技术领域
本发明涉及重组蛋白及其治疗应用，尤其涉及人胰高血糖素样肽-1(hGLP-1)及其类似物与人胰高血糖素样肽-2(hGLP-2)在基因水平融合后表达的前体药物形式的重组蛋白，以及该类融合蛋白在用于预防或治疗与GLP-1活性相关的疾病或障碍，尤其是2型糖尿病及其并发症中的应用。
背景技术
糖尿病是世界性的常见病和多发病，严重危害人类健康。2007年，国际糖尿病联盟(IDF)公布的最新数据显示，目前全球2.46亿人正在遭受着糖尿病的侵袭，在未来20年内糖尿病患者的总人数将会突破3.8亿。现有患者中，85％以上为2型糖尿病，即非胰岛素依赖型糖尿病(NIDDM)，其微血管和大血管并发症，具有很高的死亡率和病死率。我国目前已有糖尿病患者4000多万，居世界第二，其中95％为2型，而且糖尿病患者需终生用药。因此，开发高效、长效、低价的治疗2型糖尿病新药具有重大意义。2型糖尿病早期可以通过调整饮食、加强锻炼和控制体重等措施维持血糖稳定。当这些措施无效时，多选用传统的磺酰脲类、双胍类等口服降血糖药治疗，但这些药物最突出的不良反应就是低血糖，并可能诱发体重增加，使其临床应用受限。此外，由于2型糖尿病的传统治疗侧重于缓解高血糖等症状，而不是针对其正发病原因，致使多数患者都无法逆转血糖控制能力的持续下降、β细胞数量的减少和功能的降低。临床上对于2型糖尿病的治疗重复着从减少进食，加强锻炼，到使用单一药物治疗，至复合药物治疗并最终发展到必须使用胰岛素治疗这一病程逐渐加重的过程，这些治疗措施既不能有效地缓解2型糖尿病的进程，又不能有效防止其并发症。可见，当前治疗药物在发挥其治疗作用的同时尚存在诸多弊端，加之糖尿病发病率在世界范围内节节攀升，现有治疗药物将无法满足未来市场需求，因此，针对疾病形成机制，寻找并研发出更安全有效的新型药物以防止和逆转2型糖尿病的病情发展，就显得迫在眉捷。理想的治疗糖尿病药物在降低血糖的同时，应尽量保护胰岛细胞功能，降低高血糖对β细胞的毒性作用，改善内源性胰岛素的分泌，提高周围组织对胰岛素的敏感性，促进糖和脂肪代谢及增加葡萄糖依赖性胰岛素分泌，长期应用时不会出现低血糖等副作用。
人胰高血糖素样肽-1(human glucagon-like peptide-1，hGLP-1)是摄食后由肠道L细胞分泌的由30个氨基酸残基组成的激素样多肽，是前胰高血糖素原基因翻译后加工的产物，分子量约3kDa，与胰高血糖素(glucagon)具有50％的同源性，也参与调节体内血糖稳定，但却发挥着截然不同的效应。与当前治疗糖尿病的一线药物相比，GLP-1具有7方面优点：①其促进胰岛素分泌作用依赖于血糖水平，从而避免了胰岛素过度分泌导致的低血糖发生，可以长期安全使用(Mojsov S，Weir GC，Habener JF.J ClinInvest 1987；79：616-19；Kreymann B，Ghatei MA，Williams G，et al.Lancet1987；2：1300-04；Orskov C，Holst JJ，Nielsen OV.Endocrinology 1988；123：2009-13.)；②能改善周边组织的胰岛素受体敏感性，有助于治疗胰岛素抗性；③可以抑制胰高血糖素的分泌(Nauck MA，Holst JJ，Willms B.HormMetab Res 1997；29(9)：411-6.)；④对于肥胖引起的2型糖尿病，可以通过抑制胃排空的作用，帮助患者控制饮食或减轻体重(Turton MD，O’Shea D，Gunn I，et al.Nature 1996；379：60-72.)；⑤对磺酰脲类药物无效的患者仍然有效；⑥能改善患者的糖化血红蛋白、果糖胺等中长期生化指标(MeeranK，O′Shea D，Edwards CM，et al.Endocrinology 1999；140(1)：244-50；LarsenPJ，Fledelius C，Knudsen LB，et al.Diabetes 2001；50：2530-39.)；⑦能够促进胰岛β细胞的增生(Byrne MM，Pluntke K，Wank U，et al.Eur J Clin Invest1998；28：72-78.)。此外，将GLP-1应用于1型糖尿病(胰岛素依赖型糖尿病，IDDM)患者，其治疗潜能也很突出。