关于联邦资助的研究或开发的声明
本发明在国立卫生研究院(National Institutes of Health)授予的合作协议下，由政府支持完成，资助号为DK040949和DK074176。美国政府可享有本发明的某些权利。
发明背景
本发明涉及多肽激素类似物，其表现出增强的药物特性，诸如增加的热力学稳定性，降低的促有丝分裂性和在高蛋白浓度(1-5mM)下在锌离子不存在的情况下的快速作用制剂的可行性。更具体地，本发明涉及赋予改变或选择性的受体后信号传导特性(相对于野生型胰岛素的信号转导)的胰岛素类似物。因此，本发明的胰岛素类似物由含有氨基酸取代的新型组合的两条多肽链组成，使得所述类似物表现出(i) 增强的热力学稳定性，(ii) 在大于0.6mM的蛋白浓度下降低的自身缔合，和(iii) 人胰岛素分子的生物功效的至少一部分，尽管在哺乳动物中皮下或静脉内注射后可能需要更大数量的蛋白分子，以引发血液-葡萄糖浓度的相似降低。
非标准蛋白(包括治疗剂和疫苗)的工程改造可以具有广泛的医疗和社会益处。天然存在的蛋白——如通常在人类、其它哺乳动物、脊椎生物、无脊椎生物或真核细胞的基因组中编码的那样——可以演化成在细胞背景下最佳地发挥功能，但对于治疗应用可能是次佳的。此类蛋白的类似物可以表现出改善的生物物理、生物化学或生物特性。蛋白类似物的益处是实现增强的“中靶”活性(诸如代谢的代谢调节，导致血液-葡萄糖浓度的降低)，和减少的意外和不利的副作用，诸如促进癌细胞的生长或增加的脂质的生物合成。此类蛋白工程改造的另一个益处是保留对蛋白浓度的快速起效作用以实现较高强度的制剂。社会益处的又另一个实例是对室温下或高于室温的降解的抗性提高，有利于运输、分配和使用。胰岛素提供了治疗性蛋白的一个实例。野生型人胰岛素和在其它哺乳动物基因组中编码的胰岛素分子结合位于多器官和多种类型的细胞的胰岛素受体，无论是通过RNA剪接的替代方式或通过翻译后糖基化的替代模式生成的受体同种型。野生型胰岛素还以较低、但显著的亲和力与同源1型胰岛素样生长因子受体(IGF-1R)结合。
胰岛素是双链蛋白分子，其在脊椎动物中是被称为胰岛素原的单链前体的生物合成产物。人胰岛素原的序列和结构分别说明于图1A和1B中；人胰岛素的序列显示于图1C中。胰岛素的两个多肽链分别被称为A和B。一个或另一个链中的特定残基通过如下表示：标准三字母代码(例如，Ala代表丙氨酸或Asp代表天冬氨酸)，随后是表示链(A或B)和该链中的残基编号的上标。例如，B链的位置10的组氨酸表示为HisB10，B链的位置12的缬氨酸表示为ValB12，且A链的位置8的苏氨酸表示为ThrA8。“胰岛素类似物”表示通过用不同类型的氨基酸取代一个或多个氨基酸残基或通过用不同的原子或原子集合修饰此类残基的侧链或主链中的一个或多个原子而与野生型胰岛素相关的一类分子。本领域已知的胰岛素类似物的实例是胰岛素赖脯胰岛素(lispro)，其中ProB28被Lys取代，且LysB29被Pro取代。胰岛素赖脯胰岛素(也称为KP-胰岛素)是产品Humalog® (Eli Lilly and Co.)的活性组分。
本领域已知胰岛素的B链可以通过在一个或几个位置的标准氨基酸取代进行修饰，以增强胰岛素类似物制剂从皮下贮库的吸收速率。进一步医疗益处的一个实例是可溶性胰岛素类似物制剂的药代动力学特性的优化，使得快速起效作用在U-200至U-1000范围内(即，比常规U-100胰岛素产品高两倍和十倍之间(在该命名法中，“U-X”表示每ml溶液或悬浮液中的X内部单位)的强度的制剂中得以保留。增加强度的胰岛素制剂有望对于表现出显著的胰岛素抵抗的患者具有特别的益处，并且在内部或外部胰岛素泵中也可以是有价值的，以延长储库寿命或允许新一代的泵技术中的储库的小型化。