非洲猪瘟病毒荧光定量PCR检测试剂及其制备方法和用途.pdf

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1、(10)授权公告号 CN 101463396 B (45)授权公告日 2011.06.29 CN 101463396 B *CN101463396B* (21)申请号 200910067620.6 (22)申请日 2009.01.06 C12Q 1/70(2006.01) C12Q 1/68(2006.01) (73)专利权人 天津出入境检验检疫局动植物与 食品检测中心 地址 300456 天津市塘沽区新港 2 号路 2-1126 (72)发明人 董志珍 侯艳梅 赵祥平 李琳 陈本龙 肖妍 黄金海 张霞 (74)专利代理机构 天津才智专利商标代理有限 公司 12108 代理人 王晓红 CN 1。

2、405328 A,2003.03.26, 全文 . CN 1840698 A,2006.10.04, 全文 . CN 101058830 A,2007.10.24, 全文 . (54) 发明名称 非洲猪瘟病毒荧光定量 PCR 检测试剂及其制 备方法和用途 (57) 摘要 本发明公开了一种非洲猪瘟病毒荧光定量 PCR 检测试剂及其制备方法和用途， 设计合成了 一套特异性的引物及 Taqman 探针， 用来检测猪相 关制品中的 ASFV P54。发明中绘制的标准曲线为 ASFV P54 的定量检测提供了标准。本发明建立了 一种快速简便、 特异性强、 灵敏度高的实时荧光定 量 PCR 检测体系， 检。

3、测时间仅为数小时， 检测下限 可达 15 个拷贝， 可直接应用于口岸对进境猪相关 制品的诊断和检疫技术， 为无 ASF 国家的进口检 疫工作提供了可靠、 有效的技术条件。 (51)Int.Cl. (56)对比文件 审查员 徐莉 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利 权利要求书 1 页 说明书 9 页 附图 2 页 CN 101463396 B1/1 页 2 1. 一种非洲猪瘟病毒荧光定量 PCR 检测试剂， 其特征在于， 包含一对特异性引物和一 条特异性探针， 扩增目标长度为 218bp， 引物和探针序列为 ： 上游引物 ： ASFV P54-1 ： 5 -GCAATGGGC。

4、AGAAGTCACT-3 下游引物 ： ASFV P54-2 ： 5 -GTGTAAGGCTCAGTCGGATGA-3 探针 ： ASFV P54-probe ： 5 -FAM-AGTGCAGGCAAACCAGTCACGGGCA-TAMRA-3 。 2.权利要求1所述的非洲猪瘟病毒荧光定量PCR检测试剂的制备方法， 其特征在于， 包 括以下步骤 ： (1) 选择非洲猪瘟病毒的 P54 基因序列保守片段为靶目标， 其基因片段的扩增目标核 苷酸序列如 SEQID NO.1 所示， 为 ： GCAATGGGCAGAAGTCACTCCACAACCAGGTACCTCTAAACCGGCTGGAGCGACT。

5、ACAGCAAGTGCAGGCAA ACCAGTCACGGGCAGACCGGCAACAAACAGACCAGCAACAAACAAACCAGTCACGGACAACCCAGTTACGGACAGAC TAGTCATGGCAACTGGCGGGCCAGCGGCCGCACCTGCGGCCGC GAGTGCTCATCCGACTGAGCCTTACAC ； (2) 根据 P54 基因特点和引物、 探针设计原则， 设计引物和探针 ； (3) 探针的合成同时进行两端荧光标记， 探针 5 端标记的荧光报告基团是 FAM， 3 端标 记的荧光淬灭基团为 TAMRA ； (4) 设计含内切酶位点的非洲猪瘟病毒的 P54 基。

6、因 PCR 扩增引物， 以之构建重组质粒 pET-P54， 引物序列如下 ： 上游引物 ： pET-P54-1 ： 5 -GCGGATCCAATGGATTCTGAAT-3 下游引物 ： pET-P54-2 ： 5 -AGCTCGAGCAAGGAGTTTTCTA-3 ； (5) 经过大量的反应条件优选、 对比试验和验证试验， 确定反应最佳条件、 引物及探针 的特异性和灵敏度。 3. 根据权利要求 2 所述的非洲猪瘟病毒荧光定量 PCR 检测试剂的制备方法， 其特征在 于， 所述(5)中的反应最佳条件为上下游引物及探针的使用浓度为25pmol/L， 50L体系 中加入1L引物及探针， 引物及探针的。

