重组家蚕抗菌肽CM4的生产和纯化方法.pdf

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1、(10)授权公告号 CN 101319216 B (45)授权公告日 2012.01.11 CN 101319216 B *CN101319216B* (21)申请号 200810123221.2 (22)申请日 2008.07.10 C12N 15/12(2006.01) C12N 15/70(2006.01) C07K 14/435(2006.01) C07K 1/20(2006.01) C07K 1/14(2006.01) (73)专利权人 南京师范大学 地址 210046 江苏省南京市亚东新城区文苑 路 1 号 (72)发明人 张双全 周良范 李保存 (74)专利代理机构 南京知识律师。

2、事务所 32207 代理人 卢亚丽 (54) 发明名称 重组家蚕抗菌肽 CM4 的生产和纯化方法 (57) 摘要 本发明涉及基因工程领域， 具体涉及家蚕抗 菌肽 CM4 多拷贝表达载体的构建、 表达、 纯化以 及最佳拷贝菌株的筛选等技术。本发明的技术 方案是 ： 应用重组 DNA 技术构建抗菌肽 CM4 的多 拷贝同向串联表达载体 pET32a-nCM4(n 1， 2， 3.8)， 再利用镍柱亲和层析技术纯化多拷贝抗 菌肽 CM4 融合蛋白 ； 利用羟胺切割 TrxA-n CM4 融 合蛋白， 获得抗菌肽CM4单体。 本发明应用基因工 程技术在原核宿主细胞中高效表达了重组抗菌肽 CM4， 表达。

3、效率高， 分离纯化简单， 易放大， 成本低。 这为抗菌肽的大量生产、 研究及应用奠定了基础。 (51)Int.Cl. 审查员 张弛 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利 权利要求书 1 页 说明书 4 页 附图 5 页 CN 101319216 B1/1 页 2 1.一种重组家蚕抗菌肽CM4的生产和纯化方法， 包括以下步骤 ： (1)抗菌肽CM4多拷贝 同向串联表达载体的构建 ： 利用 DNA 重组技术， 将 CM4 基因插入 pET32a(+) 载体中， 构建抗 菌肽 CM4 单拷贝的克隆表达载体 pET32a-CM4 ； 在 pET32a-CM4 的基础上， 利用同尾酶方。

4、法构 建多拷贝的表达载体， 即 pET32a-nCM4， 其中 n 2， 3， 4， 5， 6， 7 或 8 ； 其中， 在串联的 CM4 之 间以及 CM4 与融合蛋白 TrxA 之间引入羟氨切割位点 ； (2) 多拷贝抗菌肽 CM4 的表达和纯化 将各拷贝抗菌肽 CM4 表达载体转入 E.coli BL21(DE3)， 利用终浓度为 1mM 的 IPTG 进 行诱导表达， 离心收集菌体， 超声破碎后再离心收集上清， 将得到的上清过镍柱后将融合蛋 白挂于柱上， 然后将其洗脱， 得到粗蛋白 ； 粗蛋白于 4对 PBS 透析 16h 后， 于冻干机中冻干 得融合蛋白冻干粉 ； 然后融合蛋白冻干粉。

5、于 2M 盐酸羟胺， 45切割， 将切割产物于 4中的 PBS 透析脱盐， 得到单体抗菌肽 CM4。 2. 如权利要求 1 所述的重组家蚕抗菌肽 CM4 的生产和纯化方法， 其特征在于， 步骤 (2) 还包括 ： 将 PBS 透析脱盐的产物再经反相高效液相层析得到纯化的产物。 3.如权利要求1或2所述的重组家蚕抗菌肽CM4的生产和纯化方法， 其特征在于， 所述 的 pET32a-nCM4 是 pET32a-3CM4。 权 利 要 求 书 CN 101319216 B1/4 页 3 重组家蚕抗菌肽 CM4 的生产和纯化方法 技术领域 0001 本发明涉及基因工程领域， 具体涉及家蚕抗菌肽 CM4。

6、 多拷贝表达载体的构建、 表 达、 纯化以及最佳拷贝菌株的筛选等技术。 0002 技术背景 0003 抗菌肽是所有生物天然免疫系统中重要组成部分， 它们组成了高等动物防御外来 生物的第一道的防线， 迄今已有 1000 多种具有抗菌活性的多肽被分离鉴定。抗菌肽的抗菌 谱广， 不但对常见致病细菌和原虫有杀伤作用， 而且能抑制甲型流感病毒、 水泡性口膜炎病 毒和人免疫缺陷症病毒的复制。抗菌肽通过对细菌细胞膜的影响发挥作用， 细菌不容易产 生耐药性而有望成为新一代的肽类抗生素。 0004 抗菌肽CM4是张双全等从中国家蚕(Bombyx mori)(浙农1号苏12号)中分离 得到的。 它是线性的、 具有。

