技术领域
本发明属生物技术领域，涉及定量PCR检测试剂盒，具体涉及一种双探针 实时荧光定量PCR检测细菌性感染患儿血液、脑脊液、胸水、腹水等样本中细 菌革兰阴、阳性菌分型及实时定量的方法。
背景技术
败血症是指细菌进入血循环，并在其中生长繁殖、产生毒素而引起的全身 性严重感染的疾病。儿童特别是新生儿由于自身抵抗力差、皮肤薄嫩、出生后 脐部未愈合等均易患败血症。小儿败血症如果不能早期诊断，及时、彻底地治 疗，可致化脓性脑膜炎发生，影响小儿智力发育，导致儿童伤残和死亡。儿童 败血症缺乏特异性临床症状及早期可靠的实验室指标，早期诊断十分困难。目 前已有多种实验室方法应用于儿童败血症的诊断中，如血培养、血常规、C反 应蛋白、病灶分泌物培养及涂片、病原菌抗原检测以及限制性内切酶分析 (RFLP)等方法。但是由于上述方法费时、阳性率低，易污染，且有些指标非 特异性，难以对儿童败血症做出迅速、准确的判断。
随着分子生物学技术的飞速发展及其在医学研究中的广泛应用，特别是最 近几年兴起的荧光定量PCR技术，该方法具有准确性高、重现性好等特点，已 广泛用于基因表达研究、病原体检测、SNP分析及基因分型等诸多领域。该方 法采用完全闭管检测，省去了对PCR产物后处理，避免了交叉污染，结果判 断由计算机完成，简化了操作步骤，并加强了结果的可靠性。随着荧光定量技 术、仪器以及材料科学的发展，荧光定量技术不仅仅在定量上发挥它的优势， 而且运用TaqMan或TaqMan-MGB探针的5`末端标记上不同的荧光染料 (FAM、HEX等)技术可以进行基因分型、基因突变检测和SNP分析等方面 研究。因此，利用双(多)通道荧光定量PCR仪，进行实时细菌革兰阴、阳 性菌分型、定量的双检测临床应用成为可能。
16SrRNA基因是细菌染色体上编码rRNA相对应的DNA序列。16SrRNA 编码基因以多拷贝形式存在于所有细菌染色体基因组中，每个细菌约含5～10 个拷贝，这使得对该基因的检测具有敏感性。16SrRNA编码基因内部结构由可 变区和保守区组成。保守区为所有细菌所共有，有“分子化石”之称。可根据 保守区设计各种细菌的通用引物，也可根据可变区设计细菌的革兰阴、阳性特 异分型探针，用于细菌革兰阴阳性分型，目前几乎所有病原菌的16SrRNA基 因测序已完成。因此16SrRNA基因已成为较理想的细菌基因分类的靶序列， 逐渐成为细菌鉴别、分类的金标准。
运用实时荧光定量PCR技术，采用通用引物和革兰阴、阳性双特异荧光 探针，开发研制用于细菌革兰阴、阳性菌分型及定量双检测试剂盒。并通过对 临床上疑似细菌性感染的患儿外周血等标本的检测，旨在为临床败血症及化脓 性脑膜炎等细菌性感染疾病的早期病原体诊断提供依据。以便早期及时制定治 疗方案，减少死亡率及后遗症。
发明内容
本发明的目的是提供一种细菌革兰双检实时荧光定量PCR检测试剂盒， 包含：定量PCR反应液、标准品、对照品、细菌DNA抽提裂解液，其中定量 PCR反应液单管分装，矩阵排列，标准品为革兰阳性和革兰阴性标准品，对照 品为阳性和阴性对照品。
其中细菌DNA抽提裂解液含有10mmol/L Tri-HCl、pH 7.65mmol/L乙二 胺四乙酸二钠(EDTA)、0.5％十二烷基硫酸钠(SDS)；定量PCR反应液含有 PCR缓冲液、MgCl2、dNTPs、细菌通用引物、革兰阳性荧光探针、革兰阴性 荧光探针、耐热DNA聚合酶(Taq DNA聚合酶)。细菌DNA抽提裂解液和定 量PCR反应液必须用0.22μm膜过滤预处理。
检测用引物分上游引物和下游引物：
上游引物序列为：5`-CAACGCGAAGAACCTTACC-3`
下游引物序列为：5′-ACGTCATCCCCACCTTCC-3′。
革兰阳性探针为：5`-FAM-ACGACAACCATGCACCACCTG-TAMRA-3`
革兰阴性探针为：5`-HEX-CAACATTTCACAACACGAGCTG-TAMRA-3`
革兰阳性标准品序列为：
CAACGCGAAG AACCTTACCA AATCTTGACA TCCTTTGACA ACTCTAGAGA
TAGAGCCTTC CTCTTCGGGG GACAAAGTGA CAGGTGGTGC ATGGTTGTCG
TCAGCTCGTG TCGTGAGATG TTGGGTTAAG TCCCGCAACG AGCGCAACCC