7、特异性使其区别于猪源其它病毒， 灵敏度达到15个 拷贝。 4.权利要求1所述的非洲猪瘟病毒荧光定量PCR检测试剂在生产标准化试剂盒中的应 用。 权 利 要 求 书 CN 101463396 B1/9 页 3 非洲猪瘟病毒荧光定量 PCR 检测试剂及其制备方法和用途 技术领域 0001 本发明属于动物病原检测领域， 尤其是一种以非洲猪瘟基因片段为靶目标设计的 生物制剂， 使用实时荧光定量 PCR(real-time fluorescencequantitative PCR) 技术检测 非洲猪瘟病毒(African swine fever virus， ASFV)中P54基因的方法， 即非洲猪瘟病。

8、毒荧 光定量 PCR 检测试剂及其制备方法和用途。 背景技术 0002 非洲猪瘟 (African swine fever， ASF) 是由非洲猪瘟病毒 (ASFV) 引起的猪的一 种急性、 热性、 高度接触的烈性传染性疾病。 其特征为病程短、 病死率高率， 可高达100， 临 床症状和病理变化均类似于急性猪瘟， 在诊断时极易误诊， 表现高热、 皮肤充血发绀、 流产、 水肿及脏器出血。 (William， Hess Adv.African swine fever ： a reassessmentJ.Vet Sci Comp Med， 1981， 25 ： 3969) 世界动物组织 (OIE) 。

9、列为 A 类疫病， 我国规定为动物一类疾病， 受到世界各国的高度重视 ( 孙怀昌 . 中国预防兽医学报， 1999， 21(2) ： 117 119)。 0003 本病自 1921 年在肯尼亚发现以来， 一直存在于撒哈拉以南的非洲国家， 1957 年先 后流传至西欧和拉美国家， 多数被及时扑灭， 单在葡萄牙， 西班牙西南部和意大利的撒丁岛 仍有流行， 截至目前已在非洲、 欧洲和美洲等数十个国家流行， 而且有不断蔓延趋势。2007 年， 亚美尼亚连续发生六起非洲猪瘟， 我国尚无该病。 0004 非洲猪瘟在国际病毒分类委员会第四次报告中归于虹彩病毒科， 在该委员会第五 次报告中将其列在痘病毒科之下。

10、， 置于该科的脊椎动物痘病毒亚科及昆虫痘病毒亚科之 外。但 DNA 序列分析表明， ASF 病毒具有介于痘病毒和虹彩病毒之间的特征， ASFV 的这一特 性表明它不属于国际病毒分类委员会所核定的任何一科， 是个新科， 1995 年第 9 次国际病 毒分类委员第六次报告， 将非洲猪瘟病毒列入 “类非洲猪瘟病毒属” ， 非洲猪瘟是唯一已知 的代表种。 0005 非洲猪瘟病毒是一种大的、 有囊膜的双链 DNA 病毒， 是唯一的虫媒 DNA 病毒。其 基因组为末端共价闭合的单分子线状双链 DNA， 病毒基因组全长为 170kb 190kb， 中央 有 125kb 左右的保守区， 两端为可变区， 含有末。

11、端反转重复序列， 这些重复序列的增加 或者缺失是造成不同分离株基因组长度差异的主要原因 (Rafacl， Yancz， Javier M， et al.Analysis of the completeNucleotide Sequence of Afican Swine Fever VirusJ. Virology， 1995， 208 ： 249 279)。ASF 病毒基因组有 5 个编码基因， 包括假定膜蛋白、 分 泌性蛋白、 参与核甘酸和核酸代谢 (DNA 修复 ) 以及蛋白修饰的酶， 整个基因组含有 151 个 ORF， 可以编码 150 200 种蛋白质， 已从 ASFV 感染的细胞。

12、中分离鉴定出 86 种病毒蛋白多 肽 ( 曲连东， 于康震， 非洲猪瘟研究进展， 中国兽医科技， 1998， 28(11) ： 42 43)。 0006 非洲猪瘟病毒大多数毒株的毒力都很强， 但是免疫原性很低， 只有少数几个蛋白 具有免疫原性。 0007 ASFV P54 蛋白是由 E183L 基因编码的， 约 25kD 的多肽， 含有一段跨膜区域， 主要 集中在衍生的内质网膜处。P54 蛋白可以在体外培养， 并能感染细胞。而且在感染细胞后 说 明 书 CN 101463396 B2/9 页 4 在内质网膜处短暂表达。P54 蛋白的跨膜结构在病毒蛋白经内质网膜转化成病毒包膜前 体时起着十分重要。

