海藻糖6磷酸合酶调节植物生长的用途.pdf

本发明涉及海藻糖－6－磷酸合酶调节植物生长的用途。更具体地，本发明涉及包含合酶样和磷酸酶样部分的II类海藻糖－6－磷酸合酶调节植物生长的用途。优选地，下调海藻糖－6－磷酸合酶的活性以获得增加的植物生物量产量。

1.植物II类海藻糖-6-磷酸合酶调节植物生长的用途。 2.根据权利要求1的用途，其中所述调节是增加的根生长、增加的茎粗、增加的叶数目和/或增加的种子大小。 3.根据权利要求1或2的用途，其中所述用途是海藻糖-6-磷酸合酶活性的失活。 4.根据前述任一项权利要求的用途，其中所述调节是在无光照时获得的。 5.植物II类海藻糖-6-磷酸合酶增加淀粉合成的用途。 6.根据前述任一项权利要求的用途，其中所述海藻糖-6-磷酸合酶选自由SEQ ID NO.:1-15组成的组中。 7.根据权利要求6的用途，其中所述海藻糖-6-磷酸合酶为SEQ ID NO.:4。 8.根据权利要求6的用途，其中所述海藻糖-6-磷酸合酶为SEQ ID NO.:1。



本发明涉及植物II类海藻糖-6-磷酸合酶调节植物生长的用途。更具体 地，本发明涉及包含合酶样和磷酸酶样部分的II类海藻糖-6-磷酸合酶调节植 物生长的用途。优选地，下调II类海藻糖-6-磷酸合酶的活性以获得增加的植 物生物量产量。

海藻糖是一种广泛分布的二糖，存在于细菌、真菌、昆虫和植物中。 在微生物中，海藻糖累积通常与胁迫抗性有关，不仅仅与干燥和渗透胁迫 抗性有关。然而在植物中，除了一些更苏植物例如鳞叶卷柏(Selaginella lepidophylla)之外，不是很清楚海藻糖的作用。

在大多数情况下，海藻糖合成为两步过程，其中海藻糖-6-磷酸合酶 (TPS)合成海藻糖-6-磷酸(T6P)，然后经T6P磷酸酶(TPP)去磷酸化生成 海藻糖。虽然在大多数植物中几乎检测不到海藻糖，但在例如拟南芥中存 在多个TPS和TPP基因的同源物(Vogel et al.，2001；Leyman et al.，2001； Eastmond et al.，2003)。在以异源海藻糖生物合成基因转化的转基因植物发 生的海藻糖累积导致非生物性胁迫耐性的改善(Garg et al.，2002；Jang et al.， 2003)。然而，在大多数植物中尽管存在多个海藻糖生物合成基因却没有显 著的海藻糖累积，支持了基因产物的调控作用，而不支持海藻糖作为胁迫 保护剂的作用。实际上，一些作者提出在糖代谢(Eastmond et al.，2003)和 淀粉合成(Kolbe et al.，2005)中TPS(Avonce et al.，2004)及其基因产物 T6P的调控作用。T6P对碳水化合物利用和生长而言是必不可少的 (Schluepmann et al.，2003)，但是T6P的累积似乎引起幼苗的生长抑制 (Schluepmann et al.，2004)。现有的数据有时是相矛盾的，并且仍远不清楚海 藻糖生物合成基因的作用。这些出版物中没有一个与植物TPS可能的作用相 联系，尤其是植物生长和产量中的II类植物TPS。