现有的胰岛素产品通常在增加胰岛素或胰岛素类似物的浓度以达到制剂强度> U-200 (200国际单位/ml)后显示延长的药代动力学和药效动力学特性。此延长损害此类产品皮下注射后对于血糖的膳食控制的效力，并且损害基于泵的连续皮下输注的效力和安全性。鉴于这些缺点，可通过在U-200和U-1000之间保留快速作用的胰岛素类似物的工程改造来增强快速作用的胰岛素类似物制剂的治疗和社会益处。如果新型可溶性胰岛素类似物相对于野生型人胰岛素表现出对1型IGF受体的较弱的亲和力，则产生额外的益处。如果浓缩的胰岛素类似物制剂可以在开发用于监测胰岛素刺激的人癌细胞系增殖的测定中表现出减少的促有丝分裂性，则还产生额外的治疗和社会益处。
施用胰岛素已长期被确定为糖尿病的治疗方法。在患有糖尿病的患者中常规胰岛素替代疗法的主要目的是严格控制血液葡萄糖浓度以防止其偏离高于或低于健康人对象的正常范围特征。偏离低于正常范围与即时肾上腺素或神经低血糖症状相关，这在严重发作中导致痉挛、昏迷和死亡。偏离高于正常范围与微血管疾病(包括视网膜病、失明和肾衰竭相关)的长期风险增加相关。尽管血糖控制的重要性是本领域众所周知的，但2型糖尿病(T2DM)的病理生理学还表征为选择性胰岛素抵抗(SIR)，其中胰岛素变得对血糖控制无效，但仍继续驱动促有丝分裂和过量脂质合成。在肝脏和肌肉中积累脂质进一步使葡萄糖调节失衡，增加胰岛素抵抗，并加速T2DM及其并发症的进展。据我们所知，目前没有重新平衡此类扰动的细胞和器官特异性信号传导的胰岛素产品(批准的或临床试验中)。因此，我们预期此产品将在T2DM中产生新的治疗范例，产生显著的长期健康益处和总体健康-护理费用的降低。
胰岛素是在脊椎动物的代谢中起到重要作用的小球状蛋白。胰岛素含有两条链，含有21个残基的A链和含有30个残基的B链。该激素作为Zn2+-稳定的六聚体存储在胰岛β细胞中，但作为无Zn2+单体在血流中起作用。胰岛素是单链前体(胰岛素原)的产物，其中连接区(35个残基)将B链的C-端残基(残基B30)连接到A链的N-端残基。各种证据表明，其由胰岛素样核心和无序的连接肽组成。三个特定的二硫键(A6-A11、A7-B7和A20-B19)的形成与胰岛素原在粗面内质网(ER)中的氧化折叠相偶联。胰岛素原在反式高尔基体网络中在途中被转化为胰岛素，从而作为锌胰岛素六聚体储存在胰岛β细胞内的葡萄糖调节的分泌颗粒中。胰岛素的经典晶体结构(从锌六聚体提取的一种原体)显示于图2中。
本发明由医学和社会需求所驱动，对在中性pH下在U-100至U-1000的范围内的强度下的可溶性制剂中的快速作用的胰岛素类似物进行工程改造，其表现出改变或选择性的受体后信号传导特性。长期以来，与胰岛素受体的结合如何导致跨越细胞膜的信号转导、导致受体的细胞质部分的自磷酸化的现行范式构成了此类产品的障碍。此类自磷酸化进而活化多种受体后信号传导途径，例如导致以下的途径：(i) 将GLUT4葡萄糖转运蛋白从细胞内隔室转运至质膜，(ii) 促进癌细胞的生长和增殖的基因的转录活化，(iii) 将葡萄糖分子作为糖原储存在细胞内，和(iv) 通过脂质的细胞内生物合成代谢转化胰岛素分子。
通常不知道胰岛素分子是否或如何被修饰，使得可以选择性加强或减弱一种受体后信号传导途径。完整胰岛素受体的结构迄今尚未确定，并且因此胰岛素与细胞的外部(受体的“胞外域”)结合如何导致信号传播至细胞内部(即，受体的细胞质结构域)的机制是未知的。脂-胞外域(apo-ectodomain)的晶体结构作为低分辨率的倒V型二聚体组装体在本领域中是已知的(图3)，但用结合的胰岛素分子不能获得晶体。与结构域-最小化的“微型受体”结合的胰岛素的晶体结构也已以低分辨率测定(图4)，但该结构缺乏跨膜信号传导和信号通信至受体后途径所需的受体的β-亚基。因此，本领域中不知道胰岛素分子的修饰是否或如何影响各种受体后信号传导输出的相对强度。
