技术领域
本发明涉及一种用微生物纯化粗萘二甲酸的方法，以及通过此 方法产生的结晶形式的2，6-萘二甲酸。更具体地，本发明涉及一种 纯化粗萘二甲酸的方法，通过使具有将2-甲酰基-6-萘甲酸转化为 2，6-萘二甲酸的能力的微生物与粗萘二甲酸反应以去除作为杂质含 在粗萘二甲酸中的2-甲酰基-6-萘甲酸，在特殊条件下向反应液中 添加酸性溶液，搅拌混合溶液使粗萘二甲酸结晶，洗涤结晶的粗萘 二甲酸以去除其他包含在结晶的粗萘二甲酸中的杂质，并且干燥洗 涤过的产物从而得到纯结晶形式的2，6-萘二甲酸。
背景技术
2，6-萘二甲酸(NDA)及其二酯(如2，6-萘二甲酸酯(NDC))是制备 多种聚合材料(如聚酯和聚酰胺)的有用的单体。例如，NDA和NDC 能与乙二醇缩合形成高性能聚酯材料聚2，6-萘二甲酸乙二酯 (PEN)。由PEN制成的纤维和薄膜与由聚对苯二甲酸乙二酯(PET) 制成的那些相比显示出高强度和优越的热性能。基于这些优势， PEN非常适用于商业制品(如能够用于制造磁性录音带和电子元件 的薄膜)的生产。另外，由于PEN的高抗气体(特别是二氧化碳、氧 气和水蒸气)扩散性，由PEN制成的薄膜能用于制造食品容器，特 别是热装食品容器。PEN还能用于生产可用于轮胎帘布的制造的增 强纤维。
NDC通常通过氧化2，6-二甲基萘(2，6-DMN)以得到粗萘二甲酸 (cNDA)并且使cNDA酯化来生成。目前，NDC用作合成PEN的主 要原料。然而，当NDC用作合成PEN的原料时，相比于应用2，6- 萘二甲酸(NDA)时，存在一些问题。首先，在NDA的缩合期间， 形成副产物水，而在NDC的情况下形成副产物甲醇，因而有爆炸 的风险。其次，由于纯NDC通过NDA的酯化和酯化产物的纯化生 成，相比于应用NDA，包括一个额外的工序。第三，考虑到现有 的PET生产设备的应用，NDC的应用是不适合的。尽管有这些与 NDC的应用相关的问题，NDC还是优选用于生产PEN，因为生产 具有合成PEN所需的纯度的纯化的NDA更加困难。
氧化2，6-二甲基萘(2，6-DMN)形成含有多种杂质(如2-甲酰基 -6-萘甲酸(FNA)、2-萘甲酸(NA)和偏苯三酸)的cNDA。特别地，在 cNDA中FNA的存在会使用于产生PEN的聚合终止，导致低聚合 度。此低聚合度不利地影响最终聚合物(即PEN)的物理性质，并且 导致聚酯的着色。因而去除存在于cNDA中的FNA是必要的，但 是去除FNA存在困难。
在这些情况下，已经进行了有关用于去除存在于cNDA中的 FNA或纯化NDA的各种化学方法的研究。例如，通过以下步骤来 产生NDA：i)重结晶cNDA，ii)多次氧化cNDA，或iii)用甲醇处理 cNDA以产生NDC并水解NDC。另外，通过cNDA的氢化产生纯 化的NDA。除了这些化学方法外，如溶剂处理、熔融/结晶、高压 结晶和超临界萃取等的许多方法已被用于纯化NDA。
例如，美国专利No.5,859,294公开了一种方法，用于萘二甲 酸的生成，其包含将粗萘二甲酸溶于含有脂肪族胺或脂环族胺的水 溶液中，去除作为杂质的重金属成分直到重金属成分的含量基于粗 萘二甲酸为100ppm或更低，和加热含有萘二甲酸胺盐的水溶液以 通过蒸馏掉胺提供高纯度的萘二甲酸。
美国专利No.6,255,525公开了一种方法，用于制备具有改善 的纯度的芳香性羧酸，包括以下步骤：在77～121kg/cm2的压力和 277～316℃的温度下，在氢气存在下，将包含不纯的芳香性羧酸和 水的混合物与不含氢化金属成分的碳催化剂接触；冷却混合物形成 结晶的芳香性羧酸；和从冷却的混合物中去除结晶的芳香性羧酸。
