技术领域
一株产α-酮戊二酸重组菌的构建及用其生产α-酮戊二酸的方法，属于辅因 子代谢调控策略优化发酵过程技术领域。本发明涉及一种分子手段过量表达 ACS2提高胞内辅酶A的存在形式及其含量，从而调控碳代谢流实现α-酮戊二酸 (α-KG)过量积累的方法。通过研究辅因子(乙酰辅酶A)对代谢流流向及相应的代 谢通量的影响，达到α-酮戊二酸的大量积累。
背景技术
α-酮戊二酸，又称α-胶酮酸，2-氧代戊二酸或α-羰基戊二酸，是三羧酸 (TCA)循环中重要的中间产物之一，在微生物细胞的代谢中起着重要的作用，也 是合成多种氨基酸、蛋白质的重要前体物质。其结构式为：
α-酮戊二酸结构式
α-酮戊二酸在医药、有机合成、营养强化剂等领域有着重要的应用前景， 目前主要应用领域为：作为运动营养饮料的成分；有机中间体；生化试剂和测 肝功能的配套试剂；体格增强补剂；降低术后患者和长期病人的机体损耗；在 脑部作为酪氨酸和谷氨酸的前体；同时研究还表明，α-酮戊二酸具有抗氰作用， 与亚硝酸钠、硫代硫酸钠配合使用可提高抗氰能力，且有抗惊厥作用。α-酮戊 二酸目前主要消费于医疗机构，用来诊断和对神经疾病进行治疗。
辅因子工程所涉及到的辅因子主要有：ATP/ADP/AMP、NADH/NAD+、 NADPH/NADP+、辅酶A及其衍生物、维生素和微量元素。目前研究主要集中 在调节ATP/ADP/AMP、NADH/NAD+、NADPH/NADP+和辅酶A及其衍生物等 辅因子在细胞内的形式和含量对代谢途径及代谢流量的影响。因此，对辅酶A 如何影响工业微生物中碳代谢和碳代谢流流向分布的研究思路符合国内外研究 的主流方向。
发明内容
本发明的目的是通过过量表达乙酰辅酶A合成酶基因，改变胞内辅因子之 一——辅酶A的存在形式和浓度，研究其在细胞中控制代谢流方向和流量分配 的作用机制、物质流和辅因子流的变化规律。提供一种辅因子调控碳代谢流实 现α-酮戊二酸(α-KG)过量积累的方法。
本发明的技术方案：一株产α-酮戊二酸重组菌，其分类命名为光滑球拟酵 母Torulopsis glabrata WSH-IP303 ACS 2-1，已保藏于中国典型培养物保藏中心， 保藏编号：CCTCC NO：M 208021。
所述的光滑球拟酵母Torulopsis glabrata CCTCC NO：M 208021的构建方 法，通过过量表达乙酰辅酶A合成酶的手段，根据NCBI网站发表的酿酒酵母 S288C的乙酰辅酶A合成酶基因的序列，设计一对引物：
S：5’-ggATTggAATTCCgCggTTAgTgATTgTTATAC-3’
A：5’-gTTAgCggCCgCTTTCCTAgCTgACCAgTAAAA-3’ 用于从酿酒酵母总DNA中扩增ACS2基因，然后将其插入穿梭质粒pYES2的 GAL1-promoter后的多克隆位点中，得到表达质粒pYES2-ACS2，转化Torulopsis glabrata WSH-IP303的尿嘧啶缺陷型菌株，筛选获得重组菌WSH-IP303 ACS2-1， 即CCTCC NO：M 208021。
一种α-酮戊二酸的生产方法，采用CCTCC NO：M 208021为出发菌株，经 种子培养和液体发酵生产α-酮戊二酸；
种子培养：种子培养基以g/L計：葡萄糖30，蛋白胨10，硫酸铵10，磷酸 二氢钾1，七水硫酸镁0.5，pH 5.5，自来水定容至1L；培养条件：从新鲜斜面 上接一环菌入种子培养基，500mL锥形瓶中种子培养基为50mL，温度为 28-30℃，转速200r/min，培养时间为30-32h；
