技术领域
本发明是关于植物药有效成分的提取分离方法，具体说是关于中药蒲黄 中的有效成分的提取分离方法。
背景技术
蒲黄是一种常用中药，对于蒲黄的研究已有许多文献报道，其中对蒲黄 化学成分的研究，也有一些文献记载。但这些文献记载的研究内容，并非以 探讨蒲黄中主要有效成分香蒲新苷的提取分离方法为主要目的。由于香蒲新 苷是蒲黄的主要有效成分之一，常将香蒲新苷作为蒲黄药材和含蒲黄药物的 质量控制指标，为此，实际工作中需要提取分离纯度高的香蒲新苷作为对照 品。特别是在含蒲黄的药物开发研究当中，如何简化蒲黄有效成分香蒲新苷 的提取工艺，提高提取分离纯度，是制剂工艺研究过程的关键环节之一。目 前一些提取分离方法的提取工艺路线复杂，香蒲新苷收率较低，不适合于工 业化大规模生产，且因为难以进一步提高香蒲新苷的纯度，使其用作质量控 制用对照品受到一定限制。
发明内容
本发明的目的在于提供一种提取分离蒲黄中有效成分的新工艺，即提取 分离蒲黄有效成分香蒲新苷的新工艺。
本发明的工艺方法步骤如下：
A：取蒲黄药材醇提得稠膏，即总提取物；
B：总提取物硅胶拌样后，另取硅胶活化、干柱层析，以5～10∶1～3∶1 的乙酸乙酯-甲醇-水混合溶剂为洗脱剂或展开剂，分段提取得8～12份，各 份用甲醇、乙醇或丙酮洗脱，洗脱液减压回收溶剂后，得各洗脱物；合并其 中第5份和第6份得到香蒲新苷粗品；
C：以硅胶为吸附剂，香蒲新苷粗品用甲醇溶解后，干法上样，以乙酸 乙酯-甲醇或乙酸乙酯-乙醇混合溶剂为洗脱液进行梯度洗脱，梯度为 100∶0-60∶40，分段提取得8～12份，减压浓缩，把其中第8-10份浓缩液合 并，减压抽干得到香蒲新苷精品；
D：取香蒲新苷精品，加入甲醇或乙醇至溶解，浸泡、湿法装柱，色谱 柱的径高比为3∶20-27，吸附剂为葡聚糖凝胶LH-20，用量为被分离样品量 的18-30倍，用甲醇或乙醇进行洗脱，分段收集洗脱液，共收集12～15份； 把其中第8～10份分别浓缩，加入浓缩液20～25倍量的乙酸乙酯，静置沉 淀，过滤，沉淀用乙酸乙酯洗涤后，干燥，即得到香蒲新苷纯品。
上述方法中步骤A的方法为：取蒲黄药材25重量份，加入浓度为60～ 90％的乙醇150～250体积份，浸泡24～48小时后，加热回流提取0.5～1.5 小时，静置1～2小时，吸取上清液；药渣用同样的方法先后提取2～4次， 提取药液合并，药渣弃去；将上清液和提取液合并，水浴加热，水浴温度60～ 90℃，减压浓缩至浓缩液无醇味，得稠膏2.5～3.0重量份，即总提取物2.5～ 3.0重量份。
上述方法中步骤A的优选方法为：取蒲黄药材25重量份，加入浓度为 70％的乙醇200体积份，浸泡24小时后，加热回流提取1小时，静置1小时， 吸取上清液。药渣用同样的方法先后提取3次，提取药液合并，药渣弃去； 将上清液与提取液合并，水浴加热，水浴温度80℃，减压浓缩至浓缩液至无 醇味，得稠膏即蒲黄总提取物2.8重量份。
上述方法中步骤B的方法为：取稠膏50～60重量份，拌入150～180重 量份的100～200目的硅胶，干燥，得到拌样硅胶。另取1500～2000重量份 的100～200目的硅胶，100～105℃活化1.5～2小时后，干法装柱；将拌样 硅胶加入柱中，以7～9∶1～3∶1的乙酸乙酯-甲醇-水混合溶剂2000～3000 体积份为洗脱剂或展开剂，进行干柱层析，放干溶剂，进行等分切割或按色 带切割，共得到8～12份；各份用1500～2000体积份的甲醇、乙醇或丙酮 洗脱。洗脱液减压回收溶剂后，得各洗脱物。收集其中第5份和第6份合并， 得到香蒲新苷粗品7.5-8重量份；