本领域已知表现出受体后信号传导平衡的不利变化的胰岛素类似物由AspB10-胰岛素提供。该类似物的设计和制备的最初动机基于其在胰岛素自组装中的结构作用。野生型残基(HisB10)在天然六聚体组装中起作用，以协调六聚体的中心轴中的两个轴向锌离子。用Asp取代HisB10损害锌离子在该轴向模式中的结合，并阻断经由经典六聚体的三聚体相关表面的高阶自组装。基于一般理由，可以预期AspB10通过经由静电机制：作为有利的C-帽残基且通过可能形成(i, i+4)盐桥，增强不含锌的单体或二聚体中的中心B链α-螺旋的分段稳定性。不考虑蛋白稳定性的理论基础，确实观察到HisB10被Asp取代，以增加不含锌的胰岛素单体的热力学稳定性，如通过化学变性研究所探测的。AspB10还增强胰岛素对胰岛素受体的亲和力，并且平行地增加其在分离的脂肪细胞中刺激脂肪生成的功效。
尽管通过在野生型胰岛素中用Asp取代HisB10赋予上述有利的结构和生物物理特性，但在肿瘤细胞系(包括衍生自人乳腺癌的细胞系)的细胞培养测定中增加的促有丝分裂性以及通过AspB10-胰岛素对Sprague-Dawley大鼠的长期治疗后相对于野生型胰岛素的乳腺肿瘤的过量发生率的发现排除其临床用途。本发明提供胰岛素分子中的非标准氨基酸取代(五氟-PheB24)的组合，使得保留由AspB10赋予的有利特性(诸如增强的稳定性和超过二聚化阶段以外的削弱的自组装)，而减轻或甚至保留细胞培养测定中促有丝分裂性的不利增加，以达到低于野生型胰岛素本身的促有丝分裂性水平。另外令人惊讶的是，AspB10与五氟-PheB24的组合有利地改变肌肉中的受体后信号传导途径的平衡，使得相对于脂质的形成，糖原的形成增强。
发明概述
本发明的令人惊讶的方面是这些互补目标可以通过共同引入酸性AspB10取代与B链的C-端β链中的氨基酸取代(PheB24→五氟-Phe)(本身显著损害胰岛素的生物活性的修饰)来实现。该对修饰可以与以下进一步组合：(i) 先前与B链的N-端区段中的碱性取代(AsnB3→Lys)配对的B链的C-端区段中的氨基酸取代(LysB29→Glu)，其出于无关的目的，即设计能够自我组装的正餐胰岛素类似物；或(ii) 位置B28和/或B29的其它取代，其旨在降低二聚化的强度或去除通常与野生型胰岛素中位置B29的Lys的存在相关的胰蛋白酶位点。因此，本发明的胰岛素类似物含有上述B10和B24修饰作为核心设计元件，这是基于我们令人惊讶的观察结果，即该组合保留或增强AspB10的有利的生物物理特性，同时赋予新型信号传导特性并减轻或避免其不利特性。本发明的胰岛素类似物还可以含有在位置A8的非β支链取代，B链的C-端延伸以包括残基B31 (B链31-残基)或残基B31-B32 (B链32-残基)。上述类似物的集合可以任选地进一步通过缺失N-端B链残基B1、B1-B2或B1-B3进行修饰。
本发明的第二个令人惊讶的方面是，胰岛素类似物可以同时被设计为表现出削弱的自我组装—并且因此表现出皮下组装后的快速作用—并且仍然在化学和物理降解方面维持足够的稳定性，以允许其安全且有效地配制为实用的胰岛素产品。此稳定性也是由AspB10和五氟-PheB24赋予的组合特性的结果。进一步令人惊讶的是，上述情况可以伴随促有丝分裂性的减少。我们设想，本发明的产品将不成比例地有益于西方社会中具有肥胖、2型糖尿病和显著的胰岛素抵抗的患者。此类临床特征对代表不足的少数民族(包括非洲裔美国人、西班牙裔美国人和土著美国部落)构成越来越大的负担。由于其每纳摩尔蛋白的生物活性增加，本发明的产品还可用于延长胰岛素泵的储库寿命并实现此类泵的小型化。