EP0901527公开了通过改变T6P的水平对植物代谢的调节。更具体地， 他们宣称通过增加海藻糖-6-磷酸的细胞内有效性可增加植物的产量。然而， 相当矛盾的，他们也宣称通过降低海藻糖-6-磷酸的细胞内有效性可刺激植 物细胞或组织的生长。此外，如最近的文献所显示，这表明T6P平衡是十分 微妙的并且决不是简单的。发明人通过在植物中表达异源TPS和TPP基因实 现对T6P含量的调节。尽管该专利提及可通过上调或者下调内源基因获得相 似的结果，人们将预料到，由于植物基因的巨大数量，这些基因中的一个 基因的缺失或者过表达对T6P浓度即使有影响也仅具有有限的影响。这对于 同时存在合酶样结构域和磷酸酶样结构域的II类TPS基因来说是尤其正确 的。如果两个结构域都有活性，最终产品将是海藻糖而不是T6P。此外，对 于至少两个拟南芥II类TPS基因，AtTPS7和AtTPS8，没有检测到合酶或者磷 酸酶活性(Vogel et al.，2001；Eastmond et al.，2003)，暗示对这些基因的操纵 完全不会影响植物的T6P含量。

令人惊讶地，本发明人发现植物II类TPS可用于调节植物生长和生物量 产量。实际上，与基于文献所预期的相反，植物TPS活性失活导致增强的茎 和根生长以及增加的植物生物量。

本发明的第一个方面是植物II类TPS用于调节植物生长的用途。本申请 所使用的术语“植物”包括全植物，该植物的祖先和后代及植物部分(包括 种子、枝条、茎、叶、根(包括块茎)、花及组织和器官)，其中上述每一个 都包含感兴趣的基因/核酸。术语“植物”也包括植物细胞、悬浮培养物、 愈伤组织、胚、分生组织区、配子体、孢子体、花粉和小孢子，同样其中 上述每一个都包含感兴趣的基因/核酸。在本发明的方法中尤其有用的植物 包括所有属于绿色植物界(Viridiplantae)超家族的植物，尤其是单子叶和双 子叶植物。作为非限制性的实例，其可以是用于食物或饲料的农作物，其 中根、叶、茎或种子生物量的增加增加了农作物产量。或者，农作物可以 用于观赏或工业目的(例如淀粉产生)，或者可以用作用于生物燃料生产的 原材料。已知的用于生物燃料的农作物为本领域技术人员已知并且包括但 不限于粮食作物(例如玉米、大豆、亚麻仁、油菜籽、甘蔗)、经济作物(例 如大麻和柳枝稷(switchgrass)和木本生物质(例如杨树和柳树)。

这里所使用的TPS指与海藻糖-6-磷酸家族其他成员结构同源的基因和 蛋白质，但是不意味着该蛋白质具有有效的海藻糖-6-磷酸合成活性。优选 地，所述TPS具有与糖基转移酶20(pfam00982.12)同源的结构域。术语“结 构域”指根据进化相关蛋白的序列比对在特异性的位点保守的一组氨基酸。 虽然其他位置的氨基酸可在同源物间变化，在特异性位点高度保守的氨基 酸指示在蛋白质的结构、稳定性或活性中可能是必需的氨基酸。通过一组 蛋白质同源物的比对序列中的高度保守性的鉴定，它们可用作标识以确定 是否某一讨论的多肽属于先前鉴定的多肽家族。作为非限制性的实例，由 于其结构，本申请所使用的TPS可以具有T6P磷酸酶活性，或者具有合酶和 磷酸酶的组合活性。如本申请提及的那样，TPS的用途包括基因的用途、蛋 白质的用途、以及增加或降低蛋白质活性的化合物的用途。作为非限制性 的实例，降低TPS活性的化合物可以是失活的TPS抗体。