液体发酵培养：发酵培养基以g/L計：葡萄糖100-120，氯化铵7，磷酸二 氢钾5，七水硫酸镁0.8，乙酸钠4-6，碳酸钙40-60，微量元素液10mL，维生 素液10mL；培养条件：10％接种量(v/v)将种子液接种于发酵培养基，摇瓶发 酵：500mL锥形瓶中发酵培养基为50mL，温度为28-30℃，转速200r/min， 发酵时间为48h-72h；所述微量元素液：CaCl2·2H2O 2g，FeSO4·7H2O 2g，ZnCl20.5g，MnCl2·4H2O 12g，CuSO4·5H2O 0.05g，2mol/L HCl溶解后定容至1L； 所述维生素液：烟酸80mg，硫胺素0.15mg，吡哆醇40mg，生物素4mg，核 黄素10mg，自来水定容至1L。
所生产的α-酮戊二酸产量达到18.7g/L。
以下是本发明技术方案的详细描述。
目的基因ACS2扩增与表达质粒的构建
以Saccharomyces cerevisiae全基因组序列为模板，PCR扩增得到与预期大 小相符的ACS2目的片段(2Kbp)。将其克隆入质粒pYES2，得到ACS2基因表达 质粒pYES2-ACS2，构建好的重组质粒pYES2-ACS2经酶切分析，并进行DNA 测序证明。SnaBI单酶切得到大小为1671bp和6431bp的两条条带，克隆的ACS2 基因与预期结果一致，表明重组质粒构建正确。
过量表达ACS2的Torulopsis glabrata重组菌的筛选
将连接好的大小为1000bp的左右臂片段电转化Torulopsis glabrata WSH-IP303感受态细胞，将能在FOASM平板生长的菌落在SM、MM平板上划 线分离，筛选得到在SM上生长良好而不在MM平板生长的转化子即为尿嘧啶 营养缺陷型菌株Torulopsis glabrata Δura3。将重组质粒pYES2-ACS2电转化 Torulopsis glabrata Δura3感受态细胞。将在含有尿嘧啶的MM平板上筛选到阳 性重组菌株，挑取阳性重组子若干进行菌落PCR，得到2kb大小的片段。所得 重组菌命名为Torulopsis glabrata WSH-IP303 ACS2-1，即CCTCC NO：M 208021。 该菌在以葡萄糖为碳源的培养基上生长时，ACS2酶活为1.20U/mg protein-1，是 出发菌株Torulopsis glabrata WSH-IP303的9.2倍。
微生物菌株的种子培养与发酵：
种子培养基(g/L)：葡萄糖30g，蛋白胨10g，硫酸铵10，磷酸二氢钾1g， 七水硫酸镁0.5g，琼脂20g(斜面用)，pH5.5，自来水定容至1L。
发酵培养基(g/L)：葡萄糖100-120g，氯化铵7g，磷酸二氢钾5g，七水硫 酸镁0.8g，乙酸钠4-6g/L，碳酸钙40-60g(摇瓶时添加)，微量元素液10mL， 维生素液10mL，pH5.0，自来水定容至1L。微量元素液：CaCl2·2H2O 2g， FeSO4·7H2O 2g，ZnCl2 0.5g，MnCl2·4H2O 12g，CuSO4·5H2O 0.05g，2mol/L HCl 溶解后定容至1L。维生素液：烟酸80mg，硫胺素0.15mg，吡哆醇40mg， 生物素4mg，核黄素10mg，自来水定容至1L。
种子培养基和发酵培养基的灭菌温度为115-121℃，15min。维生素等热敏 性材料配制后0.2μm膜滤除菌，接种前加入。
将实验菌株接种到种子培养基中，500mL摇瓶装液50mL，于30℃，200rpm 条件下培养20-24h。
按10％的接种量将培养好的种子接入发酵培养基，30℃，200rpm条件 下培养48-72h。