研究表明，与NIDDM患者类似，GLP-1通过它的稳定胰高血糖素(glucagonostatic)特性，能有效地缓解饥饿性高血糖症；还可以通过延长胃排空时间，减少IDDM患者的餐后血糖偏移。可见，GLP-1对IDDM和NIDDM均有治疗作用。正是由于GLP-1这些特殊的生物学作用，使之成为一种最有开发潜力的新型抗糖尿病药物，有望成为糖尿病治疗领域的新药增长点。然而，天然GLP-1属肽类激素，在体内极易被二肽基肽酶IV(DPP IV)降解，而且很容易从肾脏排出，故其生物半衰期仅2～6分钟，皮下注射人GLP-1产生的血药浓度高峰只能维持很短的时间，在很大程度上限制了其临床应用。因此，设法延长GLP-1的作用时间是目前的攻关重点，迫切需要研制出生物半衰期更长、稳定性更好、活性更高的hGLP-1产品应用于临床。
目前以GLP-1为靶点的研究，主要致力于以下三方面：(1)DPP IV抑制剂：与GLP-1联合用药，通过抑制DPP IV的活性而延长GLP-1的半衰期；(2)GLP-1受体激动剂：如Amylin公司的Exenatide/Exendin-4，是目前开发进展最迅速的GLP-1类似物，2005年已获得美国FDA批准上市，每天注射2次即可改善血糖水平，同时可减轻体重；(3)GLP-1分子 改造：如HGS公司的Albugon，是GLP-1(DDP-IV抗性突变)和白蛋白的融合体，在猴子体内的半衰期为3天；加拿大ConjuChem公司的DAC：GLP1(CJC-1131)，是将GLP-1与一个化学活性基团连接，这样药物进入体内就会与白蛋白共价结合形成复合体，在人体内的半衰期长达10～12天；还有丹麦Novo Nordisk公司的NN2211(Liraglutide)，C端为具有脂肪酸的GLP-1衍生物，半衰期超过10小时。目前这三种药物均处于II期临床试验阶段。但这些药物均采用化学合成，而化学合成多肽往往技术难度大、生产成本高、纯化困难且会造成环境污染，其免疫原性、稳定性和安全性等尚处于进一步考察中。
人胰高血糖素样肽-2(human glucagon-like peptide-2，hGLP-2)又称人肠生长激素，是肠道L细胞分泌的由33个氨基酸残基组成的多肽，具有刺激肠生长的作用。研究还发现GLP-2具有与GLP-1相类似的抑制摄食的效应，可以抑制食欲，引起厌食；还可以延缓胃排空，抑制胃酸分泌(Nagell CF，Wettergren A，Pedersen JF，et al.Scand J Gastroenterol 2004；39：353-8.)。此外，GLP-2和GLP-1都是前胰高血糖素原基因(proglucagon，PG)翻译后加工的产物，且共同从肠道L细胞释放。
基于上述理论和实践，我们将hGLP-1与hGLP-2，或GLP-1类似物与GLP-2类似物构建为融合蛋白，那么该融合蛋白将更好地模拟正常生理状态下激素的分泌过程，使二者共同释放，且有望发挥出更为理想的双重生物学效应。还可将前药设计思路引入该融合蛋白的设计理念，将多个hGLP-1与hGLP-2融合为大分子的前体药物(prodrug)，该前体药物在体外无生理活性，但进入体内后，在体内特异性酶作用下逐步分解，不断释放出具有生理活性的GLP-1，一次给药后可在体内较长时间保持有效的GLP-1浓度。同时，大分子的前体药物也不易被肾脏排出，很大程度上延长了药物的作用时间。
发明内容
本发明的目的是提供人胰高血糖素样肽-1类似物的融合蛋白及其应用，它能够预防和治疗1型和2型糖尿病的融合蛋白以及编码该融合蛋白的核苷酸序列，该类融合蛋白是前体药物，作用时间较长，具有DPP-IV抗性，能葡萄糖依赖性促胰岛素分泌，提高机体对葡萄糖的耐受性，又能促进胰岛β细胞增殖、再生和减少凋亡，保护胰岛功能。
本发明的目的是这样实现的，人胰高血糖素样肽-1类似物的融合蛋白及其应用，该融合蛋白是由n个多肽A和n个多肽B组成，其中，
多肽A为GLP-1(7-37)[SEQ ID NO.1]，其序列为：
His-Xaa2-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gl y-Gln-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-lys-Gly-Arg-Xaa31