关于NDA的结晶反应，美国专利No.6,087,531教示了一种用 于回收萘二甲酸(NDA)晶体的方法，该方法包含以下步骤：在125～ 400℃下，在碱性水溶液(如碱金属碱的水溶液、氢氧化物水溶液或 碱金属碳酸盐的水溶液)中溶解聚萘二甲酸亚烷基二酯；在170～ 240℃下用酸中和水溶液；并回收NDA。例如，通过以下步骤回收 NDA晶体：在125～400℃下，将聚酯材料溶解于NaOH或KOH溶 液中，用醋酸中和水溶液，并且回收NDA。
美国专利No.6,426,431教示了一种将2，6-NDA纯化产率提高 了高达45％的方法，该方法包含在0～200psi的CO2压力和0～50℃ 的温度下处理K2-NDA水溶液形成KH-NDA，以高于1∶8(KH-NDA： 水)的重量比将KH-NDA悬浮在水中，并且进而在高于100℃(140～ 160℃)的温度和高于100psi(175～250psi)的CO2压力下处理悬浮 液。
然而，由于这些方法需要高温和高压条件、耗时处理和大量昂 贵材料的应用以生成高纯度NDA晶体，其在经济上是不利的。这 些方法的其他劣势在于非常低的纯化产率和NDA纯度，以及个体 NDA晶体颗粒间发生凝聚，其使得方法难于在工业上实施。
发明内容
因此，考虑到现有技术的问题而产生了本发明，并且本发明的 一个目的是提供一种通过在常温常压条件下用能够将FNA转化为 NDA的微生物纯化和结晶萘二甲酸，从而以高产率有效地生成高 纯度NDA的方法。
本发明的另一个目的是提供一种通过本方法生成的均一尺寸 的高纯度NDA晶体。
为了达到上述目的，依照本发明的一个方面，提供了一种用微 生物纯化粗萘二甲酸的方法，此方法包含以下步骤：(a)使具有将 2-甲酰基-6-萘甲酸转化成2，6-萘二甲酸的能力的微生物与粗萘二 甲酸反应以去除包含在粗萘二甲酸中的2-甲酰基-6-萘甲酸，(b)向 步骤(a)中制备的反应液中加入酸性溶液以调节反应液的pH，并且 通过搅拌使混合液反应以使粗萘二甲酸结晶，(c)洗涤结晶的粗萘二 甲酸以去除含在结晶的粗萘二甲酸中的杂质，和(d)干燥洗涤后的产 物以得到纯的结晶形式的2，6-萘二甲酸。
依据本发明的另一个方面，提供了通过纯化方法生成的纯的结 晶形式的2，6-萘二甲酸。
依据本发明的纯化方法，由于粗萘二甲酸分别在适合的条件下 用能够将FNA转化成NDA的微生物纯化和结晶，所以能够有利地 在工业规模上以有利于环境的方式生产高纯度的结晶2，6-萘二甲 酸。
附图说明
通过以下的详细说明连同随附的附图，将更清晰地理解本发明 的上述以及其他目的、特征和其他优势，其中：
图1表示用于本发明方法的假单胞菌(Pseudomonas sp.)菌株 HN-72的16S rDNA的部分序列；
图2是依据本发明实施例1第三步得到的结晶cNDA的显微照 片；
图3a、3b和3c是在本发明的实验实施例1中，通过向纯化的 cNDA的反应液中添加硫酸溶液并分别以50rpm、200rpm和800rpm 的不同速率搅拌混合液得到的cNDA晶体的显微照片；
图4a、4b和4c是在本发明的实验实施例2中，通过向纯化的 cNDA的反应液中添加硫酸溶液并分别在15℃、40℃和80℃的不同 温度下搅拌混合液得到的cNDA晶体的显微照片；和
图5表示依据本发明的一个实施方式用于实施纯化粗萘二甲 酸的方法的纯化体系。
具体实施方式
以下提供了依据本发明的方法的各个步骤的更详细的解释。
(i)第一步：用微生物纯化
在此步骤中，使具有将2-甲酰基-6-萘甲酸转化成2，6-萘二甲酸 的能力的微生物与粗萘二甲酸反应以将含在粗萘二甲酸中的2-甲 酰基-6-萘甲酸转化成2，6-萘二甲酸。
