技术领域
本发明涉及神经保护化合物和其用途。
背景技术
工业化国家中的人口由于更高的预期寿命而快速地老龄化，数量不断增加的人群受到神经变性疾病的困扰，成为这些疾病中的全球性问题。
神经变性疾病由神经细胞的逐渐的和渐进的损失引起，导致神经系统功能失调，可能继发于老龄化的各种原因(例如，环境影响、遗传缺陷)。迄今为止已知超过600种神经病学的失调。
神经变性疾病的主要的已知风险因素包括某些遗传多态性和增高的年龄。其他的可能的原因可以包括性别、不良的教育、内分泌状况、氧化压力、炎症、中风、高血压、糖尿病、吸烟、头部外伤、抑郁、感染、肿瘤、维生素缺乏、免疫和新陈代谢状况以及化学物质暴露。由于这些疾病的许多的发病机理仍然是未知的，也可以考虑这些疾病中的环境因素的作用。神经变性疾病的综述可以在，例如＂Neurodegenerative Diseases：Neurobiology，Pathogenesis and Therapeutics＂(M.Flint Beal，Anthony E.Lang，and Albert C.Ludolph；Cambridge University Press；2005)中找到。
为了治疗神经变性疾病，通常采用包含一种或多种活性化合物如吡拉西坦(Piracetam)、尼莫通(Nimotop)、长春西丁(Vinpocetin)、亿智素(Gliatilin)、施普善(Cerebrolysin)、细胞黄素(Cytoflavin)等等的几种药物。本领域已知的化合物具有多种作用方式。例如，一种通过标准化的酶破坏从纯化的动物脑蛋白质产生的基于肽的药物施普善，对来自脊神经后根神经节的神经元发挥神经生长因子样作用、神经营养和神经保护效果。
在现有技术中，几种具有神经保护性质的治疗性物质是已知的。例如，WO01/29067涉及四肽L-丙氨酰-L-谷氨酰基-L-天冬酰-L-脯氨酸，其作为生物学活性化合物刺激神经元的功能活性。对于刺激神经元的功能活性的药物 的制备，提出了L-Ala-L-Glu-L-Asp-L-Pro四肽在药物中的应用。
US2004/102370涉及包含基本四聚肽结构单位Xaa-Xaa-Xaa-Xaa的肽，其中位置1的Xaa代表Glu或Asp，位置2的Xaa代表任何氨基酸，位置3的Xaa代表任何氨基酸，位置4的Xaa代表Glu或Asp。所述肽被用于治疗神经变性疾病和神经损伤，被描述为轴突再生和存活的刺激物。
发明内容
本发明的目的是提供新的化合物，用于神经变性疾病的治疗过程和改善健康人的记忆力。
因而本发明涉及由氨基酸序列DLHW组成的神经保护化合物。
氨基酸残基缩写是本领域中通常使用的那些，即D代表天冬氨酸(Asp)，L代表亮氨酸(Leu)，H代表组氨酸(His)，W代表色氨酸(Trp)。
根据本发明的化合物可以通过影响神经细胞的生存力展现神经保护和神经营养(neurotrophic)性质。这些性质允许提高神经元细胞的生存力。所述化合物可以是蛋白质的一部分、与蛋白质轭合、与其他分子轭合等等，显示了与本领域已知的其他公知的神经保护试剂一样类似的神经保护性质。根据本发明的化合物可以与其他活性成分共同(例如，在一个单独的剂型中)或并行(例如，不同的施用途径和/或位点)地、或作为单独的活性成分来施用。
如果根据本发明的化合物是蛋白质的一部分或者轭合或融合到蛋白质、或轭合到另一个分子(例如，聚糖)，所述化合物必须暴露在所述蛋白质或所述轭合的分子的表面以活化或钝化信号转导级联。根据本发明的肽的可接近性可以通过计算机蛋白质设计或通过实验方法来确定。
本发明的化合物的优选的轭合或融合伴侣是容许在施用之后将化合物靶向个体的身体内的特定位点的分子。融合伴侣可以是，例如，针对个体中某些细胞的抗体。
如在此使用的，术语“神经保护”化合物或“神经保护”组合物是指化合物(或指化合物的混合物)，其保护神经元细胞免于有毒物质，稳定神经元细胞的细胞膜和/或帮助神经元细胞功能的正常化。“神经保护”化合物因而防止神经元细胞在应激状况下生存力或功能的丧失。通过细胞培养分析 (测量神经元细胞的生存力，例如通过MTT分析(Mosmann T(1983)，J.Immuno.Methods65：55-61))，可以测定神经保护活性。
本发明的化合物还展现了神经营养性质和/或神经发生性质(neurogenicproperty)。这意味着本发明的化合物也可以刺激神经元细胞的生长。
由氨基酸形成的本发明化合物的基本结构优选地根据本领域已知的方法化学地合成，例如，通过Merrifield等人开发的方法(Merrifield，R.B.(1963)J.Am.Chem.Soc.85，2149-2154；Solid phase peptide synthsis)。