上述方法中步骤B的优选方法为：取稠膏50重量份，拌入150重量份， 160～200目粗硅胶，自然干燥，得到拌样硅胶；另取160～200目硅胶1500 重量份，100～105℃活化1.5小时后，干法装柱，径高比为1∶5；将拌样硅 胶加入柱中，以8∶2∶1乙酸乙酯-甲醇-水混合溶剂2500体积份为展开剂， 下行法展开，进行干柱层析，待展开剂前沿到达色谱柱底部时，放干溶剂， 等分切割，共得到10份。各份用温度为80℃的70％的热乙醇1500体积份洗 脱；洗脱液减压回收溶剂后，得各洗脱物；其中第5份和第6份合并，得到 香蒲新苷粗品7.9重量份。
上述方法中步骤C的方法为：吸附剂为100～150重量份的200～300目 的硅胶，香蒲新苷粗品7.5～8.0重量份用甲醇100～200体积份溶解后，加 到3～5倍量的160～200目硅胶中，拌匀，挥干溶剂，干法上样；洗脱剂依 次采用不同比例的乙酸乙酯-甲醇或乙酸乙酯-无水乙醇混合溶剂(乙酸乙 酯、甲醇、乙醇均为分析纯)进行梯度洗脱；洗脱梯度为100∶0、95∶5、90∶10、 85∶15、80∶20、75∶25、70∶30、65∶35、60∶40、55∶45、50∶50、45∶55、40∶60； 每个梯度洗脱剂用量为100～300体积份，洗脱流速为每分钟2～6体积份， 分份收集，每份100～150体积份，减压浓缩至10～20体积份；把其中第8～ 10份浓缩液合并，减压抽干得到香蒲新苷精品2.5-3.0重量份；
上述方法中步骤C的优选方法为：吸附剂为100重量份的200～300目 的硅胶H，香蒲新苷粗品7.9重量份用甲醇100体积份溶解后，加到4倍量 的160～200目硅胶中，拌匀，挥干溶剂，干法上样；洗脱剂依次采用不同 比例的乙酸乙酯-无水乙醇混合溶剂进行梯度洗脱；最佳洗脱梯度为100∶0、 95∶5、90∶10、85∶15、80∶20、75∶25、70∶30、65∶35、60∶40、55∶45、50∶50、 45∶55、40∶60；每个梯度洗脱剂用量为200体积份，洗脱流速为每分钟4体 积份，洗脱剂总用量为2600体积份，分份收集，每份100体积份，减压浓 缩至10体积份；把其中第8～10份浓缩液合并，减压抽干得到香蒲新苷精 品2.80重量份；
上述方法中步骤D的方法为：香蒲新苷精品2.50～3.00重量份，加30～ 60体积份甲醇或乙醇至溶解，浸泡20-30小时后，湿法装柱：葡聚糖凝胶 LH-20 50～80重量份，色谱柱径高比为1∶20-26，用甲醇或乙醇60～150体 积份进行洗脱，收集洗脱液，每份5～10体积份，共收集12～15份。把其 中第6～9份分别浓缩至2～3体积份后，加入20～25倍量乙酸乙酯，静置 0.5～2小时，沉淀，过滤，沉淀用15-30体积份乙酸乙酯洗涤后，自然干燥， 即得到香蒲新苷纯品1.80～2.80重量份。
上述方法中步骤D的优选方法为：香蒲新苷精品2.80重量份，加50体 积份甲醇或乙醇至溶解，浸泡24小时后，湿法装柱：葡聚糖凝胶LH-20 50 重量份，色谱柱径高比为1∶20，用甲醇或乙醇150体积份进行洗脱，收集洗 脱液，每份5体积份，共收集15份。把其中第6～9份分别浓缩至2体积份 后，加入20倍量乙酸乙酯，静置0.5～2小时，沉淀，过滤，沉淀用20体 积份乙酸乙酯洗涤后，自然干燥，即得到香蒲新苷纯品2.70重量份。
采用本方法提取蒲黄有效成分香蒲新苷，提取工艺路线简单，提取分离 纯度提高，香蒲新苷收率提高，适合于工业化大规模生产。 下面实验例用于进一步说明但不限于本发明。
实验例1：香蒲新苷的纯度检查