13、的作用 (RodriguezJM， Garcia Escudero African Swine Fever Virus Structural Protein p54Is Essential for the Recruitment of Envelope Precursors to AssemblySites.Journal of Virology， 2004， 78(8) ： 4299 4313)。另外 ASFVP54 蛋 白与8kD的轻链细胞质动力蛋白DLC8存在特殊的交叉反应， 并在细胞内摄作用及病毒加工 过程中起重要作用。感染病毒后复制早期， 病毒可激活细胞凋亡蛋白酶而诱发细胞脱噬作 用。

14、 (Alonso C， J Miskin AfricanSwine Fever Virus Protein p54 Interacts with the Microtubular MotorComplex through Direct Binding to Light-Chain Dynein.Journal ofVirology 2001， 75 ： 9819 9827)。为了分析结构蛋白 P54 在细胞脱噬中所起的作用， 2004年Hernaez B和Diaz-Gil G将其在非洲绿猴肾细胞内短暂表达， 实验表明可激活细胞 凋亡蛋白酶， 诱发细胞脱噬作用 (HernaezB， Diaz G。

15、il G.The African swine fever virus dynein-binding proteinp54 induces infected cell apoptosis.FEBS Letters 2004， 569(123) ： 224 228)。但 P54 的突变体缺失 13aa 而失去激活细胞凋亡蛋白酶的功能 (Alejo A， GAndrs， ML Salas.African Swine Fever VirusProteinase Is Essential for Core Maturation and Infectivity Journalof Virology， 20。

16、03， 77 ： 5571 557)。 0008 目前， 针对 ASFV 的检测和诊断技术主要有两大类， 即基于病毒抗原、 抗体反应的 免疫学方法和包括病毒分离、 病毒抗原和基因组 DNA 的核酸检测技术。试验方法的选择主 要依据本国或本地区的疾病情况而定。在没有 ASF 但又怀疑该病存在的国家， 实验室诊断 必须应用无感染性的诊断方法， 即应用聚合酶链反应 (PCR) 检测病毒基因组 DNA 和应用酶 联免疫吸附试验 (ELISA) 检测血清抗体。用免疫学方法检测抗体可以了解病毒感染以及疾 病发生、 发展的进程， 然而， 由于抗体只有在病毒感染至一定时期后才会出现， 因此， 抗体检 测在作为。

17、快速控制ASFV暴发的方法时存在局限性。 PCR可以检测出各种样本(血液、 粪便、 分泌物、 组织切片)中ASFV的遗传物质DNA， 从而实现早期诊断， 在ASFV的诊断和检测中具 有重要的作用。 0009 近几年发展起来的实时荧光定量 PCR 检测方法将 PCR 与荧光检测结合起来 ( 李维 彬等， 非洲猪瘟病毒 TaqMan 探针实时荧光定量 PCR 检测方法的建立 . 宁夏大学学报， 2007， 28)。在荧光定量 PCR 中， 常使用的荧光标记有 SYBRGreenI 和 TaqMan 探针两种。前者在 分析中荧光值常受到线性扩增产物 ( 由一侧引物延伸到底 ) 和引物二聚体等的影响 。

18、(Chen Y J， HU C J and ZhaoM Q.Construction of realtime quantitative polymerase chain reactionplatform with SYBRGreen I(J).Practical Journal of Medicine &Pharmacy， 2004， 21(11) ： 997 999)， 从而使定量的准确性和灵敏度降低。而以 TaqMan 探针在定量 灵敏度方面要优于前者， 但存在探针设计、 合成技术要求高和实验成本高的不足。Scott M Reidb 和 Geoffrey H 等在 2003 年以 ASFV。

19、 VP72 为目的基因， 建立了实时荧光定量 PCR 检 测技术， 将荧光探针与 PCR 方法结合起来， 使实验更加快速灵敏简便， 可用于快速检测疑 似非洲猪瘟的病例， 作为鉴别诊断的有效方法 (King DP， Reid SM.J VirolMethods， 2003， 107(1) ： 53 61)， 但对于 P54 基因的荧光定量 PCR 技术， 现无论在国内还是国外都尚无报 道。 0010 发明内容 0011 本发明所要解决的技术问题是， 提供一种检测非洲猪瘟 P54 基因的非洲猪瘟病毒 说 明 书 CN 101463396 B3/9 页 5 荧光定量 PCR 检测试剂及其制备方法和用。