例如，Merrifield在1963年提出的固相肽合成方法涉及生长的肽链对固体支持物的附着。相应于目标肽的C-末端的氨基酸被共价附着到不溶的聚合支持物(“树脂”)上。具有被保护的α-氨基酸的下一个氨基酸被活化，与树脂结合的氨基酸反应来在树脂上产生氨基保护的二肽。保护氨基的基团被除去，用第三个和随后的被保护的氨基酸来继续链延伸。在目标被保护的肽链建成之后，树脂通过适当的化学方法裂解，从而释放粗制的肽产物到溶液中(对于固相肽合成方法和其他的肽合成方法，还参见Fields，G.B.(ed.)，Solid-Phase Peptide Synthesis in Methods in ENZYMOLOGY，Vol.289，Academic Press，San Diego(1997)；Bodansky，M.，Bodansky，A.，The practiceof peptide synthesis(2nd edn.)，Springer Verlag，Ber-lin(1995)；Pennington，M.W.，Dunn，B.M.(eds)，Peptide Synthesis Protocols，in Methods in MolecularBiology，Vol.35，Humana Press Inc.，Totowa(1994)；Grant，G.A.(ed.)，Synthetic peptides：a user′s guide，W.H.Freemann&Co.，New York(1992))。
在根据本发明的化合物的C-末端的无机阳离子可以是碱金属或碱土金属阳离子，优选的是锂、钠、钾、镁或钙阳离子。
这些无机的阳离子通常被用于制备药学活性物质的盐。
有机阳离子可以是季铵离子。
如果根据本发明的化合物的N-末端包含正电荷，所述电荷可以优选地被等量的无机或有机阴离子补偿。有机阴离子可以是，例如，醋酸根阴离子。
根据本发明的另一个优选的实施方式，烷基残基包含少于30个碳原子、优选少于20个碳原子、更优选少于10个碳原子。
例如，酯化到根据本发明的化合物的脂肪酸可以改变它的物理性质，产生更为疏水性的化合物。
根据本发明的另一个优选的实施方式，式(I)的化合物可以是更高分子量分子的重复单元。所述分子可以包含2、3、4、5、6、10个或更多个根据本发明的化合物。当施用给个体时这种高分子量分子可以展现比单个化合物分子明显更高的效力。
本发明的另一个方面涉及包含根据本发明的化合物和任选地至少一种药学上可接受的赋形剂和/或载体的药物组合物。
根据本发明的化合物可以被配制在药物制剂中，其可以被施用给患者用于预防或治疗脑疾病，特别是神经变性疾病。所述药物制剂可以进一步包含药学上可接受的赋形剂和/或载体。适合的赋形剂和载体是本领域公知的(参见，例如，＂Handbook of Pharmaceutical Excipients＂，5th Edition by RaymondC.Rowe，Paul J.Sheskey，Sian C.Owen(2005)，APhA Publications)。
根据本发明的优选的实施方式，所述组合物可以进一步包含至少一种另外的药物活性成分。
除了本发明的神经保护化合物，本发明的药物制剂可以包含其他的活性成分，其在施用给个体时可以展现类似的性质，或者其可以引起被治疗的患者中的其他反应。
所述至少一种药物活性成分优选地选自四肽L-丙氨酰-L-谷氨酰基-L-天冬酰-L-脯氨酸(参见，例如WO 01/29067)和施普善(参见，例如EP 452299)。
根据本发明，例如，抗氧化剂如维生素可以被认为是其他的活性成分，因为抗氧化剂抑制氧化或抑制氧、氧自由基、氧活性物质所促进的反应，所述氧活性物质包括过氧化物。抗氧化剂，特别是脂类可溶的抗氧化剂，可以被吸收到细胞膜中来中和氧自由基并因而保护膜。在本发明中有用的抗氧化剂优选的是维生素抗氧化剂，其可以选自以下物质：所有形式的维生素A，包括视黄醛和3，4-二脱氢视黄醛；所有形式的胡萝卜素，例如α-胡萝卜素、β-胡萝卜素、γ-胡萝卜素、δ-胡萝卜素；所有形式的维生素C(D-抗坏血酸、L-抗坏血酸)；所有形式的生育酚，例如维生素E(α-生育酚、3，4-二氢-2，5，7，8-四甲基-2-(4，8，12-三甲基三-癸基)-2H-1-苯并吡喃-6-醇)，β-生育酚、γ-生育酚、δ-生育酚、生育醌、生育三烯酚；和容易经历水解成为维生素E的维生素E酯，例如维生素E醋酸酯和维生素E琥珀酸酯；以及药学上可接受的维生素E盐，例如维生素E磷酸盐；维生素A、胡萝卜素、维生素C和维 生素E的前体药物；维生素A、胡萝卜素、维生素C和维生素E的药学上可接受的盐；等等，和其混合物。
根据本发明的另一个优选的实施方式，提供了上述组合物用于静脉内的、肌肉内的、脊椎的、硬膜外的、透皮的、肠胃外的、口服的、肠的、鼻内的或直肠的施用。
取决于施用途径，根据本发明的药物组合物可以被配制为，例如，片剂、胶囊、液体、输液和栓剂(参见，例如，＂Pharmaceutical FormulationDevelopment of Compounds＂by Sven Frokjaer(1999)，CRC；＂Handbook ofPharmaceutical Manufacturing Formulations＂by Sarfaraz K.Niazi(2004)，CRC)。
所述化合物优选地以0.1μg/g到100mg/g、优选1μg/g到80mg/g的量包含在组合物中。
本发明的另一个方面涉及包含具有如下定义的式(I)分子、具有神经保护活性的化合物在制备用于治疗和/或预防神经变性疾病的药物中的用途：
Xn-DLHW-Ym(I)
其中，X和Y代表氨基酸残基，n和m代表0到3的整数。