式中Xaa2为：Ala，Ser，Gly，Val，Thr；Xaa31为：Gly，Ala，Arg，Lys或被去除；
所述的多肽B为GLP-2(1-33)[SEQ ID NO.2]，其序列为：
His-Ala-Asp-Gly-Ser-Phe-Ser-Asp-Glu-Met-Asn-Thr-Ile-Leu-Asp-Asn-Leu-Ala-Xaa19-Arg-Asp-Phe-Ile-Asn-Trp-Leu-Ile-Gln-Thr-Lys-Ile-Thr-Asp
式中Xaa19为：Ala，Ser，Thr，Pro，Gly。
所述的多肽A和多肽B中间还有接头，选自：Lys-Arg、Arg-Lys、Arg-Arg或Lys-Lys，该结构为体内特异性蛋白酶识别位点。
所述的多肽A和多肽B及中间接头构成由多肽A-接头-多肽B组成[SEQ ID NO.3]，序列为：
Met-Lys-Arg-His-Xaa5-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-lys-Gly-Arg-Xaa34-Arg-Arg-His-Ala-Asp-Gly-Ser-Phe-Ser-Asp-Glu-Met-Asn-Thr-Ile-Leu-Asp-Asn-Leu-Ala-Xaa55-Arg-Asp-Phe-Ile-Asn-Trp-Leu-Ile-Gln-Thr-Lys-Ile-Thr-Asp
式中Xaa5为：Ala，Ser，Gly，Val，Thr；Xaa34为：Gly，Ala，Arg，Lys或被去除；Xaa55为：Ala，Ser，Thr，Pro，Gly。
所述的多肽A和多肽B及中间接头构成由多肽A-接头-多肽B-接头-多肽A组成[SEQ ID NO.4]，序列为：
Met-Lys-Arg-His-Xaa5-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-lys-Gly-Arg-Xaa34-Arg-Arg-His-Ala-Asp-Gly-Ser-Phe-Ser-Asp-Glu-Met-Asn-Thr-Ile-Leu-Asp-Asn-Leu-Ala-Xaa55-Arg-Asp-Phe-Ile-Asn-Trp-Leu-Ile-Gln-Thr-Lys-Ile-Thr-Asp-Lys-Lys-His-Xaa73-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-lys-Gly-Arg-Xaa102
式中Xaa5，Xaa73为：Ala，Ser，Gly，Val，Thr；Xaa34，Xaa102为：Gly，Ala，Arg，Lys或被去除；Xaa55为：′Ala，Ser，Thr，Pro，Gly。
所述的多肽A和多肽B及中间接头构成由多肽A-接头-多肽B-接头-多肽A-接头-多肽B组成[SEQ ID NO.5]，序列为：
Met-Lys-Arg-His-Xaa5-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Ty r-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-lys-Gly-Arg-Xaa34-Arg-Arg-His-Ala-Asp-Gly-Ser-Phe-Ser-Asp-Glu-Met-Asn-Thr-Ile-Leu-Asp-Asn-Leu-Ala-Xaa55-Arg-Asp-Phe-Ile-Asn-Trp-Leu-Ile-Gln-Thr-Lys-Ile-Thr-Asp-Lys-Lys-His-Xaa73-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-lys-Gly-Arg-Xaa102-Arg-Arg-His-Ala-Asp-Gly-Ser-Phe-Ser-Asp-Glu-Met-Asn-Thr-Ile-Leu-Asp-Asn-Leu-Ala-Xaa123-Arg-Asp-Phe-Ile-Asn-Trp-Leu-Ile-Gln-Thr-Lys-Ile-Thr-Asp