优选地，根据在拟南芥中的分类，所述TPS是I1类TPS。II类TPS包括海 藻糖-6-磷酸合酶样结构域及海藻糖-6-磷酸磷酸酶样结构域(Leyman et al.， 2001；Vogel et al.，2001)；优选地，所述II类TPS包含海藻糖-6-磷酸合酶样结 构域以及包含具有序列LDYD(G/D)T的磷酸酶盒和/或具有序列GDD(R/Q) SD的磷酸酶盒的海藻糖-6-磷酸磷酸酶样结构域；更优选地，所述II类TPS 包含海藻糖-6-磷酸合酶样结构域以及包含至少一个，优选两个如Leyman et al.，(2001)描述的磷酸酶盒的海藻糖-6-磷酸磷酸酶样结构域。甚至更优选 地，所述TPS选自SEQ ID NO.：1-15(AtTPS5-11、水稻直系同源物、杨树直 系同源物)，或其同源物、直系同源物或旁系同源物。蛋白质的“同源物” 包括相对于所讨论的未修饰蛋白质具有氨基酸取代、缺失和/或插入并且具 有与自其衍生的未修饰蛋白质相似的生物学和功能活性的肽、寡肽、多肽、 蛋白质和酶。缺失指从蛋白质除去一或多个氨基酸。插入指在蛋白质中的 预定位点导入一或多个氨基酸残基。插入可以包含N末端和/或C末端融合以 及单个或者多个氨基酸的内部序列插入。取代指蛋白质的氨基酸用具有相 似性质(例如相似的疏水性、亲水性、抗原性、形成或断裂α-螺旋结构或者 β-折叠结构的倾向)的其他氨基酸替换。典型地，氨基酸取代是单个残基的 取代，但根据多肽上的功能限制可成簇取代；插入通常是约1到10个氨基酸 残基的顺序的插入。氨基酸取代优选保守氨基酸取代。保守取代表为本领 域所熟知。

“直系同源物”和“旁系同源物”包括惯于描述基因的祖先关系的进 化的概念。旁系同源物是相同物种内的基因，其起源于祖先基因的复制； 直系同源物是来自不同生物体的基因，其起源于物种形成。可通过进行所 谓的重复blast搜索(reciprocal blast search)容易地发现直系同源物和旁系 同源物。典型地，这包括涉及利用BLASTP或TBLASTN(使用标准缺省值)， 以SEQ ID NO.：1或SEQ ID NO.：4作为查询序列进行BLAST的第一次 BLAST。BLAST结果可任选地被过滤。然后，将过滤结果或非过滤结果的 全长序列与来自查询序列衍生的生物体的序列再进行BLAST(第二次 BLAST)(其中查询序列对应于AtTPS8或AtTPS5，第二次BLAST因此与拟南 芥序列对比)。然后比较第一次和第二次BLAST的结果。如果来自第一次 BLAST的高等级命中来自与衍生查询序列的物种相同的物种，然后反向 BLAST理想地在最高命中当中找到查询序列，则鉴定为旁系同源物；如果 第一次BLAST中的高等级命中不是来自与衍生查询序列的物种相同的物 种，并且优选反向BLAST在最高命中当中找到查询序列，则鉴定为直系同 源物。高等级命中的具有低E-值。E-值越低，得分越重要(或者换句话说偶 然发现该命中的机会越低)。在本领域中已周知E-值的计算方法。除E-值之 外，也通过百分比相同性对比较进行评分。百分比相同性指两条相比较的 多肽序列间在特定长度上相同氨基酸的数目。在大家族的情况下，可使用 ClustalW，继之以邻位相连进化树(neighbour joining tree)，以帮助显现相关 基因的聚类并鉴定直系同源物和旁系同源物。

或者，可通过对海藻糖合酶结构域和对磷酸酶结构域之一进行结构域 搜索鉴定同源物、直系同源物和旁系同源物。然后，利用bl2seq将全长的蛋 白质序列与SEQ ID NO.：4相比较(Tatusova and Madden，1999)。利用这一比 对，直系同源物或旁系同源物具有最少50％的相同性，优选55％的相同性， 更优选60％的相同性。作为非限制性的实例，AtTPS8直系同源物存在于水 稻(Oryza sativa)(Genpept登录号ABF94728、BAF06162和BAF11342)、甘蓝 (Brassica oleracea)(Genpepts登录号ABD65165)、苜蓿(Medicago trunculata) (Genpept登录号ABE86430)、小花杓兰(Cypripedium parviflorum)(Genpept 登录号AAN86570)及Ginlo biloba(genbank登录号AAX16015)中。