20、途。 0012 为了解决上述技术问题， 本发明采用的技术方案是 ： 一种非洲猪瘟病毒荧光定量 PCR 检测试剂， 包含一对特异性引物和一条特异性探针， 扩增目标长度为 218bp， 引物和探 针序列为 ： 0013 上游引物 ： ASFV P54-1 ： 5 -GCAATGGGCAGAAGTCACT-3 0014 下游引物 ： ASFV P54-2 ： 5 -GTGTAAGGCTCAGTCGGATGA-3 0015 探针 ： ASFV P54-probe ： 5 -FAM-AGTGCAGGCAAACCAGTCACGGGCA-TAMRA-3 。 0016 所述的非洲猪瘟病毒荧光定量 PCR 检测。

21、试剂的制备方法， 包括以下步骤 ： 0017 (1) 选择非洲猪瘟病毒的 P54 基因序列保守片段为靶目标， 其基因片段的扩增目 标核苷酸序列如 SEQ ID N0.1 所示， 为 ： 0018 GCAATGGGCAGAAGTCACTCCACAACCAGGTACCTCTAAACCGGCTGGAGCGACTACAGCAAGTGCAGG CAAACCAGTCACGGGCAGACCGGCAACAAACAGACCAGCAACAAACAAACCAGTCACGGACAACCCAGTTACGGACA GACTAGTCATGGCAACTGGCGGGCCAGCGGCCGCACCTGCGGCCGCGAGTGCTC。

22、ATCCGACTGAGCCTTACAC ； 0019 (2) 根据 P54 基因特点和引物、 探针设计原则， 设计引物和探针 ； 0020 (3) 探针的合成同时进行两端荧光标记， 探针 5 端标记的荧光报告基团是 FAM， 3 端标记的荧光淬灭基团为 TAMRA ； 0021 (4)设计含内切酶位点的非洲猪瘟病毒的P54基因PCR扩增引物， 以之构建重组质 粒 pET-P54， 引物序列如下 ： 0022 上游引物 ： pET-P54-1 ： 5 -GCGGATCCAATGGATTCTGAAT-3 0023 下游引物 ： pET-P54-2 ： 5 -AGCTCGAGCAAGGAGTTTTC。

23、TA-3 ； 0024 (5) 经过大量的反应条件优选、 对比试验和验证试验， 确定反应最佳条件、 引物及 探针的特异性和灵敏度。 0025 所述 (5) 中的反应最佳条件为上下游引物及探针的使用浓度为 25pmol/L， 50L 体系中加入 1L 引物及探针， 引物及探针的特异性使其可区别于猪源其它病毒， 灵 敏度达到 15 个拷贝。 0026 所述的非洲猪瘟病毒荧光定量 PCR 检测试剂在检测非洲猪瘟病毒方面及生产标 准化试剂盒中的应用。 0027 所述的非洲猪瘟病毒荧光定量PCR检测试剂在绘制非洲猪瘟病毒荧光定量PCR检 测标准曲线的用途。 0028 所述的绘制非洲猪瘟病毒荧光定量 PC。

24、R 检测标准曲线的用途， 绘制非洲猪瘟病毒 荧光定量 PCR 检测标准曲线包括以下步骤 ： 0029 (1) 重组质粒 pET-P54 的定量， 并换算成拷贝数 ； 0030 (2) 重组质粒 pET-P54 的梯度稀释 ； 0031 (3)以所述的引物及探针对各浓度梯度重组质粒pET-P54进行实时荧光PCR检测， 记录数据生成标准曲线。 0032 本发明的有益效果是 ： 研究建立特异、 敏感、 安全、 准确、 快速的检测方法， 在检疫、 诊断、 分子流行病学研究具有重要意义。 对样品中的低含量的非洲猪瘟病毒、 隐性感染或持 续带毒宿主进行准确检测的方法必须具备高敏感、 高特异性和高准确性。。