细胞干重的测定：取一定量的菌悬液置于10mL容量瓶中，加2mL盐酸 溶解菌悬液中的碳酸钙，加入去离子水定容至10mL，摇匀，用UV 7500型可 见分光光度计，于660nm处比色测OD值，用细胞干重标准曲线算得细胞干重。
丙酮酸(pyr)和α-KG浓度的测定：高效液相色谱(HPLC)。
仪器：Agilent 1100高效液相色谱仪(配紫外可见检测器、视差折光检测器 和工作站)。
色谱条件：色谱柱：Agilent ZORBAX SB-Aq柱，5μm，4.6mm×250mm； 流动相：甲液：取磷酸16.6mL，加水至1L；乙液：取磷酸氢二钠71.63g，加 水至1L；混合比例：甲液72.5mL，乙液27.5mL，混和摇匀；99％上述溶液加 1％乙腈为最终流动相。流速：1mL/min，柱温：28℃，进样量：5μL，紫外检 测器波长：210nm。
样品制备：500μL发酵液在10000rpm下离心10min，取上清液移入试管 中以备测α-KG。测α-KG时，取100μL上清液移入5mL容量瓶中，去离子水 定容至刻线，经0.45μm滤膜过滤后，滤液供液相色谱分析用。
本发明的有益效果：本发明的特点是以高产光滑球拟酵母(Torulopsis glabrata)WSH-IP303为出发菌，利用分子手段构建了一株过量表达ACS2的重 组菌Torulopsis glabrata WSH-IP303 ACS2-1，即CCTCC NO：M 208021，通过 辅因子角度调控工业微生物中碳代谢和碳代谢流流向分布，使碳代谢流从积累 丙酮酸转向大量积累α-KG，其中丙酮酸节点从35.6g/L下降到23.6g/L，α-KG 节点从4.5g/L提高到18.7g/L。这一调节微生物细胞中关键辅因子的浓度，促 进流向目标代谢产物的代谢流的最大化和快速化，实现代谢产物过量积累的策 略，为工业生物技术特别是发酵过程优化提供了新的技术思路。
与出发菌株Torulopsis glabrata WSH-IP303相比，重组菌Torulopsis glabrata WSH-IP303 ACS2-1 CCTCC NO：M 208021：(1)能以乙酸为唯一碳源在胞内积 累0.94mM/g DCW的乙酰辅酶A；(2)以葡萄糖为唯一碳源时胞内乙酰辅酶A 浓度、α-酮戊二酸产量和Cα-KG/Cpyr是出发菌株WSH-IP303的3.22、2.05和2.52 倍；(3)在葡萄糖培养基中添加4g/L乙酸，导致乙酰辅酶A浓度、α-酮戊二酸 产量和Cα-KG/Cpyr是出发菌株WSH-IP303的4.55、2.47和3.75倍，α-酮戊二酸 浓度达到17.8g/L。结果表明，提高细胞内乙酰辅酶A水平能将碳代谢流最大化、 快速化地导向目标代谢产物。
生物材料样品保藏
一株产α-酮戊二酸重组菌，其分类命名为光滑球拟酵母Torulopsis glabrata WSH-IP303 ACS 2-1，已保藏于中国典型培养物保藏中心，简称CCTCC，保藏 日期2008年1月27日，保藏编号：CCTCC NO：M 208021。
附图说明
图1重组质粒酶切鉴定图
图2尿嘧啶缺陷型平板筛选结果
图3Torulopsis glabrata WSH-IP303 ACS2-1菌落PCR电泳图
具体实施方式
实施例1重组菌的构建及鉴定