在一个优选的实施方式中，所述TPS是AtTPS8(SEQ ID NO.：4)。在另一 个优选的实施方式中，所述TPS是AtTPS5(SEQ ID NO.：1)。

优选地，所述用途是TPS活性的失活，所述调节是增加植物生物量和/ 或植物产量。失活TPS活性的方法是本领域技术人员已知的，其包括但不限 于敲除基因、RNAi的使用、基因沉默、TPS启动子的敲除、TPS启动子或编 码区中的失活突变、或通过植物合成抗TPS的灭活性抗体。优选地，通过增 加的根生长、增加的茎粗、增加的叶数目和/或增加的种子大小实现植物生 物量和/或植物产量的增加。一个优选的实施方式是TPS调节植物生长的用 途，其中所述调节是在无光照时获得的。术语“产量”通常意指可测量的 经济价值产出，典型地与特定的农作物、面积以及时期相关。单独的植物 部分基于它们的数量、大小和/或重量直接促进产量，或实际产量是农作物 每年每英亩的产量，其通过总产量(包括收获和评估产量)除以种植英亩数 确定。术语“增加”、“改善”或“增强”可以互换，且在本申请中意指与 本申请所定义的对照植物相比，多出至少5％、6％、7％、8％、9％或10％， 优选至少15％或20％，更优选25％、30％、35％或40％的产量和/或生长。增 加的种子产量可以用以下一或多项表征：a)种子生物量(总的种子重量) 的增加，其可以是基于个体种子和/或每株植物和/或每公顷或英亩的种子生 物量的增加；b)每株植物增加的花的数目；c)增加的(充实的)种子数； d)增加的种子充实率(充实率表示为充实的种子数除以种子总数的比率)； e)增加的收获指数，收获指数表示为可收获部分(例如种子)的产量除以 总生物量的比率；和f)增加的千粒重(TKW)，千粒重从计数的充实种子 数及其总重量推断。增加的TKW可由增加的种子大小和/或种子重量引起， 也可由胚和/或胚乳大小的增加引起。

本发明的另一方面是如上定义的植物II类TPS用于调节淀粉合成的用 途。优选地，所述用途是TPS活性的失活，所述调节是增加淀粉合成。优选 地，根据在拟南芥中的分类，所述TPS是II类TPS。II类TPS包含海藻糖-6- 磷酸合酶样结构域以及海藻糖-6-磷酸磷酸酶样结构域(Leyman et al.， 2001；Vogel et al.，2001)。甚至更优选地，所述TPS选自SEQ ID NO.：1-15 (TPS5-11，水稻直系同源物，杨树直系同源物)。在一个优选的实施方式中， 所述TPS是AtTPS8(SEQ ID NO.：4)。在另一个优选的实施方式中，所述TPS 是AtTPS5(SEQ ID NO.：1)。

本发明的另一个方面是相对于对照植物改善植物中各种与产量相关的 特性的方法，包括在植物中调节II类TPS核酸和/或II类TPS多肽的表达和/或 翻译，其中所述调节的表达包括减少或基本上消除(substantial elimination) 植物中内源II类TPS基因的表达和/或翻译。作为非限制性的实例，所述减少 或基本上消除可通过RNA介导的基因表达沉默、通过共表达、通过反义II 类TPS核酸序列的使用、或通过II类TPS核酸的反向重复序列(优选形成发 夹结构的反向重复序列)的使用而获得。

本发明的另一个方面是用于生产相对于对照植物具有增加的产量的转 基因植物的方法，该方法包括：

(i)在植物中导入并表达一种遗传构建体，所述遗传构建体包含一或多 个减少内源II类TPS基因在植物中的表达和/或翻译的控制序列；和

(ii)在促进植物生长和发育的条件下培育该植物、植物部分或植物细 胞。

如本申请所使用的控制序列是本领域技术人员已知的影响II类TPS基因 的表达和/或翻译的序列，其包括但不限于引起共表达的序列、编码反义RNA 的序列和RNAi。

本发明的另一个方面是根据本发明的方法获得的植物，其中由于向植 物导入II类TPS控制核酸序列，所述植物具有减少的内源II类TPS基因的表 达。如本申请所使用的减少的表达是指与非转化的对照植物相比，在相同 的条件下生长，表达基本上减少。本领域技术人员已知测量表达的方法； 基本上减少是优选10％，更优选20％，甚至更优选30％的减少。