25、 说 明 书 CN 101463396 B4/9 页 6 附图说明 0033 图 1 为重组质粒 pET-P54 及不同病毒 DNA 实时荧光 PCR 曲线。 0034 图 2 为标准模板荧光定量扩增动力学曲线。 0035 图 3 为 ASFV P54 标准曲线。 具体实施方式 0036 下面结合附图和具体实施方式对本发明做进一步详细描述。 0037 为了解决上述技术问题， 本发明采用的技术方案是 ： 一种非洲猪瘟病毒荧光定量 PCR 检测试剂， 包含一对特异性引物和一条特异性探针， 扩增目标长度为 218bp， 引物和探 针序列为 ： 0038 上游引物 ： ASFV P54-1 ： 5 -。

26、GCAATGGGCAGAAGTCACT-3 0039 下游引物 ： ASFV P54-2 ： 5 -GTGTAAGGCTCAGTCGGATGA-3 0040 探针 ： ASFV P54-probe ： 5 -FAM-AGTGCAGGCAAACCAGTCACGGGCA-TAMRA-3 。 0041 所述的非洲猪瘟病毒荧光定量 PCR 检测试剂的制备方法， 包括以下步骤 ： 0042 (1) 选择非洲猪瘟病毒的 P54 基因序列保守片段为靶目标， 其基因片段的扩增目 标核苷酸序列如 SEQ ID NO.1 所示， 为 ： 0043 GCAATGGGCAGAAGTCACTCCACAACCAGGTAC。

27、CTCTAAACCGGCTGGAGCGACTACAGCAAGTGCAGG CAAACCAGTCACGGGCAGACCGGCAACAAACAGACCAGCAACAAACAAACCAGTCACGGACAACCCAGTTACGGACA GACTAGTCATGGCAACTGGCGGGCCAGCGGCCGCACCTGCGGCCGCGAGTGCTCATCCGACTGAGCCTTACAC ； 0044 (2) 根据 P54 基因特点和引物、 探针设计原则， 设计引物和探针 ； 0045 (3) 探针的合成同时进行两端荧光标记， 探针 5 端标记的荧光报告基团是 FAM， 3 端标记的荧光淬灭基团为 TAMR。

28、A ； 0046 (4)设计含内切酶位点的非洲猪瘟病毒的P54基因PCR扩增引物， 以之构建重组质 粒 pET-P54， 引物序列如下 ： 0047 上游引物 ： pET-P54-1 ： 5 -GCGGATCCAATGGATTCTGAAT-3 0048 下游引物 ： pET-P54-2 ： 5 -AGCTCGAGCAAGGAGTTTTCTA-3 ； 0049 (5) 经过大量的反应条件优选、 对比试验和验证试验， 确定反应最佳条件、 引物及 探针的特异性和灵敏度。 0050 所述 (5) 中的反应最佳条件为上下游引物及探针的使用浓度为 25pmol/L， 50L 体系中加入 1L 引物及探针，。

29、 引物及探针的特异性使其可区别于猪源其它病毒， 灵 敏度达到 15 个拷贝。 0051 所述的非洲猪瘟病毒荧光定量 PCR 检测试剂在检测非洲猪瘟病毒方面及生产标 准化试剂盒中的应用。 0052 所述的非洲猪瘟病毒荧光定量PCR检测试剂在绘制非洲猪瘟病毒荧光定量PCR检 测标准曲线的用途。 0053 所述的绘制非洲猪瘟病毒荧光定量 PCR 检测标准曲线的用途， 绘制非洲猪瘟病毒 荧光定量 PCR 检测标准曲线包括以下步骤 ： 0054 (1) 重组质粒 pET-P54 的定量， 并换算成拷贝数 ； 0055 (2) 重组质粒 pET-P54 的梯度稀释 ； 说 明 书 CN 101463396。

30、 B5/9 页 7 0056 (3)以所述的引物及探针对各浓度梯度重组质粒pET-P54进行实时荧光PCR检测， 记录数据生成标准曲线。 0057 实施例 1 非洲猪瘟病毒 DNA 的提取 0058 发明中使用的非洲猪瘟病毒 DNA 为意大利 Institut zooprofilatticsperimenTALE DELLA SARDEGNA惠赠， 按照Roche旋转柱DNA提取试剂盒说 明书提取病毒 DNA。 0059 实施例 2 ASFV P54 基因 PCR 扩增引物与 Taqman 检测引物及探针的设计与合成 0060 根据 GenBank ASFV P54 基因序列 (GenBank。