用高效液相色谱法检查纯度。仪器：美国惠普公司HP1050高效液相色 谱仪，二极管阵列检测器(HP1050 DAD)，HP1050/WIN-3D化学工作站，Waters 公司25μL可调进样器。色谱柱：Bondclone 10 C18柱，3.9mm×300mm(美 国Phenomenex公司)。流动相：乙腈-水(15～20∶85～80)；流速：1.0～ 1.2mL/min；柱温：室温；检测波长：254nm；衰减：8；进样量：20μg，保 留时间(RT)：香蒲新苷为6～7min，色谱图记录时间：20min。归一化法测 定纯度，香蒲新苷纯品的纯度为98.74％，大于98.00％，可作为对照品使用。 实验例2：香蒲新苷的结构测定
熔点用Boetius THMK05型显微熔点测定仪测定；紫外(UV)光谱用日 本岛津U-2000型紫外分光光度计测定；红外光谱(IR)用Nicolet FTIR-5DX 型红外光谱仪测定，KBr压片；核磁共振氢谱和碳谱(1HNMR和13CNMR)用JEOL GX-400型和VIRIAN GEMINI300型核磁共振仪测定，TMS为内标；质谱(MS) 用VGZABSPEC型和VG-MM7070型质谱仪测定。
取上述精制方法所得的香蒲新苷纯品为：淡黄色无定形粉末(甲醇-乙 酸乙酯)，熔点150～152℃，易溶于水、甲醇，溶于乙醇，微溶于丙酮、乙 酸乙酯。紫外灯下呈黄棕色荧光，三氯化铝显色后呈黄绿色荧光。盐酸镁粉 反应阳性，Molish反应阳性，示为黄酮苷类化合物。UVλmax(nm)：254， 354(MeOH)，示3位为取代的黄酮醇；269，329，407(MeONa)，带I红移53nm， 示4’位为游离羟基；273，322，357(NaOAc)，带II红移19nm，示7位为游 离羟基；254，354(NaOAc+H3BO3)，示无邻二羟基；269，301，369sh，405(AlCl3)， 带I红移51nm；268，361sh，402(AlCl3/HCl)，峰位与AlCl3光谱比较基本 不变，示5位为游离羟基。IRυmax(KBr，cm-1)：3407.9(OH)，2936.8， 1659.4(C＝O)，1613.8，1517.7(苯环)，1462.1，1358.8，1289.4，1205.2， 1131.5，1061.3，984.1，918.1，812.1。FAB-MS(m/z)：794(M++Na+H)， 771(M-+H)，625(M+-鼠李糖基+H)，478(M+-鼠李糖基-鼠李糖基+ H)，317(M+-鼠李糖基-鼠李糖基-葡萄糖基+H)。说明两个鼠李糖基 是末端的，即三糖部分是分支的。1HNMR(CD3OD，TMS)：δ0.91和1.06出现 的两个双峰，示有两个鼠李糖。δ4.53和5.18的信号，示两个鼠李糖基端 基氢，若仔细观察，每一信号实为双峰，其偶合常数很小，推断两个糖均为 α-构型；δ5.73处出现的双峰信号，示为3位葡萄糖基的相应的端基质子， 偶合常数为7.3Hz，推断为β-构型。由此表明，该化合物的3位连有两个鼠 李糖基和一个葡萄糖基。13CNMR(CD3OD，TMS)：δ68.9归于葡萄糖基6位次甲 基碳的信号，较对应的葡萄糖甲苷向低场位移，这是6位羟基苷化后而引起 的位移效应，表明一个鼠李糖的端基与葡萄糖的6位相连。δ80.9为葡萄糖 基2位碳的信号，与对应葡萄糖甲苷相比，此C-2信号向低场位移，而C-3 信号向高场位移，这表明另一鼠李糖基与葡萄糖2位相连。该化合物用 0.1mol/L盐酸水解，水解液纸层析检出L-鼠李糖和D-葡萄糖。综合以上数 据及实验结果，确定为异鼠李素-3-O-(2G-α-L-鼠李糖基)-α-L-鼠李糖(1 →6)-β-D-葡萄糖苷，即香蒲新苷(typhaneoside)，分子式为C34H42O2。其 UV、1HNMR、13CNMR数据见表1、2、3。