式中Xaa5，Xaa73为：Ala，Ser，Gly，Val，Thr；Xaa34，Xaa102为：Gly，Ala，Arg，Lys或被去除；Xaa55，Xaa123为：Ala，Ser，Thr，Pro，Gly。
所述的多肽A和多肽B及中间接头构成由多肽A-接头-多肽B-接头-多肽A-接头-多肽B-接头-多肽A组成[SEQ ID NO.6]，序列为：
Met-Lys-Arg-His-Xaa5-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-lys-Gly-Arg-Xaa34-Arg-Arg-His-Ala-Asp-Gly-Ser-Phe-Ser-Asp-Glu-Met-Asn-Thr-Ile-Leu-Asp-Asn-Leu-Ala-Xaa55-Arg-Asp-Phe-Ile-Asn-Trp-Leu-Ile-Gln-Thr-Lys-Ile-Thr-Asp-Lys-Lys-His-Xaa73-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-lys-Gly-Arg-Xaa102-Arg-Arg-His-Ala-Asp-Gly-Ser-Phe-Ser-Asp-Glu-Met-Asn-Thr-Ile-Leu-Asp-Asn-Leu-Ala-Xaa123-Arg-Asp-Phe-Ile-Asn-Trp-Leu-Ile-Gln-Thr-Lys-Ile-Thr-Asp-Lys-Lys-His-Xaa141-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-lys-Gly-Arg-Xaa170
式中Xaa5，Xaa73，Xaa141为：Ala，Ser，Gly，Val，Thr；Xaa34，Xaa102，Xaa170为：Gly，Ala，Arg，Lys或被去除；Xaa55，Xaa123为：Ala，Ser，Thr，Pro，Gly。
所述的融合蛋白的原核表达载体是pET32a。
所述的融合蛋白是由大肠杆菌表达系统重组表达产生的。
所述的融合蛋白中的多肽A和多肽B在生理状态下都释放于肠道L细胞，都是前胰高血糖素原基因翻译后加工而成，因此将多肽A和多肽B融合可以模拟生理状态下的激素分泌，以利于其更好地发挥出理想的生物学效应。
所述的融合蛋白用于制备治疗1型糖尿病、2型糖尿病、肥胖、胰高 血糖素瘤、代谢性疾病的用途。
本发明的特点是：所述融合蛋白是前体药物，在体内经酶降解后释放出活性GLP-1分子，进而发挥药理作用，且生物稳定性高，体内半衰期长。本发明的范围延及使用该生产工艺所得产品的治疗应用。该融合蛋白可用于治疗或预防与GLP-1活性相关的疾病或障碍，尤其是2型糖尿病。其优点是：1.应用基因工程方法制备人胰高血糖素样肽类似物的融合蛋白，即前胰高血糖素样肽(Pro-GLPs)，生产成本远低于化学合成法，操作简便，原料易得。2.本发明所构建的融合蛋白为人源性序列融合而成，无免疫原性。3.本发明所述的融合蛋白Pro-GLPs在体外没有活性，但进入体内后，在体内特异性酶的作用下逐步分解，不断释放出具有生理活性的GLP-1，一次给药后可在体内较长时间保持有效的GLP-1浓度，并有效控制糖尿病症状。4.由于与之相融合的是GLP-2，因此该种释药方式成功模拟了生理状态下的GLP-1释放，以利于其更好地发挥积极的生物学效应。5.融合后产生的大分子的前体药物也不易被肾脏排出，很大程度上延长了药物的作用时间。由此可见，本发明所述的融合蛋白Pro-GLPs既保留了GLP-1的降血糖活性，又解决了GLP-1及其类似物等短肽在体内半衰期短的问题，并首次将前药设计思路引入GLP-1类似物的研发，且成功模拟出生理状态下的GLP-1释放过程。
药效学研究结果表明，本发明所述的融合蛋白具有理想的降血糖作用，有利于缓解由于糖质代谢紊乱而带来的诸多糖尿病并发症症状，因此，本发明所述的融合蛋白可用于制备治疗糖尿病及防治糖尿病并发症的药物，显示出广阔的临床应用前景。
附图说明
下面结合实施例附图对本发明做进一步说明。
图1为pET32a载体的示意图；
图2为融合蛋白Pro237重组载体的示意图；
图3为重组质粒pET32a-Pro237酶切鉴定的琼脂糖凝胶电泳后的成像图；