附图简述

图1：AtTPS8 KO在MS培养基中的根长(有和没有蔗糖、在光照中和在 黑暗中)。GT2、GT4和GT6是AtTPS8不同的KO品系。

图2：AtCYCD3和ApL3在AtTPS8 KO背景下的表达水平。

图3：与野生型(WT)植物相比，成体AtTPS8 KO的表型表征。

图4：SALK_144791 AtTPS5表达数据。

图5：SALK_144791品系的根长测量。

图6：与WT(Columbia)相比，SALK_144791 AtTPS5 KO品系在1xMS、 1％蔗糖培养基中的表型。

图7：与WT(Columbia)相比，SALK_144791 AtTPS5 KO品系在1xMS、 1％蔗糖培养基中的表型：测试无向重力性效应(agravitrophic effect)。

图8：GT12622 AtTPS5的表达数据。

图9：与WT(Landsbergerecta)相比，基因捕获GT12622 AtTPS5 KO品 系在1xMS、1％蔗糖培养基中的表型。

图10：与WT(Landsbergerecta)相比，基因捕获GT12622 AtTPS5 KO品 系在1xMS、1％蔗糖培养基中的表型：测试无向重力性效应。

实施例

材料与方法

用于AtTPS8的植物材料

用沉默和过表达构建体转化野生型拟南芥植物(Columbia)(参见下 文)。另外，从冷泉港实验室Martienssen实验室获得基因捕获品系(GT13138， Landsberg erecta)。为了研究这些植物的表型，获得纯合品系。对种子进行 表面消毒；并于垂直定向的培养皿中，在纯化琼脂(Duchefa)固化的1x Murashige和Skoog培养基(Duchefa)中，在有1％蔗糖或没有蔗糖(如附图 中标明的)的条件下，在于22℃的12小时的日循环及于18℃的12小时的黑暗 中，使种子发芽。发芽后十天，测量植物的根长。生长在黑暗条件下的植 物在整个时期都保持在黑暗中。

构建体

为了在拟南芥中沉默AtTPS8(At1g70290)，使用Gateway载体pDONR207 和pK7GWIWG2(Karimi et al.，2002)。用含重组位点AttB1和AttB2的两个引 物扩增149bp的AtTPS8特异性序列。正向引物：GGGGACAAGTTTGTACA AAAAAGCAGGC-TCCGAAGTAACTTCTACCTCC；反向引物：GGGGACC ACTTTGTACAAG-AAAGCTGGGTCCCATCTCTAAGTTGTAACTG。将该 构建体转化感受态农杆菌细胞(菌株C58C1)，并利用浸花法(Clough，2005) 转化WT拟南芥植物。在卡那霉素条件下筛选T0代种子并转移至土壤中播 种。再次在卡那霉素条件下筛选T1代种子并筛选纯合的T2品系。

使用PCB302植物载体构建AtTPS8过表达构建体。利用如下引物从原生 质体cDNA扩增全长的AtTPS8：正向引物，CGGGATCCATGGTGTCAAGAT CTTGTGCTAA；反向引物，AAGGCCTAACGATGCTTTCAAATGCAACT T。将该构建体转化农杆菌及如上所述植物。

基因捕获品系

从冷泉港实验室Martienssen实验室获得基因捕获品系(GT13138， Landsberg erecta)。将含有Ds转座因子的pWS32载体转化拟南芥，其被随机 插入基因组中，所述载体具有β-葡糖醛酸糖苷酶(GUS)基因作为报道基因 及新霉素磷酸转移酶(NPTII)基因作为选择标记。葡糖醛酸糖苷酶测定揭 示出插入不同基因的外显子的插入物。然后通过TAIL PCR(Liu et al.，1995) 扩增插入位点并进行测序。确认这些序列并根据拟南芥基因组序列进行注 释。