7、螺旋两亲的阳离子肽， 由35个氨基酸组成， 分子量约为3.8KD， 有很强的杀菌能力， 对细菌， 真菌等都有作用。不含甲硫氨酸。从蚕蛹中提取的抗菌肽 CM4 具有较广泛的抗菌和杀伤某些肿瘤细胞的能力， 并且不破坏正常细胞。 0005 由于抗菌肽潜在的重要临床价值， 人们对其产生了极大的兴趣。但提取工艺繁琐 和成本太高使的获得大量天然产物面临巨大难， 因此人们对基因工程技术产生了极大的兴 趣。但是到目前为止， 国内外众多实验室已进行了各种尝试。如 Andersons 和 Hellers 在 昆虫杆状病毒中表达抗菌肽A ； Reichart在酵母体系中表达防御素。 虽然均有不同特点， 但 总的说来。

8、， 所表达抗菌肽的量还不能达到实际医药研发的层次 . 为此， 很多研究者开始采 用串联表达的方式来提高产量。人们仿效 “操纵子” 模型， 将目的基因一个一个串联起来， 形成多个阅读框 (ORF)， 或者仅串联目标基因编码序列， 形成一个 ORF， 置于表达载体启动 子的控制之下， 使目的基因在宿主菌中以串联体方式表达。 这样， 一方面利用串联体的空间 结构有效屏蔽了单体产物的毒性作用， 另一方面也可有效地提高目标蛋白的表达效率。一 般的， 基因串联体有以下几种构建策略 ： (1) 随机定向串联法 ； (2)PCR 扩增串联法 ； (3) 化 学拼接法 ； (4) 同尾酶法 ； (5) 其他方法。

9、 ( 饶贤才， 胡福泉， 基因串联体的构建策略及其表达 模式 J. 医学研究生学报， 2006， 19(6) ： 557-560.) 0006 抗生素的大量应用， 导致耐药菌的产生， 为了解决抗生素耐药性的问题， 研究新的 杀菌药物就很重要。抗菌肽 CM4 有很强的杀菌力， 对细菌， 真菌， 原虫， 肿瘤细胞都有杀伤作 用， 可作为新药， 但天然产量低是个瓶颈。 发明内容 0007 为了解决现有技术的上述不足， 满足大规模生产家蚕抗菌肽 CM4 的需要， 本发明 提供一种低成本的重组家蚕抗菌肽 CM4 的生产和纯化方法。本发明采用了同尾酶法 (Spe I和Nhe I)， 成功构建了抗菌肽CM4。

10、的多拷贝串联表达载体， 并且也成功的从中筛选了表达 量比较高的表达菌株。同单拷贝表达菌株相比， 这一菌株大大提高了 CM4 的表达量， 在不考 虑羟胺切割效率的情况下， 其表达量可以达到 72.86mg/L， 这是已知的抗菌肽 CM4 最高表达 量。 说 明 书 CN 101319216 B2/4 页 4 0008 本发明所采用的技术方案是 ： 一种重组家蚕抗菌肽 CM4 的生产和纯化方法， 包括 以下步骤 ： 0009 (1) 抗菌肽 CM4 多拷贝同向串联表达载体的构建 ： 利用 DNA 重组技术， 将 CM4 基因插入 pET32a(+) 载体中， 构建抗菌肽 CM4 单拷贝的克隆表达载。

11、体 pET32a-CM4 ； 在 pET32a-CM4的基础上， 利用同尾酶方法(本实验中的同尾酶为Spe I和Nhe I)构建多拷贝 的表达载体， 即 pET32a-nCM4(n 2， 3， 4.8) ； 0010 (2) 多拷贝抗菌肽 CM4 的表达和纯化 0011 将各拷贝抗菌肽 CM4 表达载体转入 E.coli BL21(DE3)， 利用终浓度为 1mM 的 IPTG 进行诱导表达， 离心收集菌体， 超声破碎后再离心收集上清， 将得到的上清过镍柱后将融合 蛋白挂于柱上， 然后将其洗脱， 得到粗蛋白。 0012 可将得到的粗蛋白再经对PBS透析和反相高效液相层析(RP-HPLC)得到纯。