图4为融合蛋白Pro237经IPTG诱导后表达的SDS-PAGE电泳结果的成像图；
图5为融合蛋白Pro237的Western-blot结果的成像图；
图6为融合蛋白Pro237经Ni-NTA Sepharose层析分离纯化后的SDS-PAGE电泳结果的成像图；
图7、图8、图9为皮下注射融合蛋白Pro237对C57BL/6小鼠的口服葡萄糖耐量试验结果统计图；
图7为两次给予糖负荷后的降血糖作用结果统计图；
图8为糖负荷后20min时不同剂量Pro237的降血糖作用结果统计图；
图9为糖负荷后20min时不同剂量Pro237的血浆胰岛素水平统计图；
图10、图11为每日皮下注射融合蛋白Pro237对健康C57BL/6小鼠及自发性糖尿病db/db小鼠摄食及体重影响的结果统计图；
图10为Pro237对摄食影响的结果统计图；
图11为Pro237对体重影响的结果统计图。
具体实施方式
下列实施例用以帮助描述如何实施本发明的各种实施方案。这些实施例是为了举例说明，而不是以任何方式限定本发明的范围。
本发明所述融合蛋白可以为n个多肽A和n个多肽B在基因水平融合后表达的重组蛋白；
其中所述的多肽A为hGLP-1(7-37)或其类似物，其氨基酸序列[SEQID NO.1]为：His-Xaa2-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-lys-Gly-Arg-Xaa31，式中Xaa2为：Ala，Ser，Gly，Val，Thr；Xaa31为：Gly，Ala，Arg，Lys或被去除；所述的多肽B为hGLP-2或其类似物，其氨基酸序列[SEQ ID NO.2]为：His-Ala-Asp-Gly-Ser-Phe-Ser-Asp-Glu-Met-Asn-Thr-Ile-Leu-Asp-Asn-Leu-Ala-Xaa19-Arg-Asp-Phe-Ile-Asn-Trp-Leu-Ile-Gin-Thr-Lys-Ile-Thr-Asp，式中Xaa19为：Ala，Ser，Thr，Pro，Gly；多肽A的C末端可以通过肽接头(Linker)与多肽B的N末端融合，多肽B的C末端也可以通过肽接头与多肽A的N末端融合。
本发明还提供了制备具有生物活性的上述融合蛋白的方法。
本发明还提供了将多肽A与多肽B融合在一起的接头，该接头由多个氨基酸组成，可选自Lys-Arg、Arg-Lys、Arg-Arg或Lys-Lys。该结构为体内内源性蛋白水解酶的特异性结合位点，能够使进入体内的融合蛋白被特异性酶解，释放出活性片段以发挥药理作用。
本发明还提供了上述融合蛋白及其DNA序列和类似物用于制备预防和治疗糖尿病及其相关疾病的药物的应用。
以下实施例中是选取实验结果最好的Pro-GLPs，即Pro237为例，其他的融合蛋白同样按照以下方法进行实验。
本实施例的融合蛋白可以通过基因重组技术获得。重组方法生产本发明融合蛋白的具体技术解决方案如下：
第1步，通过化学合成获取本发明融合蛋白的目的基因。
第2步，构建重组表达载体pET32a，pET32a空载体购自德国Novagen 公司(属商业化表达载体，任何人皆可在市场购买到)。
第3步，将目的基因重组到表达载体pET32a质粒中，然后转化大肠杆菌B121(DE3)。
第4步，在大肠杆菌中表达本发明所述融合蛋白。将含有pET32a质粒的感受态大肠杆菌B121(DE3)细胞的单克隆，接种于5ml LB培养基(含100μg/ml氨苄青霉素Amp)，37℃振荡培养10h。按1∶100比例转种新培养基，继续37℃振荡培养2h，然后加入异丙基-β-D硫代半乳糖苷(IPTG)诱导目的蛋白表达，37℃诱导4h后，离心收集菌体。
第5步，分离并纯化重组产生的蛋白。利用固化Ni琼脂层析柱纯化带His-tag的表达的融合蛋白。