此外，本发明的一个方面是提供胰岛素类似物，其在皮下注射后提供快速作用的药代动力学和药效动力学特性。本发明的类似物含有位置B10的天冬氨酸(Asp B10)，位置B24的五氟-Phe (5F-PheB24)，并且在一个实施方案中，还含有B29处的谷氨酸或鸟氨酸(GluB29或OrnB29)；任选地，此类类似物可以含有位置A8的非β支链氨基酸取代，直至且包括两个残基(B31和B32)的B链的C-端延伸和/或直至且包括三个残基(B1-B3)的B链的N-端缺失。残基B28可以是Pro (如野生型胰岛素中)、Lys、Gln或Ala。位置A13可以任选地是Leu、Trp或Tyr；位置A14可以任选地是Tyr或Glu。残基B30可以任选地不存在。本发明的胰岛素类似物还可以任选地含有在A或B结构域中的其它位点(诸如本领域已知赋予快速作用的位置B28)的标准或非标准氨基酸取代，并且可以任选地含有B链的一个或两个残基延伸(残基B31和B32)。本发明的一个额外方面是所述类似物表现出等于或大于野生型人胰岛素的热力学稳定性，以及等于或小于野生型人胰岛素的人乳腺癌细胞系的组织培养测定中的促有丝分裂性。
上述特征的组合由位置B10的酸性氨基酸取代和位置B24的五氟-苯丙氨酸的新型组合赋予。尽管不希望受理论所束缚，但我们设想五氟-PheB24的芳族环的反向四极静电力矩当停靠在激素-受体界面时(图4)，减轻AspB10延长停留时间并增强三种同源激素-受体复合物(IR-A、IR-B和IGF-1R)的亲和力的效果。我们进一步设想，在游离激素中，五氟-Phe对PheB24的取代保留并增强如本领域已知的AspB10的稳定作用。尽管不希望受理论所束缚，但我们设想，通过胰岛素分子内的裂缝内的修饰的芳族环的更大疏水性来平衡由五氟-PheB24取代引起的对天然LeuB15-PheB24相互作用的任何结构扰动(图5)。也不希望受理论所限制，我们进一步设想在位置A8、A14和/或B29的任选的酸取代的非累加效应减弱通过此类类似物和胰岛素受体的复合物或通过此类类似物与1型IGF受体的复合物的促有丝分裂信号转导。
大体上，本发明提供胰岛素类似物，其含有位置B10的天冬氨酸、位置B24的五氟-苯丙氨酸和在以下三个位置中的一个或多个的任选其它氨基酸取代：A8、A13、A14、B28、B29，和任选B链的C-端延伸(以包括B31或B31-B32，其中额外残基中的至少一个是酸性的)，或B链的N-端缺失(直至且包括B3)。因此，本发明涉及新型类别的含有修饰的组合的胰岛素类似物，所述修饰的组合一起提供长期寻求的未由任何一种成分修饰赋予的临床优点。在本发明的类似物的一种版本中，残基B28和B29是如本领域已知的快速作用胰岛素类似物(胰岛素赖脯胰岛素；也称为KP-胰岛素)中的LysB28和ProB29。在其它版本中，残基B28是脯氨酸(如野生型胰岛素中)，而残基B29是鸟氨酸(Orn)或谷氨酸。在本发明的又另一种版本中，残基B30不存在。在又另一种版本中，本发明的类似物可以含有位置A14的谷氨酸，和/或位置A21的甘氨酸、丙氨酸或天冬氨酸。
附图的几个视角的简述
图1A是包括A链和B链以及显示具有侧翼二元切割位点(实心圆)和C-肽(空心圆)的连接区的人胰岛素原序列的示意图。
图1B是胰岛素原的结构模型，其由胰岛素样部分和无序的连接肽(虚线)组成。
图1C是显示B链中残基B27和B30位置的人胰岛素序列的示意图。
图2描绘胰岛素的结构。(A)苯酚-稳定的R6锌六聚体。轴向锌离子(覆盖)显示为由组氨酸侧链配位的重合黑色球体。(B)胰岛素单体的结构。二硫键描绘为球和棍。
