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1、(10)授权公告号 CN 101220080 B (45)授权公告日 2012.01.04 CN 101220080 B *CN101220080B* (21)申请号 200810046772.3 (22)申请日 2008.01.25 C07K 1/14(2006.01) (73)专利权人 中国地质大学 ( 武汉 ) 地址 430074 湖北省武汉市洪山区鲁磨路 388 号 (72)发明人 谢作明 刘永定 王焰新 沈银武 胡春香 (74)专利代理机构 武汉华旭知识产权事务所 42214 代理人 刘荣 CN 1130028 A,1996.09.04, 全文 . US 5807536 A,1998。
2、.09.15, 全文 . CN 1344723 A,2002.04.17, 全文 . (54) 发明名称 一种从具鞘微鞘藻中提取藻蓝蛋白的方法 (57) 摘要 本发明公开了一种从具鞘微鞘藻中提取藻蓝 蛋白的方法， 首先将硝酸钠、 磷酸氢二钾、 硫酸镁、 氯化钙、 柠檬酸、 柠檬酸铁铵、 乙二胺四乙酸二钠 盐、 碳酸钠， 微量元素溶液按比例配制成具鞘微鞘 藻培养液 ； 其次是将具鞘微鞘藻置于培养液中培 养并制得具鞘微鞘藻粉 ； 最后从具鞘微鞘藻粉中 提取具鞘微鞘藻藻蓝蛋白并将其纯化。本发明所 用方法易行、 操作方便、 安全可靠、 产量高、 产品质 量好， 且所用设备简单适用于工业化规模生产。 (。
3、51)Int.Cl. (56)对比文件 审查员 安玉苹 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利 权利要求书 1 页 说明书 3 页 CN 101220080 B1/1 页 2 1. 一种从具鞘微鞘藻中提取藻蓝蛋白的方法， 其特征在于包括如下步骤 ： A、 培养液的配制 ： 按每升水加入硝酸钠0.82.5g、 磷酸氢二钾0.020.05g、 硫酸镁 0.060.09g、 氯化钙0.020.05g、 柠檬酸0.0040.008g、 柠檬酸铁铵0.0040.008g、 乙二胺四乙酸二钠盐 0.001 0.003g、 碳酸钠 0.01 0.04g， 微量元素溶液 0.5 2ml， 其 。
4、中微量元素溶液按每 100ml 蒸馏水中加入硼酸 270 300mg、 四水氯化锰 170 200mg、 七 水硫酸锌1825mg、 二水钼酸钠1530mg、 五水硫酸铜610mg， 完全溶解后搅匀制得培 养液 ； B、 具鞘微鞘藻的培养 ： 首先是一级培养， 将具鞘微鞘藻藻种接入培养液中静止培养或 通气培养， 调节气流在1.53.5L.min-1， 光强控制在6585E.m-2.s-1， 温度控制在22 35， 培养 5 10 天后转入到二级培养 ； 其次是二级培养， 将一级培养所得的培养物接入 到新的培养液中通气培养， 调节气流在2.55L.min-1， 无菌处理， 光强控制在7595E.。
5、 m-2.s-1， 温度控制在 22 35， 培养 5 10 天后转入到三级培养 ； 第三是三级培养， 将二级 培养所得的培养物接入到新的培养液中通气培养， 调节气流在 3 6L.min-1， 无菌处理， 光 强控制在 70 100E.m-2.s-1， 温度控制在 22 35， 培养 5 10 天后作为继续培养的 接种种源 ； 第四是继续培养， 首先是小循环培养池培养， 将三级培养后所得的藻种， 接入小 循环培养池， 控制温度在 22 35， 利用自然光进行光照， 控制光照强度在 120 180E. m-2.s-1， 搅动培养基 ； 其次是大循环培养池培养， 将小循环培养池中培养 4 7 天后。