用于AtTPS5的植物材料

SALK品系′SALK144791′(拟南芥，Colombia生态型)可从 Alonso/Crosby/Ecker农杆菌T-DNA转化的植物收集圃获得并在NASC/ABRC 定购。回收T-DNA侧翼DNA序列，通过美国Salk Institute Genomic analysis Laboratory(SIGnAL)测序，并预测其位于AtTPS5基因(At4g17770)的第一 个外显子中。定购的序列索引品系是分离的(segregating)T3品系。利用 NTPII标记(卡那霉素抗性)和PCR筛选纯合植物，以下称070(2)品系(正 向引物：5’TCCTGCTTATATCCCACCTGAGC3′和反向引物： 5′GCGCCGCTTAAAGAAGGAGAA3′)。利用左侧边界T-DNA引物(Lbal： 5′TGGTTCACGTAGTGGGCCATCG3′)获得序列，并且发现该T-DNA位于 AtTPS5的cDNA中相对起始密码子的第923位。

基因捕获品系GT12622(拟南芥，Landsberg erecta生态型)从美国冷泉 港实验室的Martienssen实验室生产的转座子插入品系的收集圃定购 (Sundaresan et al.，1995；Martienssen，1998)。该品系利用解离转座子(Ds)从 玉米产生，工程化以携带uidA(β-葡糖醛酸糖苷酶(GUS))报道基因和NPTII (新霉素磷酸转移酶)卡那霉素抗性基因。基因捕获报道基因没有启动子， 因此只有当报道基因插入被转录的染色体基因时才发生GUS表达，产生转 录融合。这些元件同时监测基因表达并破坏内源基因功能。基因捕获构建 体具有多个与GUS基因融合的剪接受体。基于通过TAIL-PCR获得的插入位 点的侧翼序列，通过CSHL预测品系GT12622在AtTPS5基因(At4g17770)的 第一个外显子的末端携带有唯一的基因捕获可转座DS元件的插入。交付的 序列索引品系是F3代种子。利用卡那霉素标记和PCR，获得纯合的AtTPS5 敲除品系(F5)，以下称品系GT4.1和GT6.2。设计基因特异性引物(正向引 物：5′TTGGGCGCGTAGCTTTATAC3′和反向引物：5′ CAAGAAGATATGAAAACAGCCTCA3′)，它们与基因捕获构建体边界引物 一起扩增插入位点的特异性侧翼序列。准确的插入位置是AtTPS5 cDNA序 列的第1930位(位于第一个外显子中)。

实施例1：TPS8敲除品系在不同生长条件下显示出增强的生长

在酿酒酵母(Sacchanomyces cerevisiae)中，通过海藻糖-6-磷酸合酶 (由TPS1编码)和海藻糖-6-磷酸磷酸酶(由TPS2编码)从UDP-葡萄糖和葡 萄糖-6-磷酸经两步反应合成海藻糖。在拟南芥基因组中，已经检测到11个 TPS样基因。那些基因可分组在两个亚家族中，显示与酵母TPS1(在酵母中 编码TPS；I类)或者TPS2(在酵母中编码TPP；II类)最相似(Leyman et al.， 2001)。几乎对拟南芥中的TPP样II类基因一无所知。为了研究这些基因的作 用，构建敲除品系(KO)、RNAi品系和过表达品系，并按照材料和方法中 描述的那样进行研究。

在用纯化琼脂(Duchefa)固化的1x Murashige和Skoog培养基(Duchefa) (MS)(添加或者不添加蔗糖)上对品系进行检测。发芽后10天分析代表性的 敲除品系。AtTPS8 KO的结果概括于图1中。KO品系始终显示出独立于生长 条件的显著的根长的增加，尽管当培养基中存在蔗糖时该效果略更显著。

实施例2：TPS8失活促进CYCD3和ApL3表达

为了分析增进生长的潜在机制，通过实时PCR对AtTPS8KO对细胞周期 基因AtCYCD3的表达和对淀粉生物合成基因ApL3的影响进行了研究。与野 生型(wt)相比，ApL3和AtCYCD3的表达都显著更高。结果显示于图2中。 尤其，ApL3结果是出乎意外的，如Kolbe et al.，(2005)近期已表明的那样T6P 诱导淀粉合成，而人们宁可希望T6P在AtTPS8 KO中的浓度更低。