TTAAGCTTAG TTGCCATCAT TAAGTTGGGC ACTCTAAGTT GACTGCCGGT
GACAAACCGG AGGAAGGTGG GGATGACGT
革兰阴性标准品序列为：
CAACGCGAAG AACCTTACCT GGTCTTGACA TCCACAGAAC TTTCCAGAGA
TGGATTGGTG CCTTCGGGAA CTGTGAGACA GGTGCTGCAT GGCTGTCGTC
AGCTCGTGTT GTGAAATGTT GGGTTAAGTC CCGCAACGAG CGCAACCCTT
ATCCTTTGTT GCCAGCGGTC CGGCCGGGAA CTCAAAGGAG ACTGCCAGTG
ATAAACTGGA GGAAGGTGGG GATGACGT
对照品分为阳性对照品和阴性对照品，阴性对照为无菌注射用水样品， 阳性对照为金葡萄球菌和大肠埃希菌灭活DNA样品。
本发明提供的定量试剂保存于-20℃，尽量减少反复冻融。
本发明的另一个目的是提供所述的细菌革兰双检实时荧光定量PCR检测 试剂盒在检测细菌革兰阴、阳性菌DNA中的应用。
本发明试剂盒使用方法：
每次检测均应设立阳性对照和阴性对照。标准品用无菌去离子水稀释为 1×102-1×109拷贝/ml。
细菌DNA提取：采集新鲜的全血1ml放置于含枸缘酸钠抗凝集液的无菌 真空采血管中，混匀取全血50ul加等量的细菌DNA抽提裂解液置100℃煮沸 10min，12000r/min离心5min，取5μl上清作为PCR模板。菌液、脑脊液、胸 水、腹水等样本方法同上。
扩增检测：在双色(或以上)荧光定量PCR仪上进行，总体积50μl，其 中45.0μl PCR反应液，5μl检测样品(提取产物、标准品、阳性或阴性对照)。 反应条件：94℃5min预变性，94℃20sec、60℃60sec为一个循环，共循环 40次。
荧光定量结果报告：①革兰阴、阳性探针各自CT值(threshold cycle，每个 反应管内的荧光信号达到设定的域值时所经历的循环数)均等于40.0的标本为 阴性，②革兰阴、阳性探针其中之一CT值≤35的标本，检测结果为该相应菌 阳性；若双探针CT值均≤35，则判定为阴、阳性菌混合阳性。③CT值在35～ 40之间为灰值区域，重做后大于37值为阴性。根据所获得的标准曲线，计算 待测标本各革兰阴、阳性菌量值(拷贝数/ml)。
本发明的有益之处是：运用实时荧光定量PCR技术，采用细菌通用引物 和革兰阴、阳性双特异荧光探针，开发研制用于细菌革兰阴、阳性菌分型及定 量双检测试剂盒。该发明是在检测通用细菌实时荧光定量PCR的基础，增添了 细菌革兰分型的探针，比传统的细菌革兰染色方法更简便、快速和准确；同时 我们通过实时荧光定量，不仅进行细菌革兰阴、阳性菌分型，而且对检测的阴、 阳性菌进行实时准确定量，对临床上疑似细菌性感染的患儿提供早期明确诊 断，区分革兰阴、阳性菌感染及感染的滴度数量水平，以便早期及时制定治疗 方案，减少死亡率及后遗症。
附图说明
图1为本发明试剂盒结构示意图。
图2为革兰阳性标准品金色葡萄球菌片段序列。
图3为革兰阴性标准品大肠埃希菌片段序列。
图4为细菌革兰阳性标准品荧光定量PCR标准曲线。
图5为细菌革兰阴性标准品荧光定量PCR标准曲线。
具体实施方式
本发明结合附图和具体实施例作进一步说明。应该理解，这些实施例仅用 于说明目的，而不用于限制本发明范围。
实施例1
参见图1，本发明提供的一种细菌革兰双检实时荧光定量PCR检测试剂盒， 包含：定量PCR反应液1(单管分装)、革兰阳性标准品2、革兰阴性标准品3、 阳性对照品4、阴性对照品5、细菌DNA抽提裂解液6、盒体8。也可以含操 作说明书7。
其中细菌DNA抽提裂解液含有10mmol/L Tri-HCl、pH 7.65mmol/L EDTA、 0.5％SDS；定量PCR反应液含有PCR缓冲液、MgCl2、dNTPs、细菌通用引物、 革兰阳性荧光探针、革兰阴性荧光探针、耐热DNA聚合酶(Taq DNA聚合酶)。 细菌DNA抽提裂解液和定量PCR反应液必须用0.22μm膜过滤预处理。 检测用引物分上游引物和下游引物：
上游引物序列为：5`-CAACGCGAAGAACCTTACC-3`