图3说明胰岛素-受体(IR)胞外域二聚体的结构。一个亚基以带状表示显示，且另一个显示为空间填充表面。细胞膜的位置在底部以示意性方式显示。坐标获得自Protein Databank条目3LOH。
图4说明胰岛素如何结合其受体的胞外域。“微受体”结构代表含有胰岛素、αCT肽和胞外域α-亚基片段L1-CR的三元复合物(蛋白数据库条目3W11)。多肽链和结构域由颜色编码为标记的。二硫键未显示。
图5描绘PheB24如何在蛋白裂缝中包装。位于疏水核心内的裂缝内的PheB24 (粉-蓝色棒)的芳族侧链，其边界和边缘表现出部分正-和负静电蛋白表面(红色和蓝色)。
图6提供测量胰岛素类似物的促有丝分裂性的测定：显示软琼脂中的MCF-7细胞集落形成的柱状图。数据表明，与基础相比，在每种条件下，直径>100nm的集落的相对数目。缩写：HI，野生型人胰岛素；5F-POT是5F-PheB24-OrnB29-胰岛素；5F-DKP是5F-PheB24-AspB10-KP-胰岛素(Sigselin-1)；HPI，野生型人胰岛素原；A3Leu，含有取代ValA3→Leu的无活性胰岛素类似物(“胰岛素Wakayama”)。
图7提供测量STZ Lewis大鼠中的葡萄糖-降低活性的测定。(A和B)时间= 0时6只大鼠中11.5 nmol/kg SQ注射后的平均BG的时程：(正方形) KP-胰岛素，(菱形) AspB10-KP-胰岛素，(圆形) 5F-PheB24-KP-胰岛素和(三角形) 5F-PheB24-AspB10-KP-胰岛素(Sigselin-1)。(C和D) 在SQ注射后的前60分钟内观察到的Sigselin-1 (圆形)和KP-胰岛素(正方形)相对于BG浓度下降的剂量-反应曲线。
图8提供关于高胰岛素血糖-正常血糖钳制(HIEC)研究的数据。以mg/ml (而不是通常的mg/dl)的单位给出的血液-葡萄糖(BG)浓度的时程。数据验证钳制技术(每组N=4只大鼠)。
图9提供14C-示踪剂2-脱氧葡萄糖的肌肉更新的测定：媒介物对照、“胰岛素”(胰岛素赖脯胰岛素)和“类似物”(Sigselin-1)。
图10提供3H-标记的葡萄糖至糖原的肌肉特异性掺入的测定：“胰岛素”(胰岛素赖脯胰岛素)和“类似物”(Sigselin-1)。
发明详述
本发明涉及胰岛素类似物，其提供改变或选择性受体后胰岛素信号传导特性，在宽范围的蛋白浓度和制剂强度(通常从U-100至U-500和任选地高达U-1000)下的快速作用，对于IGF-1R的亲和力小于野生型人胰岛素的亲和力，以及相对于野生型人胰岛素在锌离子不存在的情况下的基线稳定性，大于野生型人胰岛素的热力学稳定性的在锌离子不存在的情况下的热力学稳定性。
本发明的一个方面是本类似物在软琼脂中的人乳腺癌细胞增殖的基于细胞的测定中表现出小于或等于野生型人胰岛素的促有丝分裂性的促有丝分裂性。本发明的又另一个方面是，相对于肌肉细胞内的葡萄糖衍生的碳原子流动至脂质中，本类似物优先地引导此类碳原子流动至糖原中。这些方面提供了受体后信号传导中的“偏倚”的实例，由此维持或增强有利的信号转导结果，但减弱不利的信号转导结果。
本发明的一个方面是来自皮下贮库的快速吸收动力学可以通过胰岛素类似物生成，所述胰岛素类似物是单体的或二聚体的——但不是自我组装的高阶状态——在不含锌的溶液中在中性pH下在0.6-6.0 mM的蛋白浓度下(如相对于正式单体浓度所计算)。如本领域已知的常规正餐产品代表自我组装状态之间可能的偶联平衡的连续体，包括通过潜在的六聚体-六聚体相互作用延伸的锌稳定或锌离子非依赖性的六聚体。该策略的分子实施提供新型类别的胰岛素类似物，其(i) 相对于野生型人胰岛素，与不含锌的单体和二聚体相比一样稳定或更稳定，并且(ii) 在每分子或每纳摩尔的基础上，保留野生型人胰岛素的生物功效的至少一部分(如通过激素调节的血液-葡萄糖浓度的降低所评估)。本发明的一个方面是涉及血糖控制的保留功效与降低的促有丝分裂性相关，其为从癌症风险和癌症生长的角度来看不利的不同信号传导途径的生物学结果。