实施例3：TPS8失活导致更高的生物量和更大的植物

将野生型和AtTPS8 KO幼苗种植入土壤中，并生长30天，以比较成体植 物的表型。成体AtTPS8 KO的幼苗在土壤中生长较快，它们具有更多但更小 的莲座叶，并且花序茎是野生型的两倍粗。KO具有大约野生型的两倍之多 的长角果。KO的茎生叶更大并且看起来更像莲座叶(图3)。这导致植物更 高的种子产量和更高的总生物量产量。

实施例4：TPS5失活促进根生长

为了检测AtTPS5在纯合SALK_144791品系中的表达，从品系070(2)的 50株幼苗分离RNA。cDNA的RT-PCR实验(正向引物：5′GCACTCCTCAAC GCTGATTT 3’和反向引物：5’AAGCCCTATGGTTCCACGTT3’)证明 AtTPS5表达的显著下调(图4)。为了对表型进行表征，对品系070(2)的种子 进行湿法消毒(damp-sterilized)(100ml漂白剂+3ml37％的HCL)4-6小时，并 于4℃在恒定光照下吸胀/成层两天。两天后，将种子置于灭菌的植株培养基 平板上(1x MS培养基pH5.7(KOH)，1％蔗糖)，并在生长箱中进行垂直培 养(利用12小时-12小时的光照-黑暗周期，70microE，白天22℃，夜间18℃)。 出芽7天后，测量18株幼苗的根长。SALK品系显示根长显著增加(图5)。这 一结果在第二次实验中得到确认，给出芽13天后的幼苗照相(参见图6)。幼 苗看起来具有略长的根。然而，这需要确认。将一些平板翻转90℃以检查 可能的向重力性效应。4天后，没有检测到无向重力性效应(图7)。

实施例4：基因捕获TPS5失活促进根和下胚轴生长

为了检测AtTPS5在纯合TPS5基因捕获品系中的表达，从两个GT敲除品 系的50株幼苗分离RNA。RT-PCR(正向引物：5′GCACTCCTCAACGCTGA TTT3′和反向引物：5′AAGCCCTATGGTTCCACGTT3′)证明AtTPS5表达的 显著下调(图8)。对种子进行湿法消毒(100ml漂白剂+3ml37％的HCL) 4-6小时，并于4℃在恒定光照下吸胀/成层两天。两天后，将种子置于灭菌 的植株培养基平板上(1x MS培养基pH5.7(KOH)，1％蔗糖)，并在生长箱中 进行垂直培养(利用12小时-12小时的光照-黑暗周期，70microE，白天22℃， 夜间18℃)。出芽十天后，给幼苗照相(图9)。幼苗看起来具有显著更长的 根和更长的胚轴。翻转所述平板90℃几天后，与在Columbia中所观测到的 相反，幼苗显示出无向重力性效应(图10)。

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序列表

<110>福拉姆斯大学生物技术研究所

     K.U.鲁汶研发公司

<120>海藻糖-6-磷酸合酶调节植物生长的用途

<130>JTH/TPS/V229

<150>EP06100950.2

<151>2006-01-27

<150>EP06112770.0

<151>2006-04-19

<160>28

<170>PatentIn version 3.3

<210>1

<211>865

<212>PRT

<213>Arabidopsis thaliana

<400>1

<210>2

<211>847

<212>PRT

<213>Arabidopsis thaliana

<400>2

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<213>Arabidopsis thaliana

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<212>PRT

<213>Arabidopsis thaliana

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<212>PRT

<213>Arabidopsis thaliana

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<212>PRT

<213>Arabidopsis thaliana

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<212>PRT

<213>Arabidopsis thaliana

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<213>Oryza sativa

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<220>

<221>MISC_FEATURE

<222>(5)..(5)

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<223>Consensus sequence

<220>

<221>MISC_FEATURE

<222>(4)..(4)

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<223>Forward primer

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