第一步包括以下子步骤：1)将微生物接种在液体培养基上，振 摇培养接种体，通过离心收集培养的细菌，并在生理盐水或蒸馏水 中悬浮收集的细菌以使细菌活化，2)将作为基质的粗萘二甲酸 (cNDA)与缓冲液混合，通过添加碱性溶液调节混合液的pH以制备 用于随后纯化的反应液，和3)将在1)中制备的活性细菌与在2)中 制备的反应液反应以将含在粗萘二甲酸中的2-甲酰基-6-萘甲酸转 化成2，6-萘二甲酸，从而2，6-萘二甲酸的纯度提高。
任何微生物(如果其具有分解2-甲酰基-6-萘甲酸的能力)都可 以应用而无需任何特别的限制。属于芽孢杆菌属或假单胞菌属的微 生物优选应用于本发明的方法。
最优选的是芽孢杆菌(Bacillus sp.)F-1(KCTC-10342BP)、芽孢杆菌 (Bacillus sp.)F-3(KCTC-10335BP)，或假单胞菌(Pseudomonas sp.)HN-72 (KCTC-10819BP)。芽孢杆菌F-1和芽孢杆菌F-3描述于韩国专利申请 No.2002-0087819中，而假单胞菌菌株HN-72于2005年6月21 日保藏在作为国际保藏机构的Korea Research Institute of Bioscience and Biotechnology(KRIBB)的基因库中，保藏编号为KCTC-10819BP。
在25～45℃的宽的温度范围内，优选28～35℃，这些微生物 能够容易地在液体培养基(如LB或M9培养基)中培养。
缓冲液的种类不特别限制。作为缓冲液，可以用例如，水、碳 酸钠缓冲液(Na2O3/NaHCO3)、甘氨酸缓冲液(甘氨酸/NaOH)、磷酸 钾缓冲液(KH2PO4/KOH)、磷酸钠缓冲液(Na2HPO4/NaH2PO4)、丁二 酸缓冲液(丁二酸/NaOH)、醋酸钠缓冲液(醋酸钠/醋酸)、柠檬酸缓 冲液(柠檬酸/柠檬酸钠)、焦磷酸钠缓冲液(Na4P2O7/HCl)、硼酸缓冲 液(硼酸/NaOH)、或硼酸钠缓冲液(硼酸钠/HCl)。优选磷酸钾缓冲液 (KH2PO4/KOH)和硼酸钠缓冲液(硼酸钠/HCl)，其pH范围为6.0～ 9.0。优选缓冲液的浓度为0.01～100mM。碱性溶液优选NaOH或 KOH溶液，但是不限制于此。混合溶液的pH优选调节到6～10。
在第二子步骤中，为了溶解cNDA，可以向混合液中另外添加 有机溶剂。优选的有机溶剂的实例包括二甲基亚砜(DMSO)、N，N- 二甲基甲酰胺(DMF)、N，N-二甲基乙酰胺(DMA)和四氢呋喃(THF)。 在这些里，考虑到酶的活性，二甲基亚砜是最优选的。有机溶剂优 选以0.01～10％的浓度添加。更优选地，不添加有机溶剂。超过10％ 浓度的有机溶剂的添加导致微生物的细胞膜被溶解破坏，从而阻碍 反应。
在第三子步骤中，反应优选在25～50℃下进行1分钟到2小时， 更优选在35～40℃进行25～40分钟。当反应温度低于25℃或高于 50℃时，会导致不期望的细菌活性的显著降低。
另一方面，在cNDA中的FNA含量、反应液中的cNDA浓度 和完全去除FNA所需要的细菌的量之间有密切的关系。即，随着 cNDA中的FNA含量和反应液中的cNDA浓度的增加，需要更大 量的细菌以去除FNA。
(ii)第二步：结晶
在此步骤中，酸性溶液被添加到在第一步中制备的反应液中以 调节反应液的pH，而后在搅拌下与反应液反应以使粗萘二甲酸结 晶。
更具体地，在一个配有搅拌器的反应器中，适量的酸性溶液被 添加到在第一步中制备的反应液中以调节反应液的pH至期望的范 围，而后保持混合液的温度在恒定水平下，混合液在持续搅拌下反 应，从而将存在于无FNA的反应液中的无定形形式的cNDA在常 温常压条件下结晶出来。
由于此结晶过程能够在常温常压条件下生成具有100μm或更 大的均一尺寸的cNDA晶体，本发明的纯化方法在生产成本和工艺 过程方面在经济上是有优势的。另外，由于在各个cNDA晶体颗粒 之间没有凝聚发生，本发明的纯化方法是适于实际应用的并且在最 终产物的高回收率方面是有优势的。