根据本发明，展现神经保护活性的具有式(I)的所有化合物可以用于制造用于神经变性疾病的治疗和/或预防的药物。
例如，神经保护活性可以通过MTT分析(Mosmann T(1983)，J.Immuno.Methods65：55-61)来测定。MTT分析是细胞生存力测试。在新陈代谢活性细胞(例如，神经元细胞)中，琥珀酸脱氢酶破坏MTT来产生蓝紫色甲(formazan)粒子。用MTT处理的所有活细胞颜色转变成蓝紫色。已经死亡的所有的处理的细胞不能破坏MTT，因而，它们的颜色不改变。颜色改变的速率是甲胸子的数量的量度，可以通过使用平板读取器读取吸光度来测量。生存力被表示为对照的百分比。
如果化合物(I)的C-末端是带负电的，所述电荷可以通过等量的无机或有机阳离子或烷基残基来补偿。
根据本发明的化合物可以通过影响神经细胞的生存力展现神经保护和神经营养性质。这些性质允许提高神经元细胞的生存力。所述化合物可以是蛋白质的一部分、与蛋白质轭合、与其他分子轭合等等，其显示了与本领域 已知的其他公知的神经保护试剂一样类似的神经保护性质。根据本发明的化合物可以与其他活性成分共同(例如，在一个单独的剂型中)或并行(例如，不同的施用途径和/或位点)地、或作为单独的活性成分来施用。
如果根据本发明的化合物是蛋白质的一部分或者轭合或融合到蛋白质、或轭合到另一个分子(例如，聚糖)，所述化合物必须暴露在所述蛋白质或所述轭合的分子的表面以活化或钝化信号转导级联。根据本发明的肽的可接近性可以通过计算机蛋白质设计或通过实验方法来确定。
本发明的化合物的优选的轭合或融合伴侣是容许在施用之后将化合物靶向个体的身体内的特定位点的分子。融合伴侣可以是，例如，针对个体中某些细胞的抗体。
优选地结合到根据本发明的化合物的氨基酸残基可以选自所有已知的天然产生的氨基酸(丙氨酸、精氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、半胱氨酸、谷酰胺、谷氨酸、甘氨酸、组氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸、色氨酸、酪氨酸、缬氨酸)，或当然地，可以选自“非标准”氨基酸如硒代半胱氨酸、吡咯赖氨酸(pyrrolysine)、牛磺酸、GABA(γ-氨基丁酸)、羊毛硫氨酸、1-氨基异丁酸、脱氢丙氨酸、脱氢-氨基丁酸、羟脯氨酸和鸟氨酸。
根据本发明的化合物优选的是非免疫原性的。在此使用的术语“非免疫原性化合物”是指一种分子，特别是一种化合物，其在施用给人类或动物时基本上不激起体内免疫反应。这种分子性质可以通过本领域已知的方法来测定。例如，如果根据本发明的分子向动物(例如，兔、小鼠)的施用激起动物中针对所述分子的抗体的显著提高，所述分子被认为是“免疫原性化合物”，然而如果在所述分子的施用时基本上没有分子特异性抗体在动物或人类中被诱导，它被认为是“非免疫原性的化合物”。重要的是，根据本发明的化合物是非免疫原性的，因为免疫原性化合物通常被免疫系统从身体中清除。
由氨基酸形成的根据本发明的化合物的基本结构优选地根据本领域已知的方法化学地合成，例如，通过Merrifield等人开发的方法(Merrifield，R.B.(1963)J.Am.Chem.Soc.85，2149-2154；solid phase peptide synthesis)合成。
在根据本发明的化合物的C-末端的无机阳离子可以是碱金属或碱土金属阳离子，优选的是锂、钠、钾、镁或钙阳离子。
这些无机的阳离子通常被用于制备药学活性物质的盐。
有机阳离子可以是季铵离子。
如果根据本发明的化合物的N-末端包含正电荷，所述电荷可以优选地被等量的无机或有机阴离子补偿。有机阴离子可以是，例如，醋酸根阴离子。
根据本发明的另一个优选的实施方式，烷基残疾包含少于30个碳原子、优选少于20个碳原子、更优选少于10个碳原子。
例如，酯化到根据本发明的化合物的脂肪酸可以改变它的物理性质，产生更为疏水性的化合物。
根据本发明的另一个优选的实施方式，式(I)的化合物可以是更高分子量分子的重复单元。所述分子可以包含2、3、4、5、6、10个或更多个根据本发明的化合物。当施用给个体时这种高分子量分子可以展现比单个化合物分子明显更高的效力。
根据本发明的优选的实施方式，所述化合物是如上文定义的根据本发明的化合物。
神经变性疾病优选地选自亚历山大病(Alexander disease)、阿耳珀氏病(Alper′s disease)、阿尔茨海默病(Alzheimer disease)、肌萎缩性侧索硬化、共济失调毛细血管扩张、卡纳万病(Canavan disease)、科凯恩综合症(Cockayne syndrome)、皮质基底节变性、克罗伊次费尔特-雅各布病(Creutzfeldt-Jakob disease)、癫痫、亨廷顿病(Huntington disease)、肯尼迪病(Kennedy’s disease)、克拉伯病(Krabbe disease)、路易体痴呆(Lewy bodydementia)、马-约病(Machado-Joseph disease)(脊髓小脑性共济失调3型)、多发性硬化、多系统萎缩症、帕金森病(Parkinson disease)、佩-梅病(Pelizaeus-Merzbacher disease)、皮克氏病(Pick’s disease)、原发性脊髓侧索硬化、雷弗素姆氏病(Refsum’s disease)、桑德霍夫病(Sandhoff disease)、谢耳德氏病(Schilder’s disease)、脊髓小脑性共济失调、进行性核上性麻痹(Steele-Richardson-Olszewski disease)、中风和脊髓痨。