还设想，通过非限制性实例，胰岛素类似物可以用衍生自动物胰岛素(诸如猪、牛、马和犬胰岛素)的A和B链序列制备，只要天冬氨酸酸保留在位置B10，丙氨酸存在于位置B12，谷氨酸存在于位置B29，且一个或多个酸性氨基酸取代任选地存在于由A8、A14、A21和B28提供的位点中的一个或多个。衍生自人胰岛素或动物胰岛素的此类变体B链可以任选地缺失ThrB30 (des-B30)或含有C-端二肽延伸(各自残基位置表示为B31和B32)，其中这些C-端延伸的残基中的至少一个是酸性氨基酸。另外或替代地，本发明的胰岛素类似物可以含有残基B1、B1-B2或B1-B3的缺失；或者可以与缺失位置B28的脯氨酸的变体B链组合(例如，LysB28、AlaB28或GlnB28与位置B29的谷氨酸组合)。在位置A13可以任选地被Trp或Tyr取代，位置A14酪氨酸可以任选地被谷氨酸取代，而在位置A21，天冬酰胺可以任选地被丙氨酸、甘氨酸或天冬氨酸取代。
进一步设想，本发明的胰岛素类似物可以衍生自巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)、酿酒酵母(Sacharomyces cerevisciae)或其它酵母表达物种或菌株中，酵母生物合成中前体多肽的Lys-定向的蛋白水解。可以通过工程改造的tRNA合成酶和正交无义抑制，将此类菌株工程改造，以在位置B24插入五氟-苯丙氨酸。任选地，类似物可以在TyrB16和/或TyrB26 (3-单碘-Tyr或[3,5]-二碘-Tyr)的芳族环内含有碘取代；旨在增加热力学稳定性和受体-结合活性)。还设想，ThrB27、ThrB30或在C结构域中的一个或多个丝氨酸残基可以单独或组合地被单糖加合物修饰；实例由O-连接的N-乙酰基-β-D-吡喃半乳糖苷(称为GalNAc-Oβ-Ser或GalNAc-Oβ-Thr)、O-连接的α-D-吡喃甘露糖苷(甘露糖-Oβ-Ser或甘露糖-Oβ-Thr)和/或α-D-吡喃葡萄糖苷(葡萄糖-Oβ-Ser或葡萄糖-Oβ-Thr)提供。
此外，考虑到人胰岛素和动物胰岛素之间的相似性，以及过去在患有糖尿病的患者中使用动物胰岛素，还设想可以在胰岛素的序列中引入其它小的修饰，尤其是被认为“保守”的那些取代。例如，可以在具有类似侧链的氨基酸组中进行氨基酸的额外取代而不偏离本发明。这些包括中性疏水性氨基酸：丙氨酸(Ala或A)、缬氨酸(Val或V)、亮氨酸(Leu或L)、异亮氨酸(Iie或I)、脯氨酸(Pro或P)、色氨酸(Trp或W)、苯丙氨酸(Phe或F)和蛋氨酸(Met或M)。同样，中性极性氨基酸可以在其以下的组中互相取代：甘氨酸(Gly或G)、丝氨酸(Ser或S)、苏氨酸(Thr或T)、酪氨酸(Tyr或Y)、半胱氨酸(Cys或C)、谷氨酰胺(Glu或Q)和天冬酰胺(Asn或N)。酸性氨基酸是天冬氨酸(Asp或D)和谷氨酸(Glu或E)。碱性氨基酸取代(包括赖氨酸(Lys或K)、精氨酸(Arg或R)和组氨酸(His或H))的引入对于维持这类类似物的增加的净负电荷不是优选的。除非另行指出或由上下文显而易见，本文中提到的氨基酸应认为是L-氨基酸。标准氨基酸也可以被属于同一化学种类的非标准氨基酸取代。
出于比较目的，提供人胰岛素原的氨基酸序列作为SEQ ID NO:1。
SEQ ID NO:1 (人胰岛素原)
提供人胰岛素的A链的氨基酸序列作为SEQ ID NO:2。
SEQ ID NO:2 (人A链；残基位置A1-A21)