下游引物序列为：5′-ACGTCATCCCCACCTTCC-3′。
革兰阳性探针为：5`-FAM-ACGACAACCATGCACCACCTG-TAMRA-3`
革兰阴性探针为：5`-HEX-CAACATTTCACAACACGAGCTG-TAMRA-3`
革兰阳性标准品序列为：
CAACGCGAAG AACCTTACCA AATCTTGACA TCCTTTGACA ACTCTAGAGA
TAGAGCCTTC CTCTTCGGGG GACAAAGTGA CAGGTGGTGC ATGGTTGTCG
TCAGCTCGTG TCGTGAGATG TTGGGTTAAG TCCCGCAACG AGCGCAACCC
TTAAGCTTAG TTGCCATCAT TAAGTTGGGC ACTCTAAGTT GACTGCCGGT
GACAAACCGG AGGAAGGTGG GGATGACGT
革兰阴性标准品序列为：
CAACGCGAAG AACCTTACCT GGTCTTGACA TCCACAGAAC TTTCCAGAGA
TGGATTGGTG CCTTCGGGAA CTGTGAGACA GGTGCTGCAT GGCTGTCGTC
AGCTCGTGTT GTGAAATGTT GGGTTAAGTC CCGCAACGAG CGCAACCCTT
ATCCTTTGTT GCCAGCGGTC CGGCCGGGAA CTCAAAGGAG ACTGCCAGTG
ATAAACTGGA GGAAGGTGGG GATGACGT
对照品分为阳性对照品和阴性对照品，阴性对照为无菌注射用水样品， 阳性对照为金葡萄球菌和大肠埃希菌灭活DNA样品。
本发明提供的定量试剂保存于-20℃，尽量减少反复冻融。
实施例2 细菌革兰双检荧光定量PCR法检测临床常见细菌株
一、材料：
选取临床引起败血症和化脓性脑膜炎(化脑)的常见的标准菌株10种菌 属12个菌株(革兰阳性菌6株，革兰阴性菌6株)和临床分离培养株17种菌 属23个菌株(革兰阳性菌12株，革兰阴性菌11株)(参见表1)，上述标准菌 株由大连宝生物技术公司提供；临床分离培养株由浙江省儿童医院细菌室及感 染实验室提供。
二、引物及探针设计与合成：
从Genbank中筛选不同临床细菌的16S rRNA基因序列，应用MegAlign 软件分析其基因序列，寻找不同细菌种属间的保守片段，分析生物进化树的规 律，根据引物和探针的设计原则，在这些细菌保守区域筛选到一对通用引物和 两条分别代表革兰阳性菌和革兰阴性菌的特异性分型探针。
上游引物序列为：5`-CAACGCGAAGAACCTTACC-3`
下游引物序列为：5′-ACGTCATCCCCACCTTCC-3′均由上海生工 公司合成。
革兰阳性探针为：5`-FAM-ACGACAACCATGCACCACCTG-TAMRA-3`
革兰阴性探针为：5`-HEX-CAACATTTCACAACACGAGCTG-TAMRA-3` 均由大连宝生物技术公司合成。
三、检测标准品制备：
用上述引物扩增标准菌株金色葡萄球菌和大肠埃希菌，割胶回收PCR产物 并经鉴定和纯化后即用克隆系统插入pGEM-T-Easy克隆载体，抽提重组克隆 质粒，用载体引物M13R对重组的阳性克隆进行测序验证。测定浓度并换算成 (拷贝数/体积)。
结果：经测序，上述设计标准品完全与预期相符，其中革兰阳性标准品片 段序列为金色葡萄球菌，序列参见图2；革兰阴性标准品片段序列为大肠埃希 菌，序列参见图3。
四、临床常见菌革兰双检荧光定量PCR实验：
对上述共35株标准菌和临床分离培养菌进行单管实时革兰阴、阳性菌双 检荧光定量PCR检测，结果发现18株革兰阳性菌株经革兰阳性探针检测均为 阳性，且检测的CT值在14～23之间，17株革兰阴性菌株经革兰阳性探针检 测均为阴性；17株革兰阴性菌株经革兰阴性探针检测均为阳性，且检测的CT 值在14～24之间，18株革兰阳性菌株经革兰阴性探针检测均为阴性。革兰阴、 阳双探针之间未有交叉信号出现，具有很高的特异性(参见表1)。
表1 标准菌株和临床分离株细菌革兰双检测荧光定量PCR结果