第6步，融合蛋白的活性检测：口服葡萄糖耐量试验(OGTT)。健康C57BL/6J小鼠(18～22g)，雌雄各半，禁食16-18小时，皮下注射不同剂量的融合蛋白(0.3nmol/kg，3nmol/kg，30nmol/kg)、hGLP-1(30nmol/kg)或生理盐水，注射15min后灌胃给予糖负荷(1.5g/kg体重)，并分别于注射后0，10，20，30，60，90，120，150min后从尾静脉取血，用血糖仪测定血糖水平。为长时间观察该融合蛋白的降糖作用，于150min时尾静脉取血后立即再次给予D-葡萄糖(1.5mg/kg)，按相同时间间隔测定血糖。结果显示，本发明所述融合蛋白呈剂量依赖性降低血糖浓度，上述剂量的该融合蛋白对小鼠正常血糖浓度无影响。等剂量融合蛋白的降糖作用较GLP-1作用强。实验表明，糖负荷动物在灌胃给糖后120分钟血糖恢复至正常水平。第二次糖负荷(1.5g/kg)，该融合蛋白仍发挥其降糖作用。上述结果表明，本发明所述融合蛋白能够明显提高小鼠对糖的耐受性，不降低正常血糖，剂量依赖性降低过高血糖，不仅具有GLP-1正常的生物学活性，而且其作用时间较单独的hGLP-1明显延长。
实施例1 合成Pro237基因序列
按照序列：Pro237基因-终止密码子TAG，化学合成长度为513bp的碱基序列，如下：
BamHI
5’-ggacttATGAAACGTCATAGTGAAGGGGCCTTTACCAGTGAT
Met Lys Arg His Ser Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp
GTGAGTTCTTACTTGGAGGGCCAGGCAGCAAAGGAATTCATT
Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile
GCTTGGCTGCTGAAAGGCCGAGGAAGGCGACATGCTGATGGA
Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg Gly Arg Arg His Ala Asp Gly
TGCTTCTCTGATGATATGAACACGATTCTCGATAACCTTGCCGCC
Ser Phe Ser Asp Glu Met Asn Thr Ile Leu Asp Asn Leu Ala Ala
AGAGACTTCATCAACTGGCTGATTCAAACCAAGATCACTGAC
Arg Asp Phe Ile Asn Trp Leu Ile Gln Thr Lys Ile Thr Asp
AAGAAACATAGTGAAGGGGCCTTTACCAGTGATGTGAGTTCT
Lys Lys His Ser Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser
TACTTGGAGGGCCAGGCAGCAAAGGAATTCATTGCTTGGCTG
Tyr Leu Glu Gly Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu
CTGAAAGGCCGAGGAAGGCGACATGCTGATGGATGCTTCTCT
Val Lys Gly Arg Gly Arg Arg His Ala Asp Gly Ser Phe Ser
GATGATATGAACACGATTCTCGATAACCTTGCCGCCAGAGAC
Asp Glu Met Asn Thr Ile Leu Asp Asn Leu Ala Ala Arg Asp
TTCATCAACTGGCTGATTCAAACCAAGATCACTGACAAGAAA
Phe Ile Asn Trp Leu Ile Gln Thr Lys Ile Thr Asp Lys Lys
CATAGTGAAGGGGCCTTTACCAGTGATGTGAGTTCTTACTTG
His Ser Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu
GAGGGCCAGGCAGCAAAGGAATTCATTGCTTGGCTGCTGAAA
Glu Gly Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys
HindIII
GGCCGAGGATAGaagctt-3’
Gly Arg Gly End
将该碱基序列克隆至pET32a中，得到含Pro237-终止密码子TAG的DNA序列的重组质粒pET32a-Pro237，所述的碱基序列含有限制性内切酶BamHI和HindIII的酶切位点。(见图1、图2)