提供人胰岛素的B链的氨基酸序列作为SEQ ID NO:3。
SEQ ID NO:3 (人B链；残基位置B1-B30)
本发明的修饰的胰岛素的氨基酸序列以SEQ ID NO 4和5中的一般形式给出，其中六个半胱氨酸残基配对以提供如野生型人胰岛素中的三个二硫键。
SEQ ID NO:4
A链
其中Xaa1 (位置A8)可以是Thr (如野生型胰岛素中)、His、Glu或任何其它非β-支链氨基酸；也就是说，Xaa1可以是除Val、Leu或Ile以外的任何氨基酸。Xaa2 (位置A14)可以是Tyr (如野生型胰岛素中)或Glu。Xaa3 (位置A21)可以是Asn、Asp、Ala或Gly。进一步设想，Xaa13 (位置A13)可以是Leu (如野生型人胰岛素中)或被Trp或Tyr取代。
SEQ ID NO:5
B链
Xaa4-Xaa5-Xaa6可以是如野生型人胰岛素中的Phe-Val-Asn或N-端缺失的变体Val-Asn (des-B1)、Asn (des-B1, B2)或被省略(des-B1-B3)；其中Xaa7是五氟苯丙氨酸，其中芳族环中的五个氢原子同时被氟(F)取代的苯丙氨酸的衍生物；其中Xaa8 (位置B28)可以是Pro (如野生型中)、Lys、Ala、Asp、Glu或Gln；其中Xaa9 (位置B29)可以是Lys (如野生型人胰岛素中)、Pro (如胰岛素赖脯胰岛素中)、Glu (如胰岛素谷赖胰岛素(glulisine))、鸟氨酸(Orn；非标准氨基酸)、Ala或Gln；且其中任选地Xaa10-Xaa11提供B链的C-端单肽或二肽延伸，使得至少一个氨基酸含有酸性侧链。进一步设想，Xaa12 (位置B10)可以是Glu，而不是Asp (如野生型人胰岛素中)。
本发明的胰岛素类似物的氨基酸序列部分地在SEQ ID NO:4和5的实例中给出，其含有完整的B链或含有N-端截短的B链)。为了简洁起见，仅提供相对于野生型人胰岛素的具体修饰(即，序列特征Xaa1、Xaa2、Xaa3、Xaa4、Xaa5、Xaa6、Xaa7、Xaa8、Xaa9、Xaa10和Xaa11的具体实例)。在这些实施方案的每个中，残基位置B10是Asp，且残基Xaa7 (位置B24)是五氟-Phe (5F-PheB24)：
· AspB10和GluB29-胰岛素 (除了5F-PheB24以外)；
· GluA8、AspB10、GluB29-胰岛素 (除了5F-PheB24以外)；
· GluB31、GluB32-延伸形式的GluA8、AspB10和GluB29-胰岛素 (除了5F-PheB24以外)；
· GluB31、GluB32-延伸形式的AspB10、GluB29-胰岛素 (除了5F-PheB24以外)；
· GluB31、GluB32-延伸形式的GluA8、AspB10、GluB29-胰岛素 (除了5F-PheB24以外)；
· HisA8、AspB10、GluB29-胰岛素 (除了5F-PheB24以外)；
· GluB31、GluB32-延伸形式的HisA8、AspB10和GluB29-胰岛素 (除了5F-PheB24以外)；
· GluB31、GluB32-延伸形式的AspB10和GluB29-胰岛素 (除了5F-PheB24以外)；
· AspB10和OrnB29-胰岛素 (除了5F-PheB24以外)；
· GluA8、AspB10、OrnB29-胰岛素 (除了5F-PheB24以外)；
· GluB31、GluB32-延伸形式的GluA8、AspB10和OrnB29-胰岛素 (除了5F-PheB24以外)；
· GluB31、GluB32-延伸形式的AspB10、OrnB29-胰岛素 (除了5F-PheB24以外)；