除了这些优选的神经变性疾病，根据本发明的化合物也可以用于治疗其他的脑部失调。
在本发明的优选的实施方式中，本发明的化合物可以用于制造用于改善个体中的学习-记忆能力的药物。本发明的化合物向个体、健康人或患有疾病、优选向患有神经疾病的人的施用，引起这些人的学习-记忆能力的显著的改善。因而，本发明的化合物向健康个体的施用也引起记忆改善。在动物模型中显示这些积极效果的适合的测试可以是Morris Water迷宫测试。
在本发明的一个实施方式中，包含DLHW的肽或蛋白可以被采用作为刺激脑修复过程的药物或用于外伤相关的脑部病变的治疗和预防，包括在颅顶、颅底、多处骨折的破裂之后的脑部病变的治疗，在颅内损伤的情况下的脑部病变的治疗(例如，创伤后的脑震荡、脑创伤和挫伤、蛛网膜下的、硬膜下的和硬膜外的出血)，外伤性休克的治疗和预防，与放射、低温、热和光、气压、电和超高频电流的影响相关的脑部病变的治疗，颅骨折的延迟发作影响的治疗和预防，颅内损伤的延迟发作影响的治疗和预防，放射、外科手术和其他医学介入之后的并发症诱导的延迟发作的脑病变的治疗和预防，
在本发明的另一个实施方式中，根据本发明的化合物可以用作抑制神经营养试剂的毒性影响、刺激脑部修复过程、揭示脑保护活性的药物，用于在中毒之后的脑部病变的治疗和预防，包括在治疗试剂、医学和生物学化合物中毒之后的脑部病变的治疗，非医学来源的试剂的脑部损伤的治疗，药物和非医学物质的中毒诱导的延迟发作的脑部病变的治疗和预防。
在本发明的另一个实施方式中，根据本发明的化合物可以用作具有促智活性并刺激脑部修复过程的药物，用于智力缺陷的治疗和预防。
在本发明的另一个实施方式中，根据本发明的化合物可以用于刺激脑部修复过程和运动活性，用于麻痹失调的治疗和预防，包括半身不遂的治疗和预防，婴儿大脑瘫痪的治疗和预防，其他麻痹综合症(四肢麻痹、截瘫、上肢的双侧瘫痪、下肢的单侧瘫痪)的治疗和预防。
在本发明的另一个实施方式中，根据本发明的化合物可以用作具有脑保护活性、刺激脑部修复过程的药物，用于在染色体异常的情况下，包括唐氏综合症(Down′s syndrome)，脑损伤的治疗和预防。
在本发明的另一个实施方式中，根据本发明的化合物可以用作具有脑保护活性、刺激脑部修复过程的药物，用于在炎症性脑部失调的情况下脑部损伤的治疗和预防，包括在细菌性脑膜炎的情况下(包括AIDS患者中的隐球 菌性脑膜炎的情况)脑部损伤的治疗和预防，在非细菌性脑膜炎的情况下脑部损伤的治疗和预防，在不清楚来源的脑膜炎的情况下脑部损伤的治疗和预防，在脑炎、脊髓炎和脑脊髓炎的情况下(包括AIDS患者中脑部弓形体病的情况)脑部损伤的治疗和预防，用于在颅内脓肿的情况下脑部损伤的治疗和预防，用于在颅内静脉窦的静脉炎和血栓静脉炎的情况下脑部损伤的治疗和预防，用于在颅内脓肿或化脓性感染之后的后遗症的治疗和预防。
在本发明的另一个实施方式中，根据本发明的化合物可以被用作具有脑保护活性和促智活性、刺激脑部修复过程的药物，用于在脑部血管失调的情况下脑部损伤的治疗和预防，包括在蛛网膜下出血的情况下的脑部损伤的治疗和预防，在脑部出血的情况下脑部损伤的治疗和预防，在脑前动脉闭塞和狭窄的情况下脑部损伤的治疗和预防，在脑动脉闭塞的情况下的脑部损伤的治疗和预防，在短暂大脑局部缺血的情况下脑部损伤的治疗和预防，在其他脑部血管失调(急性脑部血管失调、脑动脉粥样硬化和其他一般化的脑部血管失调、高血压脑病、脑动脉瘤、脑动脉炎和颅内静脉窦的非化脓性血栓形成)的情况下的脑部损伤的治疗和预防。
在本发明的另一个实施方式中，根据本发明的化合物可以用作具有脑部保护和促智活性、刺激脑部修复过程的药物，用于酒毒性精神病的治疗和预防，包括戒断综合征的震颤性谵妄的治疗和预防，酒精遗忘综合症和其他酒毒性痴呆失调的预防和治疗，酒精中毒的治疗和预防，偏执类型的酒毒性偏狂和酒毒性精神病的治疗和预防。
在本发明的另一个实施方式中，根据本发明的化合物可以用作具有脑部保护和促智活性、刺激脑部修复过程的药物，用于在酒精中毒的情况下脑部损伤的治疗和预防。
在本发明的另一个实施方式中，根据本发明的化合物可以用作抑制神经营养试剂的毒性影响、具有神经保护和促智活性的药物，用于药物诱导的精神病的治疗和预防，包括药物戒断综合征的治疗和预防，药物诱导的偏执和/或幻觉失调的治疗和预防，医药试剂的病理中毒的治疗和预防，其他药物诱导的精神失调(精神错乱、痴呆、遗忘综合症和器质性情感征候群)的治疗和预防。
在本发明的另一个实施方式中，根据本发明的化合物可以用作抑制神经 营养试剂的毒性效果并具有脑部保护活性的药物，用于药物成瘾的治疗和预防，包括对鸦片类试剂的成瘾的治疗和预防，对巴比妥酸盐、镇静剂和镇定剂的成瘾的治疗和预防，古柯碱成瘾的治疗和预防，对大麻和其衍生物的成瘾的治疗和预防，对安非他明(amphetamine)和神经刺激试剂的成瘾的治疗和预防，对致幻剂的成瘾的治疗和预防，由没有药物成瘾性的药物滥用(酒精、烟草、大麻、迷幻剂、鸦片样物质、古柯碱、神经刺激试剂、抗抑郁剂的滥用)引起的脑部损伤的治疗和预防。