作为酸性溶液，可以应用例如，硫酸、盐酸、冰醋酸或硝酸。 硫酸或硝酸的应用是优选的，因为其导致cNDA晶体的大尺寸和高 产率。也就是，硫酸或硝酸的添加能够以高产率生成具有100μm 或更大的均一尺寸的cNDA晶体。
反应液的pH优选调节到1～4以增加最终产物的回收率。随着 反应液的pH降低，最终产物的回收率趋于从约92％增加到约 99.9％。
结晶过程在约4℃至约80℃下进行，优选25℃～60℃。结晶进 行约1分钟到约12小时，考虑到连续处理，更优选2～30分钟。 太短的结晶时间会导致cNDA的低结晶度，引起各个cNDA晶体颗 粒之间通过聚合而发生的凝聚。同时，太长的结晶时间导致不必要 的能量损失。
进行cNDA结晶所需要的搅拌通常在0～1000rpm的速率下进 行，优选0～400rpm。
(iii)第三步：洗涤
在此步骤中，洗涤在第二步中得到的结晶的粗萘二甲酸以去除 含在其中的杂质。
尽管通过使用微生物的纯化反应和结晶反应，将FNA转化成 NDA并将其完全去除，但包括2-萘甲酸(NA)、甲基萘甲酸(MNA) 和偏苯三酸(TLMA)在内的其他杂质还未去除。当结晶的cNDA分 散在水中，在给定条件下洗涤若干次，可完全去除残留的杂质。杂 质的完全去除基于在水中cNDA和杂质的溶解度的差别。此时，用 于纯化cNDA的微生物也通过洗涤被去除。
在此步骤中，期望在反应副产物溶解于溶剂中和NDA沉淀尽 可能多的状况下实现分离。分离的温度范围是100～250℃，优选 150～230℃。在高于250℃下溶剂的分离导致纯化的NDA的损失增 加，引起产率相当大的下降。同时，在低于100℃下溶剂的分离不 利地导致杂质(包括NA、MNA和TLMA)的低溶解度。
更特别地，结晶的cNDA分散在水中，在1～28kg/cm2的压力 和100～250℃的温度下搅拌10分钟到1小时，过滤除去水。此工 序可以重复若干次以去除杂质。此时，溶剂优选用量为结晶的cNDA 的重量的5～20倍。
(iv)第四步：干燥
在此步骤中，在特定温度下将NDA晶体(其中通过洗涤将杂质 从结晶的cNDA中去除)干燥以得到纯的结晶形式的NDA。此时， 干燥优选在30～200℃下进行。通过本领域内已知的传统技术进行 干燥而无需限制。
本发明的方法还可以包含在第一步后和第二步前去除在第一 步中使用的微生物的步骤。
在cNDA纯化后和cNDA结晶前先去除微生物能够对改善 NDA晶体的纯度和回收率有贡献。
通过本领域内已知的传统技术完成微生物的去除而无需限制。 例如，微量过滤器系统、连续型离心分离器或滗析器可以用于去除 微生物。微量过滤器系统使用具有0.1～0.5μm孔径的过滤器，由选 自陶瓷、不锈钢、聚丙烯和聚对苯二甲酸乙二酯(PET)的材料制成。
另一方面，本发明提供通过纯化方法生成的纯的结晶形式的 2，6-萘二甲酸。
本发明的纯化方法能够以99.8％或更高的高产率生成高纯度的 2，6-萘二甲酸。依据期望的应用和需要，可以改变处理条件以生成 规则的或无规的结晶形式的2，6-萘二甲酸。规则结晶形式的2，6-萘 二甲酸可以具有晶格结构。
本发明的2，6-萘二甲酸晶体具有不小于100μm的平均粒径和 均一的颗粒外形。因此，本发明的2，6-萘二甲酸晶体与乙二醇聚合 生成PEN时非常适于与乙二醇形成低粘度浆液。平均粒径小于 100μm的2，6-萘二甲酸晶体很难处理，当其与乙二醇混合制备PEN 时，显示出弱的与乙二醇形成浆液的能力，导致增加了能量消耗。 本发明的2，6-萘二甲酸晶体优选的平均粒径为100～150μm。