以Saccharomyces cerevisiae全基因组序列为模板，PCR扩增得到与预期大 小相符的ACS2目的片段(2Kbp)。将其克隆入质粒pYES2，得到ACS2基因表达 质粒pYES2-ACS2，构建好的重组质粒pYES2-ACS2经酶切分析，并进行DNA 测序证明。SnaBI单酶切得到大小为1671bp和6431bp的两条条带(图1)，克隆 的ACS2基因与预期结果一致，表明重组质粒构建正确。将连接好的大小为1000 bp的光滑球拟酵母URA3基因的左右臂片段电转化Torulopsis glabrata WSH-IP303感受态细胞，将能在FOASM平板生长的菌落在SM、MM平板上划 线分离，筛选得到在SM上生长良好而不在MM平板生长的转化子即为尿嘧啶 营养缺陷型菌株Torulopsis glabrata Δura3(图2)。将重组质粒pYES2-ACS2电 转化Torulopsis glabrata Δura3感受态细胞。将在含有尿嘧啶的MM平板上筛 选到阳性重组菌株，挑取阳性重组子若干进行菌落PCR，得到2Kbp大小的片 段(图3)。所得重组菌命名为T.glabrata WSH-IP303 ACS2-1 CCTCC NO：M 208021。该菌在以葡萄糖为碳源的培养基上生长时，ACS2酶活为1.20U/mg protein-1，是出发菌株的9.2倍。其中：
基本培养基MM(g/L)：葡萄糖30，蛋白胨10，磷酸二氢钾1，MgSO4·7H2O 0.5， (NH4)2SO4 10，维生素液10mL，微量元素液10mL，固体培养基添加琼脂20。
补充培养基SM(g/L)：MM+60尿嘧啶，固体培养基添加琼脂20。
选择性培养基FOASM(g/L)：SM+5-FOA(5-氟乳清酸)500。
完全培养基CM(g/L)：葡萄糖20，蛋白胨20，酵母膏10，固体培养基添加琼脂20。
实施例2乙酸为唯一碳源时重组菌与原菌发酵特性比较
在以乙酸为唯一碳源时重组菌T.glabrata WSH-IP303 ACS2-1 CCTCC NO： M 208021和出发菌株WSH-IP303均不利用乙酸合成丙酮酸，但对于重组菌，却 能分泌5.4mM(0.8g/L)的α-酮戊二酸；重组菌T.glabrata WSH-IP303 ACS2-1 CCTCC NO：M 208021能以乙酸为唯一碳源在胞内积累0.94mM/g DCW的乙 酰辅酶A，而出发菌株WSH-IP303却不能利用乙酸合成乙酰辅酶A。
实施例3添加不同浓度乙酸对胞内乙酰辅酶A含量及α-KG产量的影响
在发酵液中添加乙酸钠：0g/L、4g/L、6g/L、8g/L时，重组菌T.glabrata WSH-IP303 ACS2-1 CCTCC NO：M 208021和出发菌株WSH-IP303的代谢特性 不同：(1)以葡萄糖为唯一碳源时，尽管重组菌的丙酮酸产量仅为出发菌株的 80％，但α-KG产量和Cα-KG/Cpyr值比菌株WSH-IP303分别高105％和152％；(2) 在葡萄糖培养基中添加4g/L乙酸，重组菌株T.glabrata WSH-IP303 ACS2-1 CCTCC NO：M 208021的丙酮酸产量、α-KG产量和Cα-KG/Cpyr值分别是出发菌 株的0.66、2.47和3.75倍；(3)与以葡萄糖为唯一碳源比较，添加4g/L乙酸则 使重组菌T.glabrata WSH-IP303 ACS2-1 CCTCC NO：M 208021的α-KG产量和 Cα-KG/Cpyr值分别提高27.1％和56.2％。但乙酸的添加并不改变出发菌株的代谢特 性。进一步对胞内辅酶A的考察结果：(1)葡萄糖为唯一碳源时重组菌T.glabrata WSH-IP303 ACS2-1 CCTCC NO：M 208021中乙酰辅酶A的浓度是出发菌株 WSH-IP303的3.22倍。(2)添加4g/L乙酸并不增加出发菌株WSH-IP303胞内 乙酰辅酶A浓度，但使重组菌WSH-IP303 ACS2-1 CCTCC NO：M 208021乙酰 辅酶A浓度增加到13.07mM/g DCW，是出发菌株WSH-IP303的4.55倍。