在本发明的另一个实施方式中，根据本发明的化合物可以作为用于精神性症状和综合征的治疗和预防的试剂，包括精神性生理学损伤的治疗和预防，其他精神性症状和综合症(口吃和障碍、精神性的厌食、重复刻板动作、非器质性睡眠失调(inorganic sleep disorder)、精神性饮食失调、遗尿、精神性疼痛)的治疗和预防，急性应激反应的治疗和预防，由心理学指示诱导的反应的治疗和预防。
在本发明的另一个实施方式中，根据本发明的化合物可以用作用于非器质性精神病的治疗和预防的试剂，包括精神分裂症(Schizophrenie disorder)的治疗和预防，情感性精神病的治疗和预防，偏执状况的治疗和预防，其他非器质性精神病(抑郁和焦虑型的精神病、反应性精神混乱、急性偏执反应、精神性偏执性精神病)和未分化精神病，包括在AIDS患者中脑部损伤诱导的精神病的治疗和预防，婴儿的精神病包括自闭症和崩解性精神病的治疗和预防，
在本发明的另一个实施方式中，根据本发明的化合物可以用作刺激脑部修复过程并具有脑保护性和促智活性的药物，用于在其他脑部失调的情况下的脑部损伤的治疗和预防，包括在脑部囊肿的情况下的脑部损伤的治疗和预防，低氧脑部损伤的治疗和预防，在颅内高压的情况下的脑部损伤的治疗和预防，在脑病的情况下的脑部损伤的治疗和预防。
在本发明的另一个实施方式中，根据本发明的化合物可以用作具有脑部保护和促智活性、刺激脑部修复过程和运动活性的药物，用于在各种脑部失调的情况下的症状和综合症的治疗和预防，包括认知失调、记忆力和注意力(artention)、损伤(例如，在遗忘疾病、智力缺陷、非器质性精神病等等的情况下)的预防和治疗，失语症和精神性运动不能(例如，在健忘疾病、非 器质性精神病、由于染色体异常导致的脑部损伤等等的情况下)的治疗和预防，情感失调(例如，在非器质性精神病、脱髓鞘脑部失调(demyelinisingcerebral disorder)等等的情况下)的治疗和预防，精神病综合征(例如，在过渡的器质性精神病状况、药物诱导的精神病、药物成瘾等等的情况下)的治疗和预防，虚弱-抑郁综合症(例如，在非器质性精神病、由于染色体异常导致的脑部损伤等等的情况下)的治疗和预防，精神错乱综合征(例如，在药物诱导的精神病和药物成瘾、非器质性精神病等等的情况下)的治疗和预防，睡眠失调(例如，在脑部肿瘤、过渡的器质性精神病状况等等的情况下)的治疗和预防，用于脑部病灶综合征(病灶病理症状)(例如，在由于外科手术或其他医学介入的并发症引起的脑部损伤、脱髓鞘脑部失调等等的情况下)的治疗和预防，运动失调的综合症(例如，在脑部肿瘤、由于中毒引起的脑部损伤等等的情况下)的治疗和预防，周围神经病、优选的糖尿病性神经病的治疗和预防。
根据本发明的优选的实施方式，所述药物进一步包含如上文定义的药学上可接受的赋形剂或载体。
根据本发明的另一个优选的实施方式，所述组合物进一步包含至少一种其他的药学上的活性成分。
所述至少一种药学的活性成分优选地选自四肽L-丙氨酰-L-谷氨酰基-L-天冬酰-L-脯氨酸和脑溶胞素。
药物优选地被提供用于静脉内、肌肉内、脊椎、硬膜外、透皮、胃肠外、口服、肠或直肠的施用。
根据本发明的优选的实施方式，所述药物包含数量为0.1μg/g到100mg/g，优选地1μg/g到80mg/g的化合物。
特别优选的是使用具有氨基酸序列DLHW的四肽作为化合物。
本发明的另一个方面涉及一种方法，用于预防个体中神经变性疾病的突发，和用于治疗患有神经变性疾病的个体，所述方法包括施用药物制剂或有效量的根据本发明的化合物。
在此使用的术语化合物的“有效量”将取决于施用途径和要暴露于所述化合物的个体的身体状况以及其他因素。有效量的测定的方法是技术人员已知的。
神经变性疾病优选地选自亚历山大病、阿耳珀氏病、阿尔茨海默病、肌萎缩性侧索硬化、共济失调毛细血管扩张、卡纳万病、科凯恩综合症、皮质基底节变性、克罗伊次费尔特-雅各布病、癫痫、亨廷顿病、肯尼迪病、克拉伯病、路易体痴呆、马-约病(脊髓小脑性共济失调3型)、多发性硬化、多系统萎缩症、帕金森病、佩-梅病、皮克氏病、原发性脊髓侧索硬化、雷弗素姆氏病、桑德霍夫病、谢耳德氏病、脊髓小脑性共济失调、进行性核上性麻痹、外周神经病、糖尿病性神经病、中风和脊髓痨。
根据本发明的优选的实施方式，所述化合物以0.1μg/kg到20mg/kg体重、优选以0.5μg/kg到10mg/kg体重的剂量施用给所述个体。
本发明的另一个方面涉及培养神经元细胞的方法，包括步骤：
-提供神经元细胞培养物，
-向所述培养物添加根据本发明的化合物，和
-温育所述化合物/培养物混合物。
根据本发明的化合物也可以被有益地用于体外目的，例如用于神经元细胞的培养。所述化合物被简单地添加到本领域已知的培养基中。
所述化合物优选地以5μg/ml到2mg/ml、优选以10μg/ml到1mg/ml、更优选以15μg/ml到900μg/ml培养基的量包含在所述培养物中。
根据本发明的化合物展现了对神经元细胞的神经保护性效果，特别是当它以上述浓度被包含在培养基中时。
附图说明