图5表示依据本发明的一个实施方式用于实施纯化粗萘二甲 酸的方法的纯化体系。参考图5，依据本发明的这个实施方案的纯 化方法将更详细地解释如下。
首先，将特定量的缓冲液引入反应器A，在其中粗萘二甲酸用 微生物纯化。将cNDA加入到反应器中，随后，搅拌下将碱性溶液 加入反应器中以调节反应液的pH。将特定量的水加入反应器以制 备反应液用于随后的纯化。将活性菌加入反应液以使其与反应液反 应，同时保持反应液温度在恒定水平。通过此工序，在反应器A中， 含在cNDA中的FNA转化为NDA，并能够被最终去除。
当反应完成后，反应液通过单元B，在此除去用于去除FNA 的微生物。如果需要，可以省略应用单元B的微生物的去除，因为 微生物的去除能在下游的过滤/清洗单元F完成。
将去除了微生物的反应液转移到结晶反应器C。在搅拌下将酸 性溶液添加到结晶反应器C中，以进行结晶反应。
在结晶反应后得到含有结晶的cNDA的浆液。该浆液用预热器 D加热至约100至约250℃，而后加入到过滤/清洗单元F(在此提供 一个加热器以保持浆液的温度在100～250℃)中。过滤/清洗单元F 的压力保持在1～25kg/cm2。过滤/清洗单元F配有过滤器(孔径： 10～100μm)。
过滤/清洗单元F与高压过滤收集单元G连接。滤液从过滤/清 洗单元F进入高压滤液收集单元G，固体成分用包括在过滤/清洗 单元F中的过滤器过滤。
将在溶剂加热/供应单元E中预热的水(100～250℃)提供至过 滤/清洗单元F。当在过滤/清洗单元F中持续搅拌给定的时间后， 将二级滤液加进高压滤液收集单元G中。如果需要，清洗步骤重复 一次或两次。清洗后保留的纯的NDA与预热的水(100～250℃)混合 以形成浆液。将所述浆液经过浆液流出线路送至高压浆液收集单元 H。当高压浆液收集单元H的压力降至常压后，含有纯的NDA的 浆液被转移至粉末分离单元I，在此将溶剂从浆液中去除，随后在 干燥单元J中干燥从而只收集纯的NDA。
在下文中，参考下述实施例将对本发明的构成和效果进行详细 解释。然而，这些实施例的目的是举例说明，不解释为对本发明的 范围的限制。
实施例
实施例1
第一步：微生物筛选
(1)菌株的分离
土壤采样自位于韩国京畿道的废水处理厂、储油库和加油站。 将每个土壤样品5g添加至50ml的0.85％生理盐水溶液中，振摇并 过滤得到滤液。滤液稀释到适当的水平，涂在含有cNDA的LB固 体培养基上，在30℃的培养箱中培养。培养结果，分离出200种微 生物。
依据如下工序，首先仅筛选出能分解与FNA在相同位置上有 甲酰基的2-萘甲醛的微生物。首先，将200种微生物各自接种到 1ml的LB液体培养基上，在200rpm和30℃下振摇培养16小时。 离心分离培养物收集相应的细菌。将收集到的细菌悬浮在1ml的 0.85％生理盐水中。分别地，将0.2ml的2-萘甲醛溶液(50μg/ml于 DMSO中)加入到含有3ml的β-NAD溶液(0.25mg/ml于100mM KH2PO4-KOH(pH 8.0)溶液中)的样品试管中，并且将0.2ml的DMSO 添加到含有3ml的β-NAD溶液(0.25mg/ml于100mM KH2PO4-KOH(pH 8.0)溶液中)的空白试管中。将试管分别置于分光 光度计中，稳定3分钟。当分别添加0.05ml微生物悬浮液于样品 试管中后5分钟，在340nm处测定混合物的吸收度。比较样品试 管中的混合物的吸收度值与空白试管的吸收度值以确定2-萘甲醛 的甲酰基到羧基的氧化。结果，分离出四种具有最小吸收度差异为 0.1的微生物。
将四种首先筛选出的微生物各自接种在LB液体培养基上，在 200rpm和30℃下振摇培养16小时。离心分离培养物收集相应的细 菌，用0.85％生理盐水洗涤，并与具有表1中所示组成的溶液在30℃ 的反应浴中反应3小时。反应产物用高效液相色谱(HPLC)分析以最 终筛选具有高的去除FNA能力的菌株。HPLC分析在表2所示的条 件下进行。HPLC分析显示被称为HN-72的菌株具有高的分解FNA 能力。