6、的具鞘 微鞘藻转接到大循环培养池中， 将大循环培养池中控制温度在 22 35， 利用自然光进行 光照， 控制光照强度在120180E.m-2.s-1培养1020天后的具鞘微鞘藻过滤收得具鞘 微鞘藻藻浆 ； C、 具鞘微鞘藻粉的制备 ： 将藻浆经过离心获得具鞘微鞘藻藻泥， 经浓缩、 脱水、 干燥、 粉 碎后得到具鞘微鞘藻粉 ； D、 具鞘微鞘藻藻蓝蛋白的抽提 ： 向具鞘微鞘藻粉中加入 7 10 倍重量的 0.05 0.1mol.L-1， pH 值为 6.0 8.0 的磷酸缓冲溶液， 充分搅匀， 然后置于 -10 -20下冰冻， 待冻结后取出， 置于 20 30下融溶， 待其完全融溶后， 再将其冰。
7、冻， 如此反复冻融 3 5 次， 然后 3000 6000rpm 离心 10 15min， 收集上清液， 即为藻蓝蛋白粗提液 ； E、 纯化 ： 在冰浴条件下， 在藻蓝蛋白的粗提液中加入饱和度为 50 70的硫酸铵避光 盐析 20 40min， 然后在 3 5下 3000 6000rpm 离心 15 25min， 弃除上清液， 用一倍 体积的0.050.1mol.L-1， pH值为6.08.0的磷酸缓冲液溶解沉淀物， 避光透析2030h 后离心， 取上清液用0.050.1mol.L-1， pH值为6.08.0的磷酸缓冲液平衡好的DEAE-52 离子交换柱， 并用 0.05 0.1mol.L-1。
8、， pH 值为 6.0 8.0 的磷酸缓冲液和 0.1 0.3mol. L-1的 NaCl 溶液洗脱， 用收集蓝色组分， 冷冻干燥得纯化的藻蓝蛋白。 2. 根据权利要求 1 所述的一种从具鞘微鞘藻中提取藻蓝蛋白的方法， 其特征在于 ： 小 循环培养池与大循环培养池中培养液的体积比为 1 20 25。 权 利 要 求 书 CN 101220080 B1/3 页 3 一种从具鞘微鞘藻中提取藻蓝蛋白的方法 技术领域 0001 本发明涉及一种从具鞘微鞘藻中提取藻蓝蛋白的方法， 属于生物技术领域。 背景技术 0002 具鞘微鞘藻属于蓝藻门、 蓝藻纲、 段殖体目、 颤藻科、 微鞘藻属。它是干旱、 半干旱 。
9、地区生物结皮中的优势种群。 目前， 对具鞘微鞘藻的利用一般只停留在进行人工藻结皮上， 具鞘微鞘藻之所以用于形成人工藻结皮进行荒漠治理， 主要的是由于其富含藻蓝蛋白。藻 胆蛋白是存在于某些藻类 ( 主要是红藻和蓝藻 ) 藻胆体中的一类色素复合蛋白。藻胆蛋白 具有强烈的荧光性， 发橙红色荧光， 而其本身则呈红色、 紫色或蓝色等， 故为有色多肽。 按光 谱特性可把藻胆蛋白分成四类 ： 藻红蛋白， 藻蓝蛋白， 藻红蓝蛋白和别藻蓝蛋白。藻蓝蛋白 是其中的一类蓝色色素蛋白。藻蓝蛋白除可用于植物光合作用研究外， 还具有很高的应用 开发价值 ： 可作为纯天然的色素， 用于食品、 化妆品和染料等工业 ； 试剂级。
10、藻蓝蛋白可制成 荧光试剂， 应用于医学临床诊断和免疫学及生物工程等研究领域中 ； 还可制成药品用于医 疗保健。目前在食品等行业中使用的蓝色素主要还是化学合成色素， 而天然蓝色素使用的 很少， 藻蓝蛋白大多是从螺旋藻和大型海藻中提取得到， 它们的藻蓝蛋白含量大都比具鞘 微鞘藻的要低， 另外， 培养大型海藻的成本远比培养具鞘微鞘藻的成本要高。 发明内容 0003 本发明目的在于提供一种从具鞘微鞘藻中提取藻蓝蛋白的方法。 0004 为实现上述目的， 本发明提供一种从具鞘微鞘藻中提取藻蓝蛋白的方法包括如下 步骤 ： 0005 A、 培养液的配制 ： 按每升水加入硝酸钠0.82.5g、 磷酸氢二钾0.0。