31、 收录号 ： DQ028323)， 设计、 合成含 BamHI和XhoI酶切位点和保护性碱基的引物， 以扩增P54全序列长度为552bp的片段， 引物 序列如下 ： 0061 pET-P54-1 ： 5 -GCGGATCCAATGGATTCTGAAT-3 ( 画横线处表示引入的 BamHI 酶切 位点 ) 0062 pET-P54-2 ： 5 -AGCTCGAGCAAGGAGTTTTCTA-3 ( 画横线处表示引入的 XhoI 酶切位 点 ) 0063 根据GenBank ASFV P54基因序列(GenBank收录号 ： DQ028323)， 设计、 合成特异性 的引物及 Taqman 探针。

32、， 以检测 P54， 探针荧光基团选取 FAM， 淬灭基团选取 TAMRA， 探针及引 物序列如下 ： 0064 ASFV P54-probe ： 5 -FAM-AGTGCAGGCAAACCAGTCACGGGCA-TAMRA-3 0065 上游引物 ： ASFV P54-1 ： 5 -GCAATGGGCAGAAGTCACT-3 0066 下游引物 ： ASFV P54-2 ： 5 -GTGTAAGGCTCAGTCGGATGA-3 0067 所有引物及探针均委托 invitrogen 公司合成。 0068 实施例 3 ： ASFV P54 目的基因的扩增 ： 0069 PCR 扩增使用的 rTa。

33、q 聚合酶及 dNTP 均为 TaKaRa 产品， PCR 仪是 BIO-RAD 公司出 品。 0070 1PCR 反应混合液的配制 0071 以实施例1中提取的病毒DNA为模板， 以实施例2中设计的P54扩增引物进行PCR 反应， 选取 50L 如下 PCR 反应体系 ： 0072 10Buffer( 含 MgCl2) ： 5L ； 模 板 病 毒 DNA ： 1L ； 上 游 引 物 (25pmol/L) ： 1L ； 下游引物 (25pmol/L) ： 1L ； dNTPs ： 1L(10mmol/L) ； Taq 聚合酶 ： 0.5L(2.5U/ L) ； 双蒸水补齐。 0073 2P。

34、CR 反应程序为 0074 94预变性 3min ； 0075 94变性 30s， 55退火 40s， 72延伸 60s， 共 5 个循环 ； 0076 94变性 30s， 60退火 40s， 72延伸 60s， 共 30 个循环 ； 0077 72延伸 6min ； 0078 4保温 6min。 0079 取 10LPCR 产物进行 1的琼脂糖凝胶电泳， 120V 电泳 25 分 min 紫外检测扩增 产物。 0080 实施例 4 ASFV P54 目的基因重组质粒的构建 说 明 书 CN 101463396 B6/9 页 8 0081 DNA 片段回收使用的玻璃奶回收试剂盒为博大泰克公司产。

35、品， 内切酶、 连接酶为 Fermentas 产品。 0082 将实施例 3 中凝胶电泳获得的目的条带切割下来， 照 DNA 片段玻璃奶回收试剂盒 说明， 纯化回收目的 DNA 片段。将目的基因 P54(552bp) 和载体质粒 pET 28b 分别用限制性 内切酶 BamH I/XhoI 进行双酶切， 酶切反应体系如为 ： 0083 目的基因 P54 的双酶切体系 ： 0084 目的基因 P54 ： 10L ； 0085 BamH I ： 2L ； 0086 XhoI ： 2L ； 0087 Buffer BamH ： 2L ； 0088 双蒸水 ： 4L. 0089 载体质粒 pET 28。

36、b 的双酶切体系 ： 0090 载体质粒 pET 28b ： 4L ； 0091 BamH I ： 2L ； 0092 XhoI ： 2L ； 0093 Buffer BamH ： 2L ； 0094 双蒸水 ： 10L。 0095 将整个酶切体系 37， 水浴作用 3h。 0096 用DNA片段玻璃奶回收试剂盒回收酶切产物， 并以适宜比例连接， 转化TOP10感受 态细胞， 利用 Kan 抗性筛选重组转化体。以 ASFV P54 目的基因扩增引物和 BamH I/Xho I 对重组转化子分别进行进行 PCR 鉴定和酶切鉴定， 并将重组质粒委托华大基因测序。重组 质粒序列含有如 SEQ ID 。