通过以下附图和实施例进一步说明本发明，并非将本发明限制于此。
附图1显示了在使用MTT方法的2％低血清分析中获得的、与在1DIV(体外第一天)添加的测试基质(test matrix)相比较的、DLHW对皮层神经元的生存力的影响。结果显示数据的平均值和标准误差平均值(SEM)，单位是％(对照是100％)。数值代表来自使用两个相同的96孔平板在两天中进行的两个独立实验的平均值和SEM，单位为％(100％＝对照)(对于每个测试的项目浓度和对于对照，n≥8)。未病变的对照由0代表，未接受任何测试项目。
具体实施方式
实施例：
实施例1：
进行了利用2％低血清分析的本实施例来评估由氨基酸序列组成的肽DLHW的神经保护潜力。还对测试基质评估了影响(6.18mg/ml NaCl和0.35mg/ml KCl)。
1.1.测试和参考项目
1.1.1.测试项目：
肽分别由氨基酸序列DLHW、NIVTPR、HGFLPR和NMVPFPR组成，测试基质(6.18mg/ml NaCl和0.35mg/ml KCl)作为参考。
1.1.2.分析条件：
分析：2％低血清细胞培养分析
细胞来源：来自9天龄鸡胚胎(Lohman Brown杂交种)的端脑神经元
营养培养基：具有1g葡萄糖/l，2％FCS，0.01％硫酸庆大霉素和2mML-谷氨酰胺的EMEM
组大小：进行4个独立实验
(对于DLHW、NIVTPR、HGFLPR、NMVPFPR和测试基质n＝8)
效果的评估：MTT生存力分析；使用平板读取器测量吸光度(OD)
一个单独的实验的持续时间：8天
1.2.实验的发现
这个实施例描述了由氨基酸序列DLHW、NIVTPR、HGFLPR和NMVPFPR组成的肽在利用鸡皮层神经元的体外的批准的2％低血清分析中的效果。还对测试基质评估了效果(6.18mg/ml NaCl和0.35mg/ml KCl)。
从结果可以得出的一般的结论是：
获得的结果显示了剂量反应分布型、明显促进神经元生存力、相对于未处理的对照达到了超过300％的最大效果高度。这另外表明了，所选的分析能够无疑地评估剂量反应分布型。
虽然测试基质不能将神经元生存力提高到未处理的对照的程度之上，但是肽DLHW明显地展现了神经保护效果。
在这个实施例中，DLHW被测试为是在相对低的浓度下实现高的效果量 超过对照330％)的有效的化合物。当前实施例的结果显示了这种小的肽DLHW或包含所述肽的化合物显著地和有效地促进神经元生存力的提高。与之相比，包含另一个氨基酸序列的肽没有显示这种效果。
2.测试的物质
2.1.实验的目的
进行实验来评定由氨基酸序列DLHW、NIVTPR、HGFLPR、HGFLPR、NMVPFPR组成的肽和测试基质的神经保护效果。
2.2.测试和参考项目
2.2.1.测试项目：
2.2.1.1.试验项目(DLHW)：
稀释的媒介物：测试基质(6.18mg/ml NaCl和0.35mg/ml KCl)。
应用方式：在第1天一次
应用时期：整个实验，即，8天，从第1天开始
浓度：5.6、11.25、22.5、45、90、180、360和720μg/ml
施用体积：0.625、1.25、2.5、5、10、20、40、80μl/ml培养基
2.2.1.2.试验项目(NIVTPR)：
稀释的媒介物：测试基质(6.18mg/ml NaCl和0.35mg/ml KCl)。
应用方式：在第1天一次
应用时期：整个实验，即，8天，从第1天开始
浓度：5.6、11.25、22.5、45、90、180、360和720μg/ml
施用体积：0.625、1.25、2.5、5、10、20、40、80μl/ml培养基
2.2.1.3.试验项目(HGFLPR)：
稀释的媒介物：测试基质(6.18mg/ml NaCl和0.35mg/ml KCl)。
应用方式：在第1天一次
应用时期：整个实验，即，8天，从第1天开始
浓度：5.6、11.25、22.5、45、90、180、360和720μg/ml
施用体积：0.625、1.25、2.5、5、10、20、40、80μl/ml培养基
2.2.1.4.试验项目(NMVPFPR)：
稀释的媒介物：测试基质(6.18mg/ml NaCl和0.35mg/ml KCl)。
应用方式：在第1天一次
应用时期：整个实验，即，8天，从第1天开始
浓度：5.6、11.25、22.5、45、90、180、360和720μg/ml
施用体积：0.625、1.25、2.5、5、10、20、40、80μl/ml培养基
2.2.1.5.试验项目(测试基质)：
名称，盐浓度：测试基质或空白(6.18mg/ml NaCl和0.35mg/ml KCl)
稀释的媒介物：没有媒介物，将使用即可使用的注射溶液
应用方式：在第1天一次
应用时期：整个实验，即，8天，从第1天开始
浓度：5.6、11.25、22.5、45、90、180、360和720μg/ml
施用体积：0.625、1.25、2.5、5、10、20、40、80μl/ml培养基
2.3.分析条件
细胞培养分析：2％低血清分析
细胞来源：来自9天龄鸡胚胎(Lohman Brown杂交种)的端脑神经元
营养培养基：具有1g葡萄糖/1，2％FCS，0.01％硫酸庆大霉素和2mM L-谷氨酰胺的EMEM