11、20.05g、 硫 酸镁 0.06 0.09g、 氯化钙 0.02 0.05g、 柠檬酸 0.004 0.008g、 柠檬酸铁铵 0.004 0.008g、 乙二胺四乙酸二钠盐 0.001 0.003g、 碳酸钠 0.01 0.04g， 微量元素溶液 0.5 2ml， 其中微量元素溶液按每 100ml 蒸馏水中加入硼酸 270 300mg、 四水氯化锰 170 200mg、 七水硫酸锌1825mg、 二水钼酸钠1530mg、 五水硫酸铜610mg， 完全溶解后搅 匀制得培养液 ； 0006 B、 具鞘微鞘藻的培养 ： 首先是一级培养， 将具鞘微鞘藻藻种接入培养液中通气培 养， 调节气流在 1.。
12、5 3.5L.min-1， 光强控制在 65 85E.m-2.s-1， 温度控制在 22 35， 培养 5 10 天后转入到二级培养 ； 其次是二级培养， 将一级培养所得的培养物接入到新的 培养液中通气培养， 调节气流在2.55L.min-1， 无菌处理， 光强控制在7595E.m-2.s-1， 温度控制在 22 35， 培养 5 10 天后转入到三级培养 ； 第三是三级培养， 将二级培养所 得的培养物接入到新的培养液中通气培养， 调节气流在 3 6L.min-1， 无菌处理， 光强控制 在 70 100E.m-2.s-1， 温度控制在 22 35， 培养 5 10 天后作为继续培养的接种种 。
13、源 ； 第四是继续培养， 首先是小循环培养池培养， 将三级培养后所得的藻种， 接入小循环培 养池， 控制温度在2235， 利用自然光进行光照， 控制光照强度在120180E.m-2.s-1， 说 明 书 CN 101220080 B2/3 页 4 搅动培养基 ； 其次是大循环培养池培养， 将小循环培养池中培养 4 7 天后的具鞘微鞘藻 转接到大循环培养池中， 小循环培养池与大循环培养池中培养液的体积比为 1 20 25， 将大循环培养池中控制温度在 22 35， 利用自然光进行光照， 控制光照强度在 120 180E.m-2.s-1培养 10 20 天后的具鞘微鞘藻过滤收得具鞘微鞘藻藻浆 ； 。
14、0007 上述具鞘微鞘藻接种时， 按每升培养液 0.1 0.5g 湿重的比例接入。 0008 C、 具鞘微鞘藻粉的制备 ： 将藻浆经过离心获得具鞘微鞘藻藻泥， 经浓缩、 脱水、 干 燥、 粉碎后得到具鞘微鞘藻粉 ； 0009 D、 具鞘微鞘藻藻蓝蛋白的抽提 ： 向具鞘微鞘藻粉中加入 7 10 倍重量的 0.05 0.1mol.L-1， pH 值为 6.0 8.0 的磷酸缓冲溶液， 充分搅匀， 然后置于 -10 -20下冰冻， 待冻结后取出， 置于 20 30下融溶， 待其完全融溶后， 再将其冰冻， 如此反复冻融 3 5 次， 然后 3000 6000rpm 离心 10 15min， 收集上清液。
15、， 即为藻蓝蛋白粗提液 ； 0010 E、 纯化 ： 在冰浴条件下， 在藻蓝蛋白的粗提液中加入饱和度为 50 70的硫酸铵 避光盐析 20 40min， 然后在 3 5下 3000 6000rpm 离心 15 25min， 弃除上清液， 用一倍体积的 0.05 0.1mol.L-1， pH 值为 6.0 8.0 的磷酸缓冲液溶解沉淀物， 避光透析 20 30h 后离心， 取上清液用 0.05 0.1mol.L-1， pH 值为 6.0 8.0 的磷酸缓冲液平衡好 的DEAE-52离子交换柱， 并用0.050.1mol.L-1， pH值为6.08.0的磷酸缓冲液和0.1 0.3mol.L-1的 。
16、NaCl 溶液洗脱， 用收集蓝色组分， 冷冻干燥得纯化的藻蓝蛋白。 0011 本发明具有以下优点和卓著的效果 ： 方法易行、 经济快捷、 操作方便、 产量高、 产品 质量好、 安全可靠， 且所用设备简单适用于工业化规模生产。 具体实施方式 0012 从具鞘微鞘藻提取藻蓝蛋白的具体实施步骤如下 ： 0013 A、 培养液的配制 0014 按每升水加入硝酸钠 1.5g、 磷酸氢二钾 0.04g、 硫酸镁 0.075g、 氯化钙 0.036g、 柠 檬酸 0.006g、 柠檬酸铁铵 0.006g、 乙二胺四乙酸二钠盐 0.001g、 碳酸钠 0.02g， 微量元素溶 液 1ml， 其中微量元素溶液按。
