTTTTT-FAM-3 ； 0046 b 探针序列 : 0047 5 -TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTCATTCCAGGAGCGCAG(CT)ACTCCCAG-3 ； 0048 c 探针序列 : 0049 5 -TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTCATTCCAGGAGCGCAG(CT)ACTCCCAA-3 。 0050 本实用新型提供的试剂盒的使用方法如下 ： 0051 1、 PCR 扩增 SNP 位点所在片段 ： 0052 1)PCR 扩增反应体系准备 ： 在 200l 的 PCR 薄壁管中， 加入 1l DNA 模板 ( 约 5。

23、0ng/l)、 2l Bufer、 0.6l Mg2+(3mmol/L)、 2l dNTP(2mmol/L)、 0.3l Tag酶(5U/ l)、 0.4l Primer 5pmmol/l、 4l Q-solution、 9.7l ddH2O 共 20L PCR 反应体 系， 充分混匀后短暂离心， 最后加入 20l 石蜡油。 0053 2)PCR 扩增反应程序设置 ： 在 Perkin-Elmer Gene Amp PCR Systems9600 上设置 PCR 扩增反应程序， 程序设置完毕后， 将 PCR 反应管放入 PCR 仪进行反应扩增。 0054 3)反应结束后， 取2l反应产物在3.。

24、0琼脂糖胶， 0.5TBE中电泳， 检测反应是 否成功。 0055 4) 剩余反应产物在 -20的条件下保存。 0056 2、 PCR产物的连接酶检测反应 ： 1)在PCR扩增产物中加入等体积ddH2O稀释， 作为 连接反应的模板 ； 2) 在 200l 的 PCR 薄壁管中， 加入 1l L， 1l 10Buffer、 1l PCR 产物、 0.05l DNA连接酶2U/l、 6.95l ddH2O， 10L连接酶检测反应体系， 充分混匀后 短暂离心， 最后加入 10l 石蜡油 ； 3) 在 Perkin-Elmer Gene Amp PCR Systems 9600 上连 接酶检测反应程序。

25、， 程序设置完毕后， 将 PCR 反应管放入 PCR 仪进行连接反应 ； 4) 在每个上 样孔中加入10l Loading Buffer， 0.25l ABI GS-500ROX荧光标记分子量标准， 最后加 入 0.5l 的 LDR 产物， 充分混匀后上样， 运用 ABI377 测序仪进行测序胶毛细管电泳 ； 5) 应 用 GENESCANTM672 软件进行数据收集、 泳道线校正、 迁移片段大小测量和校正内在分子量 标准 ； 应用 Genemapper 软件进行数据分析和基因分型。 0057 实验 ： 运用本实用新型提供的试剂盒对 100 只 7 周龄的高邮鸭基因 PRL 基因 T3777C。

26、、 A3785G SNP 位点分型检测。 0058 1) 样品 ： 采集 7 周龄 100 只高邮鸭的血液， 应用传统的苯酚 / 氯仿法提取 DNA， 并 将 DNA 浓度稀释到 50ng/l。 说 明 书 CN 204185487 U 6 5/5 页 7 0059 2)PCR扩增反应及结果 ： PCR扩增及检测结果按照试剂盒使用方法步骤1进行， PRL 基因 PCR 产物大小为 99bp， 与预计的结果一致。如图 2， 实验中主要观察 PCR 是否成功， 对 于每个位点是否好无法通过电泳观察 ) ： MARK ： 100、 200、 300、 400、 500、 600。 0060 3)PR。

27、L基因PCR扩增产物的连接酶检测反应 ： PRL基因PCR产物连接酶反应按照试 剂盒使用方法步骤 2 进行， 检测后， 经 Genemapper 数据分析后 PRL 基因 T3777C SNP 位点的 分型截图见表 1， 基因判型标准为 PRL 基因连接产物检测出， 单峰 98bp0.5bp 为 CC 基因 型。说明这批高邮鸭的 PRL 基因 T3777C 全部为 CC 基因型。PRL 基因 A3785G SNP 位点的 分型截图见表 2， 基因判型标准为 PRL 基因连接产物检测出， 单峰 102bp0.5bp 为 GG 基因 型。说明这批高邮鸭的 PRL 基因 A3785G 全部为 G G。

28、 基因型。 0061 本实用新型涉及鸭产蛋相关基因催乳素多位点检测的基因分型试剂盒， 属于分子 生物学技术领域， 试剂主要特点是由催乳素基因 PCR 扩增的上下游引物混合物 P、 PRL 基因 LDR反应的探针的混合物L及Tag酶、 DNA连接酶组成 ； 利用本实用新型以LDR方法检测PRL 基因的基因型， PCR 扩增 SNP 位点所在片段， PCR 产物的连接酶检测反应 ； PRL 基因突变对鸭 的产蛋性能有显著影响， 结合就巢性状进行相关分析， 研究该基因对鸭产蛋性能的影响， 为 鸭产蛋性能的遗传改良提供依据。 0062 以上所述仅为本实用新型的优选实施例而已， 并不用于限制本实用新型， 对于本 领域的技术人员来说， 本实用新型可以有各种更改和变化。凡在本实用新型的精神和原则 之内， 所作的任何修改、 等同替换、 改进等， 均应包含在本实用新型的保护范围之内。 说 明 书 CN 204185487 U 7 1/3 页 8 图 1 说 明 书 附 图 CN 204185487 U 8 2/3 页 9 图 2 说 明 书 附 图 CN 204185487 U 9 3/3 页 10 图 3 说 明 书 附 图 CN 204185487 U 10 。