组大小：进行4个独立实验(对于DLHW和测试基质n＝8；对于对照n＝224)
效果的评估：MTT生存力分析；用平板读取器测量的吸光度(OD)
一个单独的实验的持续时间：8天
3.方法
在当前实施例中使用的分析方法是利用分离的禽类皮层神经元的2％低血清分析。利用这种体外细胞培养物分析，化合物的神经保护性和/或神经营养潜力可以通过测定培养物中不同的时间周期之后活神经元的生存力来评估。测量活神经元的数量的方法是MTT分析。
3.1.测试项目
使用批准的禽类细胞培养模型系统研究了DLHW、NIVTPR、HGFLPR、NMVPFPR和测试基质(6.18mg/ml NaCl和0.35mg/ml KCl)的生物活性。
3.1.1.肽贮备溶液的制备
要测试的肽溶于测试基质(6.18mg/ml NaCl和0.35mg/ml KCl)中。
3.2.对照
为了对照目的，使用了未用DLHW、NIVTPR、HGFLPR和NMVPFPR处理的神经元。
3.3.分析过程的目标
在这个实施例中，研究含有氨基酸序列DLHW、NIVTPR、HGFLPR和NMVPFPR的肽来评估它们提高分离的皮层神经元的神经元生存力的可能的活性。肽以4.5mg/ml的浓度应用。
3.4.组大小/浓度
向分离的神经细胞中，添加肽或测试基质一次，即，在第一天。包含剂量范围的8个浓度是5.6、11.25、22.5、45、90、180、360和720μg/ml培养基之间；应用的体积是0.625、1.25、2.5、5、10、20、40、80μl/ml培养基。
4.评估
4.1.MTT生存力分析
培养物的神经元的生存力通过使用平板读取器(570nm)的MTT分析来测定。MTT分析是仅测量活细胞中的线粒体脱氢酶活性的敏感性分析。根据Mosmann，J.Immunol.Meth，1983，55-63所描述的方法来进行分析。这项分析基于黄色MTT(3-(4，5-二甲基噻唑-2-基)-2，5-二苯基四唑溴化物)通过线粒体脱氢酶(琥珀酸脱氢酶)还原成深蓝色甲晶体。由于这个反应仅在活细胞中被催化，该分析可以用于细胞生存力的定量。对于细胞生存力的测定，MTT溶液以0.5mg/ml的终浓度添加到每个反应孔中。在2h之后，查看含有MTT的培养基。使用3％SDS裂解细胞，甲晶体溶于异丙醇/HCl中。为了估计光密度，在波长570nm使用平板读取器(Anthos HT II)。神经元生存力用光密度(OD)表示。
5.统计
为了评估处理的和未处理的神经元之间的差异，使用了students-t测试。当p≤0.05时差异被认为是显著的。
6.结果
这个实例描述了含有氨基酸序列DLHW的肽的体外的神经营养/神经保护性效果。另外，使用皮层的小鸡神经元在2％低血清分析中测试了测试基质。
如所提及的对DLHW、NIVTPR、HGFLPR和NMVPFPR评估了效果。另外，在这个分析中测试了测试基质(6.18mg/ml NaCl和0.35mg/ml KCl)。对于每种浓度的肽和测试基质的描述性统计，如平均值、标准偏差和标准误差平均值(s.e.m.)在表2和3中以及在附图1中显示。表4概述了使用students-t测试获得的p值，统计学地评估了未处理的对照和8种浓度(5.6μg直到720μg/ml)的DLHW和测试基质的每一种之间的差异。
表2：在使用MTT方法的2％低血清分析中获得的、在1DIV添加的分析的肽和测试基质对皮层神经元的生存力的影响。结果显示为光密度(OD)的平均值、标准偏差和标准误差平均值(SEM)：
平均值
05.611.2522.54590180360720μg/mlDLHW0.0630.0620.0620.0850.1360.2170.2720.2540.257NIVTPR0.0690.0680.0690.0680.0680.0660.0640.0600.058HGFLPR0.0680.0680.0690.0690.0670.0700.0670.0640.058NMVPFPR0.0620.0610.0600.0570.0570.0560.0550.0550.057测试基质0.0820.0820.0850.0850.0880.0900.0880.0820.069
标准偏差
05.611.2522.54590180360720μg/mlDLHW0.0050.0040.0060.0310.0700.0680.0300.0150.038NIVTPR0.0040.0030.0050.0050.0040.0040.0040.0050.003HGFLPR0.0050.0040.0040.0050.0040.0050.0040.0050.007NMVPFPR0.0040.0030.0040.0040.0030.0040.0020.0020.003测试基质0.0140.0150.0160.0160.0190.0170.0150.0150.010
sem
05.611.2522.54590180360720μg/mlDLHW0.0010.0010.0020.0110.0250.0240.0110.0050.013NIVTPR0.0010.0010.0020.0020.0020.0010.0010.0020.001HGFLPR0.0010.0010.0010.0020.0020.0020.0020.0020.003NMVPFPR0.0010.0010.0010.0010.0010.0010.0010.0010.001测试基质0.0040.0050.0060.0060.0070.0060.0050.0050.004