37、NO.1 所示检测序列。 0097 实施例 5 ASFV P54 目的基因重组质粒 pET-P54 的稀释与定量 0098 将重组质粒 pET-P54 依次进行 10 1012稀释， 使用 SHIMADZM 公司 BIO-SPECMIN DNA 分析仪对各稀释度质粒质量进行测定， 并按照如下公式将质粒质量换算成拷贝数 ： 0099 0100 实施例 6 ASFV P54 目的基因的荧光 PCR 检测 0101 荧光PCR试剂是TaKaRa公司的rTaq聚合酶及dNTP， 实时荧光PCR仪是ABI PRISM 7000 型， 荧光 PCR 管和管盖购自 ABI 公司。 0102 1PCR 反应混。

38、合液的配制 0103 以实施例 4 中构建的重组质粒 pET-P54， 非洲猪瘟病毒、 猪传染性胃肠炎病毒、 猪 伪狂犬病毒、 传染性胸膜肺炎病毒、 猪繁殖与呼吸综合征病毒 DNA 为模板， 以实施例 2 中设 计的 P54 荧光引物及探针进行荧光定量 PCR 反应， 选取 50L 如下 PCR 反应体系 ： 0104 10Buffer( 含 MgCl2) ： 5L ； 模板质粒或病毒 DNA ： 1L ； 上游引物 (25pmol/ L) ： 1L ； 下游引物 (25pmol/L) ： 1L ； 探针 (25pmol/L) ： 1L ； dNTPs ： 1L(10mmol/L) ； Taq。

39、 聚合酶 ： 0.5L(2.5U/L) ； 双蒸水补齐。 0105 2PCR 反应程序为 说 明 书 CN 101463396 B7/9 页 9 0106 95预变性 10min ； 0107 94变性 15s， 60退火延伸 1min， 共 40 个循环 ； 0108 退火、 延伸阶段采集数据。 0109 3 结果分析 0110 在 ABI 公司提供的分析软件 SDS version 2.0 的 Analyze 界面下选择 FAM 荧光标 记， TAM 淬灭标记。若样品种含有如 SEQ ID NO.1 所示序列， 荧光 PCR 即可检测出阳性扩增 曲线。 非洲猪瘟病毒DNA、 重组质粒pET。

40、-P54的Rn曲线出现阳性增长， 而以猪传染性胃肠 炎病毒、 猪伪狂犬病毒、 传染性胸膜肺炎病毒、 猪繁殖与呼吸综合征病毒 DNA 为模板的 Rn 曲线及阴性对照均为平的直线， 这表明引物和 TaqMan 探针的特异性很高。从图 1 可见， 扩 增曲线呈现典型的 S 型荧光定量动力学曲线。荧光定量动力学曲线基线平整， 无引物二聚 体产生 ； 对数区较明显， 斜率大且固定 ( 为平行线 )， 为较理想的扩增曲线， 表明本发明建立 的实时荧光定量 PCR 方法检测 ASFVP54 具有较好的准确性。图 1 中曲线部分对应扩增模板 按照右侧端由上至下依次为重组质粒 pET-P54 和两种 ASFV 。

41、P54 阳性样品 DNA， 平的多条直 线为古典猪瘟病毒、 猪传染性胃肠炎病毒、 猪伪狂犬病毒、 传染性胸膜肺炎病毒、 猪繁殖与 呼吸综合征病毒 DNA 为模板的扩增曲线和阴性对照。 0111 实施例 7 ASFV P54 目的基因的荧光定量 PCR 检测标准曲线的绘制 0112 1 标准曲线的生成 0113 选取实施例 5 中 102 108倍稀释的 pET-p54 质粒作为标准品模版， 按照实施例 6 中的条件进行荧光定量 PCR 反应， 同时在荧光定量 PCR 仪中输入相应浓度梯度的质粒拷贝 数。通过这 7 个标准品得到的反应数据， 所有反应信息资料被 ABI PRISM 7000 型荧。

42、光定量 PCR扩增仪收集并储存于其附件电脑(含相应的分析软件)中， 反应结束后该电脑根据阳性 定量标准模板的扩增情况， 以 Ct 值为纵坐标， pET-p54 质粒拷贝数的对数为横坐标， 自动绘 制标准曲线。标准品拷贝数对应各循环阈值 (Ct 值 ) 见下表。 0114 表 1 荧光定量 PCR 各拷贝数对应 Ct 值 0115 0116 2 结果分析 说 明 书 CN 101463396 B8/9 页 10 0117 图 2 为生成标准曲线的质粒模板的荧光定量扩增动力学曲线， 从图中可见， 扩增 曲线呈现典型的 S 型荧光定量动力学曲线。荧光定量动力学曲线基线平整， 无引物二聚 体产生 ； 。