12、化的产 物。 0013 在上述的方案中， 为了得到单体 CM4， 在串联体构建时， 抗菌肽 CM4 之间， 以及 CM4 与 TrxA 之间均引入羟胺切割位点， 将得到的 TrxA-3CM4 融合蛋白冻干粉于 2M 盐酸羟胺， 45切割， 将切割产物于 4C 中的 PBS 透析脱盐。 0014 实验表明， 重组抗菌肽 CM4 的活性基本类似于天然的抗菌肽 CM4 活性。 0015 上述所说的多拷贝的表达载体 pET32a-nCM4(n 2， 3， 4.8)， 优选 n 3， 即 pET32a-3CM4. 0016 本发明的有益效果是 ： 0017 1. 筛选出了表达量最高的多拷贝抗菌肽表达菌株。

13、 0018 2. 表达效率高 ： 本工艺采用原核表达系统， 在未优化表达条件下能够达到 72.86mg/L， 在优化表达条件后， 这一产量可以进一步提高。 0019 3. 分离纯化简单， 易操作， 采用化学切割， 生产成本低， 可以大规模生产。 附图说明 0020 图 1 是抗菌肽 CM4 多拷贝同向串联表达载体的构建示意图 0021 图 2 是抗菌肽 CM4 多拷贝同向串联体的双酶切琼脂糖凝胶电泳鉴定 0022 图 3 是 SDS-PAGE 鉴定多拷贝表达载体的诱导表达 0023 图 4 是 western blot 鉴定多抗菌肽 CM4 多拷贝同向串联体表达 0024 图 5 是 SDS-。

14、PAGE 分析各拷贝抗菌肽 CM4 串联体中目的蛋白表达形式 0025 图 6 是 SDS-PAGE 分析及鉴定三拷贝抗菌肽 CM4 融合蛋白的表达与纯化 0026 图 7 是反相高效液相色谱分离纯化抗菌肽 CM4 0027 图 8 是 Tricine/SDS-PAGE 鉴定纯化的抗菌肽 CM4 0028 图 9 是打孔测活鉴定抗菌肽 CM4 的活性 0029 图 10 各拷贝抗菌肽 CM4 串联体表达菌株中上清蛋白中融合蛋白的比例和 CM4 的 相应表达量 具体实施方式 0030 下面结合附图和实施例对本发明进一步说明。 说 明 书 CN 101319216 B3/4 页 5 0031 实施。

15、例 ： 0032 1、 抗菌肽 CM4 多拷贝同向串联表达载体的构建 ： 0033 1.1 根据已知的抗菌肽 CM4 的序列设计如下引物 ： 0034 pET32a-F ： 5 GCGGGATCCAACGGCCGTTGGAAGATCTTTAAG 3 0035 pET32a-R ： 5 GAGAAGCTTTCATTAGCCGTTGATAGTGGCAGCCTGG3 0036 其中 pET32a-F 和 pET32a-R 斜体部分编码的氨基酸序列为羟胺切割位点， 加下划 线部分分别为基因克隆位点 BamH I 和 Hind III。同时， 加边框的序列部分分别为同尾酶 Spe I 和 Nhe I 的。

16、识别序列。 0037 1.2 通过 rPCR 合成 CM4 基因， 以 pET32a-F 和 pET32a-R 为引物， 扩增 CM4 基因。割 胶回收后， 用BamH I和Hind III对其以及pET32a(+)载体(购自Novagen公司)进行双酶 切， 用连接酶连接后构建单拷贝表达载体pET32a-CM41.3以载体pET32a-CM4位于目的基因 之外的 Kpn I 酶切位点和 Spe I 同时对其进行双酶切， 割胶回收大片段 ( 含有一个 CM4 序 列 )， 同样的再以 Kpn I 和 NheI 同时双酶切载体， 回收小片段 ( 同样含有一个 CM4 序列 )， 然后用连接酶连接。

17、大小片段即得到抗菌肽 CM4 双拷贝表达载体 pET32a-2CM4。根据图 1 反 复循环即可构建多拷贝表达载体 pET32a-nCM4(n 1， 2， 3.8)。双酶切鉴定， 见图 2。 0038 2. 多拷贝抗菌肽 CM4 的表达及最佳拷贝菌株的筛选 ： 0039 将构建好的各拷贝抗菌肽CM4表达载体转入E.coli BL21(DE3)， 在25条件下利 用终浓度为 1mM 的 IPTG 进行诱导表达， 5000rpm 离心 15min 收集细胞。 0040 2.1SDS-PAGE 及 western blot 鉴定 0041 将 10l 样品分别加入等量含 - 巯基乙醇的 2 上样缓冲。