图1为pET32a载体图。
图2为融合蛋白Pro237重组载体图。
图1、图2显示了重组质粒pET32a-Pro237的构建模式。
实施例2 用含有Pro237基因序列的表达载体转化大肠杆菌，获得基因工程菌株
将构建好的重组质粒pET32a-Pro237转化至感受态大肠杆菌BL21(DE3)中，冰浴30min，升温至42℃水浴中维持90s，然后快速转移至冰浴中，冷却2～3min，向转化混合物中加入500μlLB培养液，混匀后37℃振荡培养(＜180rpm，30min)，取200μl转移至含Amp的LB琼脂培养板，37℃过夜培养，筛选出Amp抗性的单克隆菌落。通过BamHI和HindIII双酶切，琼脂糖凝胶电泳鉴定阳性克隆，并对重组质粒BamHI和HindIII双酶切位点间区域进行DNA测序，以确证得到含Pro237基因序列的基因工程菌。(见图3)
图3为重组质粒pET32a-Pro237酶切鉴定的琼脂糖凝胶电泳结果图。图中，1是pET32a空载体对照，2是重组质粒pET32a-Pro237，3是pET32a-Pro237经BamHI和HindIII双酶切后的结果图，4是DNA marker。
图3的结果表明从筛选出的Amp抗性的单克隆菌落中提取的质粒确实是重组质粒pET32a-Pro237，通过BamHI和HindIII双酶切后得到大小为513bp的Pro237。
实施例3 诱导基因工程菌表达融合蛋白Pro237
抽提重组质粒pET32a-Pro237，进一步转化大肠杆菌BL21(DE3)，构建得到基因工程表达菌。挑取单菌落接种于5ml含100μg/ml Amp的LB培养基中，37℃，180rpm振荡培养过夜。取50μl的过夜培养物转种于5ml LB培养基中，37℃，210rpm培养至对数生长期，测其OD600＝0.5～0.6时，加入终浓度为0.1～1mM的IPTG进行诱导表达2～4小时，产生和积累可溶性表达的Pro237融合蛋白，离心，弃上清，收集湿菌体。(见图4、图5)
图4为融合蛋白Pro237经IPTG诱导后表达蛋白的SDS-PAGE电泳结果图。图中，1是低分子量蛋白marker；2是未经IPTG诱导的蛋白表达；3是经0.5mM IPTG诱导后的蛋白表达水平；4是经0.1mM IPTG诱导后的蛋白表达水平。
图5为融合蛋白Pro237经anti-His·tag检测后的Western-blot结果图。图中，1是未经IPTG诱导的；2～7是经0.5mM IPTG诱导后的蛋白不同样品量电泳后的Western-blot结果。
图4的结果显示了0.1mM IPTG即可以诱导融合蛋白Pro237表达。表达出的融合蛋白经Western-blot检测后，结果如图5所示，表明经IPTG诱导后表达的融合蛋白确实是带有His·tag的Pro237。由此可见，该方法正确表达出了融合蛋白Pro237。
实施例4 分离纯化获得Pro237融合蛋白
离心收集菌体，用0.02M磷酸盐缓冲液重悬菌体，加入100mmol/L PMSF至终浓度1mmol/L，冰浴中超声破菌，缓冲液中加入1％TritonX-100保持30min，12000rpm/min离心10min，取上清进行NTA-Ni树脂亲和层析，收集Pro237融合蛋白组分，用截留分子量为1～5kD的MilliporeAmicon Ultra-15超滤管将蛋白浓缩至2～5mg/ml以上。收集穿透峰，冷冻干燥，得到产品Pro237。(见图6)
图6为融合蛋白Pro237经Ni-NTA Sepharose层析分离纯化后的SDS-PAGE电泳结果图。图中，1～12表示上清经过NTA-Ni树脂亲和层析柱后收集到的12管(1ml/tube)蛋白样品。
图6结果表明经IPTG诱导后表达的融合蛋白Pro237分离纯化后可以得到纯度较高的融合蛋白Pro237。
实施例5 Pro237的降血糖作用
实验材料与方法：
健康昆明小鼠(清洁级，第四军医大学实验动物中心提供)；
D-葡萄糖(1.5g/kg)，0.9％Nacl溶液，Pro237，GLP-1(美国多肽公司)；
全自动血糖仪(德国罗氏诊断公司，罗康全TM活力型血糖检测仪)