表1 香蒲新苷的UV光谱数据(nm) 测定溶剂 香蒲新苷 MeOH MeONa NaOAc NaOAc+H3BO3 AlCl3 AlCl3/HCl 254，354 269，329，407 273，322，357 254，354 269，301，369sh，405 268，361，402
表2香蒲新苷的1HNMR数据(in CD3OD) 氢原子 香蒲新苷 6 8 2’ 5’ 6’ -OCH31” 1 1”” 6-CH36”” -CH3 δ6.18，d，J＝1.8Hz δ6.38，d，J＝2.1Hz δ7.93，d，J＝2.1Hz δ6.91，d，J＝8.5Hz δ7.57，dd，J＝8.2Hz，2.0Hz overlaid δ5.73，d，J＝7.3Hz δ4.53，d，J＝2.0Hz δ5.18，d，J＝2.0Hz δ0.91，d，J＝6.1Hz δ1.06，d，J＝6.4Hz
表3香蒲新苷的13CNMR数据(in CD3OD) 碳原子 香蒲新苷(δ) 2 3 4 5 6 7 8 9 10 1’ 2’ 3’ 4’ 5’ 6’ OCH31” 2” 3” 4” 5” 6” 1 2 3 4 5 6 l”” 2”” 3”” 4”” 5”” 6”” 159.3 135.1 180.2 164.0 100.5 166.5 95.5 159.2 106.7 124.1 116.9 151.4 149.1 115.3 124.5 57.7 101.3 80.9 79.6 74.5 78.0 68.9 103.5 73.1 72.9 74.7 70.7 18.6 103.2 73.1 72.9 74.7 70.5 17.3
实验例3：硅胶干柱色谱分离香蒲新苷粗品试验
取蒲黄药材25kg，加入浓度为70％的乙醇200L，浸泡24h后，加热回流 提取1小时，静置1小时，吸取上清液。药渣用同样的方法先后提取3次， 提取药液合并，药渣弃去。将上述上清液和提取液合并，水浴加热，水浴温 度80℃，减压浓缩至浓缩液至无醇味，得稠膏2.8kg。
取上述稠膏50g，拌入150g粗硅胶(青岛海洋化工厂生产，160～200 目)，自然干燥，得到拌样硅胶。另取粗硅胶(青岛海洋化工厂生产，160～ 200目)1.5kg，100～105℃活化1.5小时后，干法装柱(直径12cm，高60cm)。 将拌样硅胶加入柱中，以乙酸乙酯-甲醇-水(8∶2∶1)混合溶剂为展开剂， 下行法展开，进行干柱层析，待展开剂前沿到达色谱柱底部时，放干溶剂， 等分切割，共得到10份。各份用温度为80℃的70％的热乙醇1500mL洗脱。 洗脱液减压回收溶剂后，得各洗脱物。各洗脱物用薄层色谱检查。
薄层色谱条件：吸附剂：硅胶GF254预制薄层板；展开剂：乙酸乙酯-丁 酮-甲醇-水(8∶3∶1∶1)混合溶剂。
其中第5份和第6份香蒲新苷含量较高，合并，得到香蒲新苷粗品7.9g； 香蒲新苷粗品为棕黄色粉末。
实验例4：减压柱色谱分离香蒲新苷精品试验