18、液， 恒压 100V 进行 12 SDS-PAGE， 考马斯亮蓝 R250 染色显带分析 ( 图 3)。 0042 同样的样品在 12 SDS-PAGE 电泳后， 转移至硝酸纤维素薄膜， 5脱脂奶粉封闭 后， 加入 Anti-His Antibody 孵育过夜， 然后再加 HRP 偶联的羊抗鼠 IgG， 37孵育 1h， TMB 显色 ( 具体参照 Current protocol in immunology unit 8.10). 结果显示各拷贝菌中目 的蛋白均表达 ( 图 4)。 0043 2.2 筛选抗菌肽 CM4 表达量最高拷贝菌株 0044 鉴定目的蛋白表达之后， 对细胞进行超声破碎。

19、， 一方面分别取上清和沉淀以及全 菌跑 SDS-PAGE 电泳， 然后利用 Bandscan software Version 5.0 扫胶软件对 SDS-PAGE 凝 胶图像进行分析。另一方面， 利用 Bradford protein assay 法对上清中的蛋白浓度进行测 定。结合这两方面的数据我们选定抗菌肽 CM4 表达量最高的 BL21(DE3)/pET32-3CM4 作为 理想的表达菌株。( 图 5， 图 10) 0045 3. 最佳拷贝菌株表达产物的纯化 0046 1mM IPTG， 25诱导培养 BL21(DE3)/pET32-3CM4， 离心 (5000rpm， 15min) 。

20、收集菌 体， 超声破碎后再离心 (12000rpm， 4 20min) 收集上清。由于融合蛋白中带有 His.tag， 将 得到的上清过镍柱后可以将融合蛋白挂于柱上。 然后将其洗脱。 将收集的蛋白于4对PBS 透析 16h， 12 SDS-PAGE 检测。蛋白于冻干机中冻干保存以备后续实验。( 图 6) 0047 4. 融合蛋白的切割纯化及生物学活性鉴定 0048 4.1 为了得到单体 CM4， 在串联体构建时抗菌肽 CM4 之间， 以及 CM4 与 TrxA 之间均 说 明 书 CN 101319216 B4/4 页 6 引入了羟胺切割位点。将得到的 TrxA-3CM4 融合蛋白冻干粉于 2。

21、M 盐酸羟胺， 45切割 4h， 然后降低温度和 PH 值终止反应。最后， 将切割产物于 4中的 PBS 透析脱盐。 0049 4.2 将上述透析产物用反相高效液相层析 (RP-HPLC) 进行纯化。所用仪器为 ： Agilent 1100， 分析柱为 ： Kromasil C18(10250mm， 5m)， 实验所用的流动相为 A 液 ( 含 有 15乙腈和 0.1 TFA) 和 B 液 (100乙腈和 0.1 TFA)。 0050 以天然的抗菌肽 CM4 为标准舞， 收集对应峰位的样品， 将其冻干以备用。( 图 7) 0051 4.3 将 RP-HPLC 纯化后的蛋白进行 Tricine/。

22、SDS-PAGE 以及打孔测活鉴定 ( 图 8， 图 9)。 0052 4.4为了进一步鉴定重组抗菌肽CM4和天然抗菌肽CM4的活性大小， 我们做了以下 几种微生物的抗菌肽 CM4 最小抑菌浓度 (MIC) 测定 ： Escherichia coli K12D31， Salmonella spp.， Penicillium chrysogenum， Aspergillus niger。将重组抗菌肽 CM4 样品用含有 0.01乙酸和 0.2 BSA 的无菌水进行连续稀释， 然后将稀释后的样品置于 96 孔板中， 每 一孔接种 100L 培养至对数期的菌， 于 30震荡培养 24h， 然后置于酶标仪下测每孔的 OD600。以上实验重复三次， 算出相应菌对抗菌肽 CM4 的 MIC。实验表明， 重组抗菌肽 CM4 的 活性基本类似于天然的抗菌肽 CM4。 说 明 书 CN 101319216 B1/5 页 7 说 明 书 附 图 CN 101319216 B2/5 页 8 图 2 图 3 图 4 说 明 书 附 图 CN 101319216 B3/5 页 9 图 5 图 6 说 明 书 附 图 CN 101319216 B4/5 页 10 图 7 图 8 图 9 说 明 书 附 图 CN 101319216 B5/5 页 11 图 10 说 明 书 附 图 。