[0181] 数值代表来自使用两个相同的96孔平板在四天中进行的四个独立实验的OD的平均值、标准偏差和SEM(对于每种肽和测试基质浓度以及对于对照，n≥8)。未病变的对照由0代表，未接受肽和测试基质。
表3：在使用MTT方法的2％低血清分析中获得的、在1DIV添加的分析的肽和测试基质对皮层神经元的生存力的影响。结果显示数据的平均值、标准偏差和SEM，单位是％(对照是100％；对于DLHW还参见附图1)：
平均值
05.611.2522.54590180360720μg/mlDLHW100.0097.8597.68134.51213.12341.82429.54401.23406.75NIVTPR100.0098.92100.3298.7098.7595.1292.2886.6083.13HGFLPR100.00100.07101.16101.1698.95102.2599.1494.5385.71NMVPFPR100.0098.0695.7790.7690.5589.5487.7687.7991.24测试基质100.0099.94103.17103.51107.12109.78106.8799.3485.08
标准偏差
05.611.2522.54590180360720μg/mlDLHW5.804.128.8547.75107.35102.9545.6525.0456.18NIVTPR5.423.706.436.756.374.916.437.463.32HGFLPR7.014.975.086.525.675.455.716.4910.29NMVPFPR5.445.795.775.123.995.002.972.414.92测试基质10.4410.4610.9312.9915.6314.2411.0711.4412.54
sem
05.611.2522.54590180360720μg/mlDLHW1.451.463.1316.8837.9636.4016.148.8519.86NIVTPR1.361.312.272.392.251.732.272.641.17HGFLPR1.751.761.802.312.001.932.022.293.64NMVPFPR1.362.052.041.811.411.771.050.851.74测试基质2.613.703.874.595.535.033.924.044.43
数值代表来自使用两个相同的96孔平板在四天中进行的四个独立实验的生存力数据的平均值、标准偏差和SEM，单位是％(对于每种肽和测试基质浓度以及对于对照，n≥8)。未病变的对照由0代表，未接受任何肽和 测试基质。
表4：统计分析的结果——p值：在表格的上部，显示了展示未处理的对照和不同浓度的肽和测试基质之间的差异的p值。
差异与浓度和对照
5.611.2522.54590180360720μg/mlDLHW0.19454490.4849330.08026170.02050370.00029191.672E-074.603E-091.1428E-06测试基质0.98785190.44149040.47121040.23918770.09340330.12388250.87610680.01191905
当p≤0.05时，不同的值之间的差异被认为是显著的。用于差异计算的值获自使用两个相同的96孔平板在四天中进行的四个独立实验(对于DLHW和测试基质浓度以及对于对照，n≥8)。未病变的对照未接受任何肽和测试基质。
虽然表2中的结果显示为光密度(OD)的平均值、标准偏差和s.e.m.，表3说明了相对于未处理的对照以百分比表示的结果，未处理的对照的平均值作为100％。附图1相应于表3中对DLHW显示的结果。
附图1显示了与测试基质相比有效的肽DLHW的效果。使用360μg/ml的DLHW可以获得430％的最大效果，但是即使在更高的浓度下，效果仍处在对照水平以上300％的范围内。与之相比，分析的另一种肽没有显示任何显著的效果。
在表5中，列出了使用DLHW和测试基质获得的主要效果。再一次概括了以上描述的结果。
表5：用MTT方法获得的、在1DIV添加的肽和测试基质对皮层神经元的生存力的影响的概述。
名称有效剂量范围最有效浓度最大效果，％超过对照的效果DLHW45-702μg/ml180μg/ml430％430％NIVTPR----------------------------HGFLPR----------------------------NMVPFPR----------------------------测试基质----------------------------
7.实验数据的概述
概括在2％低血清分析中获得的DLHW的可能的神经营养/神经保护性效果，表明的是，与未处理的对照相比，DLHW显著地提高神经元的生存力。此外，清楚地显示了，具有不同于DLHW的另一个氨基酸序列的肽没有展现神经营养和神经保护性质。