健康昆明小鼠，雌雄各半，禁食16-18小时，分为5组(n＝6-12)。①生理盐水对照组；②阳性对照药组(GLP-1，30nmol/kg)；③Pro237(30nmol/kg)组；④Pro237(3nmol/kg)组；⑤Pro237(0.3mol/kg)剂量组。所述的Pro237为实施例1的制备产物。
各组皮下给药15min后分别给予糖负荷(1.5g/kg)，给糖时记为0时刻。分别于5、10、20、30、60、90、120、150min从小鼠尾静脉取血，用血糖仪测定血糖值。为长时间观察Pro237降血糖作用，于150min时尾静脉取血后立即再次给予D-葡萄糖(1.5mg/kg)，按相同时间间隔测定血糖。(见图7、图8、图9)
图7为皮下注射Pro237对C57BL/6小鼠的口服葡萄糖耐量试验，两次给予糖负荷后的血糖水平的降血糖作用结果统计图；图8为皮下注射不同剂量Pro237对C57BL/6小鼠口服葡萄糖耐量试验，糖负荷后20min时不同剂量的血糖值的降血糖作用结果统计图；图9为皮下注射不同剂量Pro237对C57BL/6小鼠口服葡萄糖耐量试验，糖负荷后20min时不同剂量的血浆胰岛素值的降血糖作用结果统计图。
结果如图7、图8、图9所示，可以看出，Pro237呈剂量依赖性降低血糖浓度，刺激胰岛素分泌。上述剂量的Pro237对小鼠正常血糖浓度无影响。等剂量Pro237的降糖作用较GLP-1作用强。实验表明，糖负荷动物在灌胃给糖后120分钟血糖恢复至正常水平。第二次糖负荷(1.5g/kg)， Pro237仍发挥其降糖作用。上述结果表明Pro237能够明显提高小鼠对糖的耐受性，不降低正常血糖，剂量依赖性降低过高血糖，刺激胰岛素分泌，其降糖作用可以维持3h以上。
实施例6 Pro237抑制摄食、减轻体重的作用
实验材料与方法：
C57BL/6小鼠(SPF级，第四军医大学实验动物中心提供)；
自发性糖尿病db/db小鼠(SPF级，南京大学国家模式动物研究所提供)；0.9％Nacl溶液，Pro237；
健康C57BL/6小鼠和自发性糖尿病db/db小鼠各分为2组(n＝6-10)。①生理盐水对照组；②Pro237(3nmol/kg)组。所述的Pro237为实施例1的制备产物。
各组于每天上午9:00和下午6:00皮下给药，连续给药7周.分别于每日上午11:00时测定各组动物的摄食量及体重。(见图10、图11)。
图10、图11为融合蛋白Pro237对摄食量及体重的影响结果图。其中，图10为每日皮下注射Pro237对健康C57BL/6小鼠及自发性糖尿病db/db小鼠摄食量的影响的统计结果图；图11为皮下注射Pro237对健康C57BL/6小鼠及自发性糖尿病db/db小鼠体重的影响的统计结果图。
图10、图11的结果显示出，Pro237在为期7周的给药过程中可明显减少糖尿病小鼠的摄食量，并减少糖尿病小鼠的体重，但对健康小鼠的摄食及体重无明显影响。由此可见，Pro237在一定程度上可用于控制糖尿病所引起的肥胖症状。
序列表
<110>第四军医大学
<120>人胰高血糖素样肽-1类似物的融合蛋白及其应用
<130>无
<140>200710018734.2
<141>2007-12-10
<160>6
<170>PatentIn version 3.2
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Asp
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Leu Val Lys Gly Arg Xaa Arg Arg His Ala Asp Gly Ser Phe Ser Asp
100 105 110
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130 135
<210>6
<211>170
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<223>重组构建体
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<400>6
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165 170