表1：用于最终筛选的反应液
组成 体积(ml) 注释 50mM KH2PO4-KOH(pH 8.0) 37.5 cNDA溶液 4 *cNDA溶液的浓度：50mg/ml DMSO 2.5 *反应液的最终浓度：5％ 微生物悬浮液 5 *微生物悬浮液的浓度：0.5g(w.w)/ml 总计 50
表2：HPLC分析的条件
(2)微生物的鉴别
对在(1)中分离的菌株的16S rDNA进行部分测序用以鉴别菌 株。结果显示于图1(SEQ ID NO：1)
依据此结果，鉴别出菌株为属于假单胞菌属的细菌。菌株被称 为假单胞菌(Pseudomonas sp.)HN-72并于2005年6月21日保藏在 作为国际保藏机构的Korea Research Institute of Bioscience and Biotechnology(KRIBB)的基因库中，保藏编号为KCTC-10819BP。 确定出菌株(假单胞菌HN-72)的形态学和生物化学特征，其结果概 述于表3和表4。
表3：假单胞菌(Pseudomonas sp.)HN-72的特征
试验 特征 革兰氏染色 阴性 细胞形态学 杆状 最佳生长温度 25～30℃ 氧化酶 阳性 脱硝作用 阴性 明胶降解 阴性 淀粉降解 阴性 儿茶酚降解 阴性
表4：假单胞菌(Pseudomonas sp.)HN-72对碳源的应用
碳水化合物 利用能力 碳水化合物 利用能力 葡萄糖 + 乳糖酶 + 果糖 + 柠檬酸酯 + 半乳糖 - 甘油 + 阿拉伯糖 - 邻苯二甲酸酯 - 鼠李糖 + 异丙醇 - 海藻糖 - 丁醇 + 麦芽糖 - 山梨醇 - 乳糖 - 甘露醇 - 蔗糖 - 核糖 + 淀粉 - 琥珀酸酯 +
第二步：用微生物纯化cNDA
将在第一步中筛选的假单胞菌(Pseudomonas sp.)菌株HN-72接 种在300ml的LB液体培养基上，并在30℃下在培养箱中以200rpm 振摇培养16小时。离心分离培养物以收集细菌。收集到的细菌用 0.85％的生理盐水溶液洗涤，并悬浮在5ml的0.85％生理盐水溶液 中以活化细菌。
将50L的50mM磷酸钾缓冲液添加入反应器A中，在此cNDA 用微生物纯化。将1～10kg的cNDA添加至反应器A中，而后在搅 拌下向其中添加KOH或NaOH以调节反应液的pH至8.0。将水添 加至混合溶液中以制备用于随后纯化的反应液(cNDA浓度：1～ 10％，cNDA中的FNA含量：0.01～4％)。
将0.2～10kg/L的活性细菌添加至反应液中以使其与反应液在 40℃下反应10分钟到2小时，其间保持反应液温度在40℃。反应 结果，在反应器A中，含在cNDA中的FNA被转化为NDA。
第三步：纯化的cNDA的结晶
将100L在第二步中制备的纯化的cNDA溶液转移到配有搅拌 器的结晶反应器C中。在将硫酸溶液添加入结晶反应器中以调节纯 化的cNDA的溶液的pH至3.0后，结晶反应在50rpm的速率下搅 拌进行30分钟，同时保持反应温度为40℃。
当结晶完成后，结晶的cNDA的分析用显微镜和粒度分析仪进 行。分析结果显示cNDA令人满意地发生了结晶而没有任何个别的 晶体颗粒间的凝聚。测得结晶的cNDA具有的平均粒度为约 160.7μm。图2显示结晶的cNDA的显微照片。
第四步：结晶的cNDA的洗涤和干燥