香蒲新苷精品的制备采用减压柱层析方法。吸附剂为薄层层析用硅胶H (青岛海洋化工厂生产，用量100g)。取上述实验例所得香蒲新苷粗品7.9g 用180毫升甲醇溶解后，加到4倍量的粗硅胶(160～200目)中，拌匀，挥 干溶剂，干法上样(色谱柱直径12cm，高4cm)。洗脱剂依次采用不同比例 的乙酸乙酯-无水乙醇混合溶剂，进行梯度洗脱(梯度为100∶0、95∶5、90∶10、 85∶15、80∶20、75∶25、70∶30、65∶35、60∶40、55∶45、50∶50、45∶55、40∶60)， 每个梯度洗脱剂用量为150mL，洗脱流速为每分钟3mL，洗脱剂总用量为 1950mL，分份收集，每份100mL，减压浓缩至小体积(约10mL)后，用薄层 色谱检查，薄层色谱条件：吸附剂：硅胶GF254预制薄层板；展开剂：乙酸乙 酯-丁酮-甲醇-水(8∶3∶1∶1)混合溶剂。其中第8-10份香蒲新苷含量较高， 把第8～10份浓缩液合并，减压抽干得到香蒲新苷精品黄色粉末2.83g。 实验例5：葡聚糖凝胶(Sephadex LH-20)柱色谱分离香蒲新苷纯品试验
上述香蒲新苷精品黄色粉末2.83g以40毫升甲醇溶解，上样(Sephadex LH-20凝胶50g，甲醇浸泡24h后，湿法装柱。色谱柱直径3cm，高60cm)， 用120毫升甲醇进行洗脱，待色带到达柱底部时，开始收集洗脱液，每份5mL， 共收集15份。用薄层色谱检查，薄层色谱条件：吸附剂：硅胶GF254预制薄 层板；展开剂：乙酸乙酯-丁酮-甲醇-水(8∶3∶1∶1)混合溶剂。其中第6-9 份香蒲新苷含量较高，把其中第8～10份分别浓缩至小体积(2mL)后，加 入20倍量乙酸乙酯，静置1小时，沉淀，过滤，沉淀用20毫升乙酸乙酯洗 涤后，自然干燥，即得到香蒲新苷纯品2.61克，为淡黄色粉末。
实施例1：香蒲新苷纯品的制备
取蒲黄药材25kg，加入浓度为70％的乙醇175L，浸泡30小时后，加热 回流提取1小时，静置1小时，吸取上清液。药渣用同样的方法先后提取3 次，提取药液合并，药渣弃去。将上清液与提取液合并，水浴加热，水浴温 度70℃，减压浓缩至浓缩液至无醇味，得稠膏即蒲黄总提取物2.5kg。
取上述稠膏53g，拌入180g，120目粗硅胶，自然干燥，得到拌样硅胶。 另取180目硅胶1600g，100～105℃活化1.5小时后，干法装柱，径高比为 1∶5；将拌样硅胶加入柱中，以10∶1∶1乙酸乙酯-甲醇-水混合溶剂2000毫 升为展开剂，下行法展开，进行干柱层析，待展开剂前沿到达色谱柱底部时， 放干溶剂，色带切割，共得到10份。各份用甲醇1750ml洗脱。洗脱液减压 回收溶剂后，得各洗脱物；其中第5份和第6份香蒲新苷含量较高，合并， 得到香蒲新苷粗品8g。
香蒲新苷精品的制备采用减压柱层析方法。吸附剂为薄层层析用200目 的硅胶H(青岛海洋化工厂生产，用量110g)。香蒲新苷粗品8g用100ml甲 醇溶解后，加到4倍量的粗硅胶(160～200目)中，拌匀，挥干溶剂，干法 上样(色谱柱直径12cm，高4cm)。洗脱剂依次采用不同比例的乙酸乙酯-无 水乙醇混合溶剂，进行梯度洗脱(梯度为100∶0、95∶5、90∶10、85∶15、80∶20、 75∶25、70∶30、65∶35、60∶40、55∶45、50∶50、45∶55、40∶60)，每个梯度 洗脱剂用量为200mL，洗脱流速为每分钟4mL，洗脱剂总用量为2600mL，每 份100mL，减压浓缩至小体积(约18mL)后，把其中第8～10份浓缩液合并， 减压抽干得到香蒲新苷精品黄色粉末3.00g。
香蒲新苷的纯化：上述香蒲新苷精品黄色粉末3.00g以60mL甲醇溶解， 上样(Sephadex LH-20凝胶80g，乙醇浸泡30小时后，湿法装柱。色谱柱 直径3cm，高60cm)，用甲醇150毫升进行洗脱，待色带到柱底部时，开始 收集洗脱液，每份10mL，共收集10份。把其中第6～9份分别浓缩至小体积 (2.8mL)后，加入25倍量乙酸乙酯，静置1.5小时，沉淀，过滤，沉淀用 30毫升乙酸乙酯洗涤后，自然干燥，即得到香蒲新苷纯品2.8克，为淡黄色 粉末。