17、每 100ml 蒸馏水中加入硼酸 286mg、 四水氯化锰 181mg、 七水硫 酸锌 22.2mg、 二水钼酸钠 25.2mg、 五水硫酸铜 7.9mg， 完全溶解后搅匀制得培养液。 0015 B、 具鞘微鞘藻的培养 0016 (1) 一级培养 ： 将具鞘微鞘藻种接入装有培养液的三角瓶 (150 200ml) 中， 静止 培养或通气培养， 通气培养时， 调节气流大小在2.5L.min-1， 气流经过棉花球进行无菌处理， 光强控制在 70E.m-2.s-1， 温度控制在 30。当培养 7 10 天后， 转入到二级培养。 0017 (2) 二级培养 ： 将一级培养所得的培养物接入到装有培养液的培。
18、养瓶 (500 1000ml)中， 通气培养， 调节气流大小在3L.min-1， 无菌处理， 光强控制在80E.m-2.s-1， 温度 控制在 30。当培养 7 10 天后， 转入到三级培养。 0018 (3) 三级培养 ： 将二级培养所得的培养物接入到装有培养液的培养瓶 (5000 20000ml)， 通气培养， 调节气流大小在 5L.min-1， 无菌处理， 光强控制在 90E.m-2.s-1， 温度 控制在 30。培养 7 10 天后， 便可作为继续培养的接种种源。 0019 (4) 继续培养 0020 小循环培养池 (1 2m3) 培养 ： 采用三级培养后所得的藻种， 接入小循环培养 。
19、说 明 书 CN 101220080 B3/3 页 5 池。采用玻璃温棚控制温度在 30， 利用自然光进行光照， 采用遮荫网控制光照强度在 120 180E.m-2.s-1， 叶轮或潜水泵搅动培养基。 0021 大循环培养池(4060m3)培养 ： 将小循环培养池中培养47天的具鞘微鞘藻 转接到大循环培养池中， 小循环培养池与大循环培养池中培养液的体积比为 1 20 25， 其他培养条件与小循环培养池的培养条件相同。 0022 上述具鞘微鞘藻接种时， 按每升培养液 0.1 0.5g 湿重的比例接入。 0023 C、 具鞘微鞘藻粉的制备 0024 将大循环培养池中培养1520天后的具鞘微鞘藻用泵。
20、抽到过滤装置振动斜 面筛上， 经过振动斜面筛后， 收得具鞘微鞘藻藻浆， 然后将藻浆经过离心机离心， 获得具鞘 微鞘藻藻泥。将具鞘微鞘藻藻泥经浓缩、 脱水、 干燥、 粉碎后得到具鞘微鞘藻粉。 0025 D、 具鞘微鞘藻藻蓝蛋白的抽提 0026 向具鞘微鞘藻粉中加入 7 10 倍重量的 0.05 0.1mol.L-1， pH 值为 6.0-8.0 的 磷酸缓冲溶液， 充分搅匀。然后置于 -10 -20下冰冻， 待冻结后取出， 置于 20 30下 融溶， 待其完全融溶后， 再将其冰冻。如此反复冻融 3 5 次。绝大部分藻蓝蛋白从伪枝藻 细胞中被提取出来， 然后30006000rpm离心1015min。
21、， 收集上清液， 即为藻蓝蛋白粗提 液。 0027 E、 纯化 0028 在冰浴条件下， 在藻蓝蛋白的粗提液中加入饱和度为 50 70的硫酸铵避光盐 析 20 40min， 然后在 3 5下 3000 6000rpm 离心 15 25min， 弃除上清液， 用一倍体 积的 0.05 0.1mol.L-1， pH 值为 6.0 8.0 的磷酸缓冲液溶解沉淀物， 避光透析 20 30h 后离心， 取上清液用0.050.1mol.L-1， pH值为6.08.0的磷酸缓冲液平衡好的DEAE-52 离子交换柱， 并用 0.05 0.1mol.L-1， pH 值为 6.0 8.0 的磷酸缓冲液和 0.1 0.3 mol. L-1的 NaCl 溶液洗脱， 用自动部分收集器收集蓝色组分， 冷冻干燥得纯化的藻蓝蛋白。 说 明 书 。