在第三步中制备的结晶的cNDA的浆液用预热器D加热至超过 220℃，加入到过滤/清洗单元F中，在24.7kg/cm2的压力和225℃ 的温度下搅拌30分钟，而后过滤。滤液(即水)排入高压滤液收集单 元G。将来自溶剂加热/供给单元E的225℃的100L的水添加至过 滤/清洗单元F中，在与上述相同条件下搅拌30分钟，而后过滤。 滤液(即水)排入高压滤液收集单元G。此工序总共重复两次。将 100L来自溶剂加热/供给单元E的225℃的水添加至过滤/清洗单元 F中，搅拌30分钟以使纯的NDA均匀地分散。含有纯的NDA的 浆液被转移到高压浆液收集单元H中。当高压浆液收集单元H的 压力降到常压后，所述浆液被转移到粉末分离单元I(即滗析器)中， 在此从浆液中去除水，随后在干燥单元J中在120℃干燥以收集纯 的结晶形式的NDA。
实施例2
用与实施例1相同的方式收集纯的结晶形式的NDA，不同之 处在于微生物在第二步后和第三步前先从在第二步中制备的纯化 的cNDA溶液中用聚丙烯过滤器(孔径：0.2μm)去除。
实施例3和4
用与实施例1相同的方式收集纯的NDA结晶，不同之处在于 分别用芽孢杆菌(Bacillus sp.)F-1(KCTC-10342BP)和芽孢杆菌 (Bacillus sp.)F-3(KCTC-10335BP)代替假单胞菌(Pseudomonas sp.)HN-72(KCTC-10819BP)。
实施例5和6
用与实施例2相同的方式收集纯的NDA结晶，不同之处在于 分别用芽孢杆菌(Bacillus sp.)F-1(KCTC-10342BP)和芽孢杆菌 (Bacillus sp.)F-3(KCTC-10335BP)代替假单胞菌(Pseudomonas sp.)HN-72(KCTC-10819BP)。
分析未纯化的cNDA、第二步(纯化步骤)后得到的纯化的cNDA 的溶液和在实施例1中第四步(洗涤/干燥步骤)后得到的纯的结晶 形式的NDA中的各组分的含量。分析结果见表5。
表5
组分分析
cNDA 纯化后 洗涤和干燥后 NA 0.046％ 0.040％ - MNA 0.085％ 0.082％ 0.002％ FNA 0.210％ - - TMLA 0.038％ 0.037％ 0.002％ 其他 0.130％ 0.102％ 0.006％ NDA 99.491％ 99.739％ 99.990％
从表5的结果看，能够确定用微生物的纯化方法能够基本上完 全去除含在cNDA中的杂质。特别地，以100％的产率把FNA转化 为NDA。因此，生成了高纯度的2，6-萘二甲酸，其纯度为99.9％或 更高。
为了确定用微生物纯化cNDA的最佳反应条件，特别是纯化的 cNDA的溶液的结晶条件，在表6～8所示的不同反应条件下进行 了一系列实验，比较和分析在依据不同反应条件的各自的结晶反应 后得到的cNDA晶体的平均粒径和回收率。
实验实施例1：不同种类的酸和搅拌速率下的结晶反应
将100ml在实施例1的第二步中制备的纯化的cNDA的溶液添 加到反应器中，每个反应器都配有搅拌器，而后将硫酸、盐酸、冰 醋酸和硝酸溶液添加至反应器中以调节纯化的cNDA的溶液的pH 至3.0。以0、50、100、200、400、800和1000rpm的不同速率搅 拌混合溶液。此时，混合溶液的温度保持在25℃。在这些反应条件 下，结晶反应进行30分钟以得到cNDA晶体。
当结晶完成后，用显微镜和粒度分析仪进行cNDA晶体的分 析。分析结果显示cNDA令人满意地产生结晶而未有任何个别晶体 颗粒间的凝聚。图3a、3b和3c显示通过添加硫酸溶液至纯化的 cNDA的反应液并且分别以50rpm、200rpm和800rpm的不同速率 搅拌下得到的cNDA晶体的显微照片。在各自条件下测定得到的 cNDA晶体的平均粒径，结果见表6。由表6所示的数据可见，当 添加硫酸或盐酸溶液并在0～400rpm的速率下搅拌后得到的cNDA 晶体显示更好的结果。