实施例2：香蒲新苷纯品的制备
取蒲黄药材25kg，加入浓度为80％的乙醇200L，浸泡40小时后，加热 回流提取1.5小时，静置1小时，吸取上清液。药渣用同样的方法先后提取 4次，提取药液合并，药渣弃去。将上清液与提取液合并，水浴加热，水浴 温度80℃，减压浓缩至浓缩液至无醇味，得稠膏即蒲黄总提取物2.7kg。
取上述稠膏53g，拌入180g，120目粗硅胶，自然干燥，得到拌样硅胶。 另取180目硅胶1600g，100～105℃活化1.5小时后，干法装柱，径高比为 1∶5；将拌样硅胶加入柱中，以乙7∶3∶1酸乙酯-甲醇-水混合溶剂2200毫升 为展开剂，下行法展开，进行干柱层析，待展开剂前沿到达色谱柱底部时， 放干溶剂，色带切割，共得到10份。各份用甲醇1900ml洗脱。洗脱液减压 回收溶剂后，得各洗脱物；其中第5份和第6份香蒲新苷含量较高，合并， 得到香蒲新苷粗品7.8g。
香蒲新苷精品的制备采用减压柱层析方法。吸附剂为薄层层析用250目 的硅胶H(青岛海洋化工厂生产，用量130g)。香蒲新苷粗品7.8g用150毫 升甲醇溶解后，加到5倍量的粗硅胶(160～200目)中，拌匀，挥干溶剂， 干法上样(色谱柱直径12cm，高4cm)。洗脱剂依次采用不同比例的乙酸乙 酯-无水乙醇混合溶剂，进行梯度洗脱(梯度为100∶0、95∶5、90∶10、85∶15、 80∶20、75∶25、70∶30、65∶35、60∶40、55∶45、50∶50、45∶55、40∶60)，每 个梯度洗脱剂用量为220mL，洗脱流速为每分钟5mL，洗脱剂总用量为 2860mL，每份120mL，减压浓缩至小体积(约16mL)后，把其中第8～10份 浓缩液合并，减压抽干得到香蒲新苷精品黄色粉末2.60g。
香蒲新苷的纯化：上述香蒲新苷精品黄色粉末2.60g以40毫升乙醇溶 解，上样(Sephadex LH-20凝胶70g，甲醇浸泡26小时后，湿法装柱。色 谱柱直径3cm，高60cm)，用甲醇100毫升进行洗脱，待色带到柱底部时， 开始收集洗脱液，每份8mL，共收集12份。把其中第6～9份分别浓缩至小 体积(2.4mL)后，加入24倍量乙酸乙酯，静置1.5小时，沉淀，过滤，沉 淀用30毫升乙酸乙酯洗涤后，自然干燥，即得到香蒲新苷纯品2.5克，为 淡黄色粉末。
实施例3：香蒲新苷纯品的制备
取蒲黄药材25kg，加入浓度为90％的乙醇225L，浸泡45小时后，加热 回流提取0.5小时，静置1小时，吸取上清液。药渣用同样的方法先后提取 2次，提取药液合并，药渣弃去。将上清液与提取液合并，水浴加热，水浴 温度80℃，减压浓缩至浓缩液至无醇味，得稠膏即蒲黄总提取物2.8kg。
取上述稠膏55g，拌入170g，160目粗硅胶，自然干燥，得到拌样硅胶。 另取160目硅胶1700g，100～105℃活化2小时后，干法装柱，径高比为1∶ 5；将拌样硅胶加入柱中，以乙9∶1∶1酸乙酯-甲醇-水混合溶剂1800毫升 为展开剂，下行法展开，进行干柱层析，待展开剂前沿到达色谱柱底部时， 放干溶剂，等分切割，共得到10份。各份用丙酮1700ml洗脱。洗脱液减压 回收溶剂后，得各洗脱物；其中第5份和第6份香蒲新苷含量较高，合并， 得到香蒲新苷粗品7.5g。