43、对数区较明显， 斜率大且固定 ( 为平行线 )， 为较理想的扩增曲线。图 2 中曲线部 分按照右侧端由上至下模板拷贝数依次为 ： 1.481011， 1.48109， 1.481010， 1.48107， 1.48108， 1.48106， 1.48105， 平的直线为阴性对照。反应体系中含有 1.48105至 1.481011质粒时， 扩增反应 Ct 值与拷贝数对数呈线性关系 ( 图 3)， 得到的标准曲线斜率 为 -3.115， 截距为 47.472， 直线方程为 Y -3.115X+47.472， 其中 Y 代表 Ct 值， X 代表质粒 的模板的拷贝数对数值 ； 一致性系数为 0.99。

44、1。结果显示， 本实验扩增效果好， 结果具有很 高的可靠性。另外， 研究中还发现当反应体系中含有低于 15 个拷贝时， 能够扩增出阳性曲 线， 即本发明中的引物、 探针对荧光定量 PCR 测定 P54 基因有较好的敏感性， 灵敏度可达到 15 个拷贝。 0118 本发明设计使用的引物及探针， 建立了编码非洲猪瘟病毒 P54 蛋白的基因的快速 简便、 特异性强、 灵敏度高的实时荧光定量 PCR 检测体系， 可用于非洲猪瘟病毒核酸的快速 检测， 检测时间仅为数小时， 可直接应用于口岸对进境猪相关制品的诊断和检疫技术， 为无 ASF 国家的进口检疫工作提供了可靠、 有效的技术条件。 0119 本发明。

45、选用 TaqMan 作为探针对非洲猪瘟 P54 基因建立了实时荧光定量 PCR 检测 体系， 通过条件优化和设置标准品， 得到了较理想的标准曲线和检测效果。它克服了传统 PCR 费时、 易污染， 扩增后需电泳检测和每次检测的样品数量少等缺点， 可对样品中的核酸 进行准确的定量检测， 具有简单、 易操作、 结果直观、 敏感性高、 特异性强、 重复性好等优点， 已在生命科学的各个领域都得到了广泛应用， 近年来又被应用于转基因产品的定性与定量 检测。 0120 本发明以ASFV DNA为模板， 设计P54的PCR扩增引物， 构建重组质粒， 并对其定量， 以之作为实时荧光定量 PCR 的模板， 从而获。

46、得标准曲线。另外， 本发明中还收集了古典猪瘟 病毒、 猪传染性胃肠炎病毒、 猪伪狂犬病毒、 传染性胸膜肺炎病毒、 猪繁殖与呼吸综合征病 毒 DNA 来进行交叉反应， 从而确证了荧光定量 PCR 引物的特异性。 0121 建立ASFV P54的快速简便、 灵敏度高、 特异性强的实时荧光定量PCR方法， 灵敏度 可达到 15 个拷贝， 检测时间缩短为几个小时。同时， 建立了标准曲线， 为 P54 基因的定量提 供了可靠依据。 0122 综上所述， 本发明的内容并不局限在上述的实施例中， 相同领域内的有识之士可 以在本发明的技术指导思想之内可以轻易提出其他的实施例， 但这种实施例都包括在本发 明的范。

47、围之内。 0123 序列表 (SEQUENCE LISTING) 0124 天津出入境检验检疫局动植物与食品检测中心 0125 非洲猪瘟病毒荧光定量 PCR 检测试剂及其制备方法和用途 0126 0127 1 0128 PatentIn version 3.5 0129 1 0130 219 说 明 书 CN 101463396 B9/9 页 11 0131 DNA 0132 非洲猪瘟病毒 (Afican Swine Fever Virus) 0133 0134 gene 0135 (1).(219) 0136 1 0137 gcaatgggca gaagtcactc cacaaccagg t。

48、acctctaaa ccggctggag cgactacagc 60 0138 aagtgcaggc aaaccagtca cgggcagacc ggcaacaaac agaccagcaa caaacaaacc 120 0139 agtcacggac aacccagtta cggacagact agtcatggca actggcgggc cagcggccgc 180 0140 acctgcggcc gcgagtgctc atccgactga gccttacac 219 说 明 书 CN 101463396 B1/2 页 12 图 1 图 2 说 明 书 附 图 CN 101463396 B2/2 页 13 图 3 说 明 书 附 图 。