表6
实验实施例2：不同种类的酸和温度下的结晶反应
重复实验实施例1的工序，不同之处在于混合溶液以50rpm的 速率在4、15、25、40、60和80℃的不同反应温度下搅拌。
当结晶完成后，用显微镜和粒度分析仪进行cNDA晶体的分 析。分析结果显示cNDA令人满意地结晶而未有任何个别晶体颗粒 间的凝聚。图4a、4b和4c显示通过添加硫酸溶液至纯化的cNDA 的反应液并分别在15℃、40℃和80℃的不同反应温度搅拌下得到 的cNDA晶体的显微照片。测定在各自条件下得到的cNDA晶体的 平均粒径，结果见表7。由表7所示的数据可见，当添加硫酸或盐 酸溶液并在40℃的反应温度下搅拌后得到的cNDA晶体显示更好 的结果。
表7
实验实施例3：不同pH值下的回收率
重复实验实施例1的工序，不同之处在于混合溶液在50rmp、 40℃的反应温度和1、2、3、4、5和6的不同pH值下搅拌。当结 晶反应进行30分钟后，等量的反应液分别从各个反应器中取出。 测定cNDA晶体的回收率，结果见表8。表8显示cNDA晶体的回 收率在pH不高于3时高于99％。cNDA晶体的回收率显示了随着 pH降低而升高的趋势。
表8
工业应用
由于在各个适合的条件下用能将FNA转化为NDA的微生物纯 化粗萘二甲酸，因此能在工业规模上以有利于环境的方式有利地生 成高纯度的结晶2，6-萘二甲酸。
序列表
<110>株式会社晓星(HYOSUNG CORPORATIQN)
<120>用微生物纯化粗萘二甲酸的方法和用该方法得到的结晶形式的2，6- 萘二甲酸
<160>1
<170>KopatentIn 1.71
<210>1
<211>700
<212>DNA
<213>假单胞菌(Pseudomonas sp.)HN-72
<400>1
ttgcgagcgt gctacagcag tcagcggatg acgcgagctc gctccctgat tcagcggagg 60
acgggtgagt aatgcctagg attctggctg gtagtggggg acaacgtctc gataggaacg 120
ctaataccgc atacgtccta cgtgagatag cattagacct tcggaccttg cgctatcaga 180
tgagccttgg tcggattagc tagatggtgc agtaatggct caggatggcg acgatccgta 240
actggtctga gaggatgatc actcacactg gaactgagac acggtccagg ctcctacgag 300
agcgggcagt ggtgaatatt ggacaatggg cgacagcctg atccaggcat gcagcgtgtg 360
tgaagaaggt cttcggattg taaagcactt taagttgtga ggaaggcgag taagttaata 420
ccttgctgtc atgacgttac cgaaagaata agcaccggct aactctgagc cagcagctgc 480
ggtaatacag atggtgcaag cgttaatcgg aattactggg cgtatagcgc gcgtaggtgg 540
tttgttaagt tggatgtgaa agccccgggc tcaacctggg aactgaatcc accactggca 600
agctagagta cggtagaggg tgctggaata tcctgtgtag cggtgaaatg cgtagatata 660
ggaaggaaca ccagtggcta cagcgaccac ctggactgat 700