香蒲新苷精品的制备采用减压柱层析方法。吸附剂为薄层层析用300目 的硅胶H(青岛海洋化工厂生产，用量140g)。香蒲新苷粗品7.5g用120毫 升甲醇溶解后，加到4倍量的粗硅胶(160～200目)中，拌匀，挥干溶剂， 干法上样(色谱柱直径12cm，高4cm)。洗脱剂依次采用不同比例的乙酸乙 酯-无水乙醇混合溶剂，进行梯度洗脱(梯度为100∶0、95∶5、90∶10、85∶15、 80∶20、75∶25、70∶30、65∶35、60∶40、55∶45、50∶50、45∶55、40∶60)，每 个梯度洗脱剂用量为200mL，洗脱流速为每分钟4mL，洗脱剂总用量为 2600mL，每份140mL，减压浓缩至小体积(约12mL)后，把其中第8～10份 浓缩液合并，减压抽干得到香蒲新苷精品黄色粉末2.50g。
香蒲新苷的纯化：上述香蒲新苷精品黄色粉末2.50g以30毫升乙醇溶 解，上样(Sephadex LH-20凝胶60g，乙醇浸泡28小时后，湿法装柱。色 谱柱直径3cm，高60cm)，用乙醇120毫升进行洗脱，待色带到柱底部时， 开始收集洗脱液，每份7mL，共收集14份。把其中第6～9份分别浓缩至小 体积(3mL)后，加入22倍量乙酸乙酯，静置1小时，沉淀，过滤，沉淀用 20毫升乙酸乙酯洗涤后，自然干燥，即得到香蒲新苷纯品2.3克，为淡黄色 粉末。
实施例4：香蒲新苷纯品的制备
取蒲黄药材25kg，加入浓度为70％的乙醇200L，浸泡24h后，加热回流 提取1小时，静置，吸取上清液。药渣用同样的方法先后提取3次，提取药 液合并，药渣弃去。将上清液与提取液合并，水浴加热，水浴温度80℃，减 压浓缩至浓缩液至无醇味，得稠膏2.8kg。
取上述稠膏58g，拌入160g，180目粗硅胶，自然干燥，得到拌样硅胶。 另取120目硅胶1900g，100～105℃活化1.5小时后，干法装柱，径高比为 1∶5；将拌样硅胶加入柱中，以乙8∶2∶1酸乙酯-甲醇-水混合溶剂2000毫升 为展开剂，下行法展开，进行干柱层析，待展开剂前沿到达色谱柱底部时， 放干溶剂，等分切割，共得到10份。各份用温度为80℃的70％的热乙醇1600ml 洗脱。洗脱液减压回收溶剂后，得各洗脱物；其中第5份和第6份香蒲新苷 含量较高，合并，得到香蒲新苷粗品7.9g。香蒲新苷粗品为棕黄色粉末。
香蒲新苷的精制：采用减压柱层析方法。吸附剂为薄层层析用250目的 硅胶H(青岛海洋化工厂生产，用量150g)。香蒲新苷粗品7.9g用150毫升 甲醇溶解后，加到3倍量的粗硅胶(160～200目)中，拌匀，挥干溶剂，干 法上样(色谱柱直径12cm，高4cm)。洗脱剂依次采用不同比例的乙酸乙酯- 无水乙醇混合溶剂，进行梯度洗脱(梯度为100∶0、95∶5、90∶10、85∶15、 80∶20、75∶25、70∶30、65∶35、60∶40、55∶45、50∶50、45∶55、40∶60)，每 个梯度洗脱剂用量为150mL，洗脱流速为每分钟4mL，洗脱剂总用量为 1950mL，每份150mL，减压浓缩至小体积(约10mL)后，把其中第8～10份 浓缩液合并，减压抽干得到香蒲新苷黄色粉末2.80g。
香蒲新苷的纯化：上述香蒲新苷精品黄色粉末2.80g以50毫升甲醇溶 解，上样(Sephadex LH-20凝胶50g，甲醇浸泡24小时后，湿法装柱。色 谱柱直径3cm，高60cm)，用乙醇120毫升进行洗脱，待色带到柱底部时， 开始收集洗脱液，每份5mL，共收集15份。把其中第6～9份分别浓缩至小 体积(2mL)后，加入20倍量乙酸乙酯，静置1.5小时，沉淀，过滤，沉淀 用20mL乙酸乙酯洗涤后，自然干燥，即得到香蒲新苷纯品2.70克，为淡黄 色粉末。