菌属 菌种 G+Probe CT± SD G-Probe CT± SD 标准菌株 G+菌 葡萄球菌属 链球菌属 芽胞杆菌属 微球菌属 G-菌 埃希菌属 克雷伯菌属 肠杆菌属 假单胞菌属 志贺氏菌 沙雷菌属 金黄色葡萄球菌 表皮葡萄球菌 溶血葡萄球菌 肺炎链球菌 枯草杆菌 藤黄微球菌 大肠埃希菌 肺炎克雷伯氏菌 产气肠杆菌 绿脓杆菌 鲍氏志贺氏菌 粘质沙雷菌 16.97±0.45 21.06±0.19 20.17±0.97 21.87±0.45 16.28±1.08 19.15±0.67 40.00±0 40.00±0 40.00±0 40.00±0 40.00±0 40.00±0 40.00±0 40.00±0 40.00±0 40.00±0 40.00±0 40.00±0 14.92±0.18 17.48±0.58 16.12±0.72 22.84±0.72 16.87±0.19 22.47±0.17 临床培养菌株 G+菌 葡萄球菌属 链球菌属 李斯特菌属 金黄色葡萄球菌 表皮葡萄球菌 溶血葡萄球菌 人葡萄球菌 腐生葡萄球菌 肺炎链球菌 溶血性链球菌 无乳链球菌 产单核李斯特菌 15.29±0.67 20.19±0.78 22.09±0.49 22.45±0.97 21.49±0.46 20.69±0.81 22.57±0.67 17.24±0.28 14.88+0.46 40.00±0 40.00±0 40.00±0 40.00±0 40.00±0 40.00±0 40.00±0 40.00±0 40.00±0
棒状杆菌属 丙酸杆菌属 分枝杆菌属 G-菌 埃希菌属 克雷伯菌属 肠杆菌属 嗜血杆菌属 奈必菌属 拟杆菌属 假单胞菌属 变形杆菌属 不动杆菌属 枸橼酸杆菌属 沙门菌属 类白喉棒状杆菌 痤疮丙酸杆菌 结核杆菌 大肠埃希菌 肺炎克雷伯氏菌 阴沟肠杆菌 流感嗜血杆菌 脑膜炎球菌 脆弱拟杆菌 铜绿色假单胞菌 普通变形杆菌 醋酸钙不动杆菌 费劳地枸橼酸杆菌 鼠伤寒沙门菌 17.10±0.24 18.99±0.28 23.16±0.25 40.00±0 40.00±0 40.00±0 40.00±0 40.00±0 40.00±0 40.00±0 40.00±0 40.00±0 40.00±0 40.00±0 40.00±0 40.00±0 40.00±0 16.02±0.58 18.17±0.56 22.98±0.24 24.86±0.84 23.17±0.18 18.19±0.34 16.87±0.58 20.52±0.64 18.29±0.42 20.94±0.28 22.58±0.61 备注：CT值小于40的为阳性，CT值40为阴性
实施例3 细菌革兰双检荧光定量PCR法检测败血症的应用
一、标本检测：
选取2005年1月～2007年1月，我院新生儿病房及NICU临床疑为细菌 感染(均有细菌感染的易感因素及临床表现)的住院新生儿(年龄1d～28d， 男325例，女275例)600例，该600例新生儿患儿的易感因素及临床表现主 要有早产儿、败血症、肺炎、肠炎、发热、感染性休克等为主。选同期因非感 染性疾病住院的新生儿30例标本作为对照。每例抽取静脉血各1～2ml分别送 检血培养和细菌革兰双检荧光定量PCR基因检测。
二、临床样品检测结果
细菌革兰阴、阳性标准品检测结果参见图4、图5。
600例患儿血标本细菌革兰双检荧光定量PCR和血培养检测结果如下：
表2 细菌革兰双检荧光定量PCR(FQ-PCR)与血培养检测结果对照
血培养阳性 血培养阴性 合计 FQ-PCR阳性 FQ-PCR阴性 合计 32 2 34 16 550 566 48 552 600 x2＝9.39；p＜0.01.
细菌革兰双检荧光定量PCR检测阳性率8.00％(48/600)，血培养阳性率 5.67％(34/600)，前者明显高于后者，差异有统计学意义P＜0.01(参见表2)， 且48份荧光定量为阳性的标本中有40份是革兰阳性菌感染，8份为革兰阴性 菌感染。30例非感染性疾病患儿细菌革兰双检荧光定量PCR和血培养均为阴 性。若以血培养作为对照，细菌革兰双检荧光定量PCR方法的诊断敏感性为 94.12％，特异性为97.17％，正确诊断指数为0.913。
本发明是结合最佳实施例进行描述的，然而在阅读了本发明的上述内容 后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于 本申请所附权利要求书所限定的范围。
本发明涉及的序列