· GluB31、GluB32-延伸形式的GluA8、AspB10、OrnB29-胰岛素 (除了5F-PheB24以外)；
· HisA8、AspB10、OrnB29-胰岛素 (除了5F-PheB24以外)；
· GluB31、GluB32-延伸形式的HisA8、AspB10和OrnB29-胰岛素 (除了5F-PheB24以外)；
· GluB31、GluB32-延伸形式的AspB10和OrnB29-胰岛素 (除了5F-PheB24以外)；
· AspB10、LysB28和ProB29-胰岛素 (除了5F-PheB24以外)；
· GluA8、AspB10、LysB28和ProB29- (除了5F-PheB24以外)；
· GluB31、GluB32-延伸形式的GluA8、AspB10、LysB28和ProB29-胰岛素 (除了5F-PheB24以外)；
· GluB31、GluB32-延伸形式的AspB10、LysB28和ProB29-胰岛素 (除了5F-PheB24以外)；
· GluB31、GluB32-延伸形式的GluA8、AspB10、LysB28和ProB29-胰岛素 (除了5F-PheB24以外)；
· HisA8、AspB10、LysB28和ProB29-胰岛素 (除了5F-PheB24以外)
· GluB31、GluB32-延伸形式的HisA8、AspB10、LysB28和ProB29-胰岛素 (除了5F-PheB24以外)；
· GluB31、GluB32-延伸形式的AspB10和OrnB29-胰岛素 (除了5F-PheB24以外)；
· AspB10和AspB28-胰岛素 (除了5F-PheB24以外)；
· GluA8、AspB10、AspB28-胰岛素 (除了5F-PheB24以外)；
· GluB31、GluB32-延伸形式的GluA8、AspB10和AspB28-胰岛素 (除了5F-PheB24以外)；
· GluB31、GluB32-延伸形式的AspB10、AspB28-胰岛素 (除了5F-PheB24以外)；
· GluB31、GluB32-延伸形式的GluA8、AspB10、AspB28-胰岛素 (除了5F-PheB24以外)；
· HisA8、AspB10、AspB28-胰岛素 (除了5F-PheB24以外)；
· GluB31、GluB32-延伸形式的HisA8、AspB10和AspB28-胰岛素 (除了5F-PheB24以外)；
· GluB31、GluB32-延伸形式的AspB10和AspB28-胰岛素 (除了5F-PheB24以外)；
· AspB10、AspB28和OrnB29-胰岛素 (除了5F-PheB24以外)；
· GluA8、AspB10、AspB28和OrnB29-胰岛素 (除了5F-PheB24以外)；
· GluB31、GluB32-延伸形式的GluA8、AspB10、AspB28和OrnB29-胰岛素 (除了5F-PheB24以外)；
· GluB31、GluB32-延伸形式的AspB10、AspB28和OrnB29-胰岛素 (除了5F-PheB24以外)；
· GluB31、GluB32-延伸形式的GluA8、AspB10、AspB28和OrnB29-胰岛素 (除了5F-PheB24以外)；
· HisA8、AspB10、AspB28和OrnB29-胰岛素 (除了5F-PheB24以外)；
· GluB31、GluB32-延伸形式的HisA8、AspB10、AspB28和OrnB29-胰岛素 (除了5F-PheB24以外)；
· GluB31、GluB32-延伸形式的AspB10和AspB28-胰岛素 (除了5F-PheB24以外)。
本发明的类似物，诸如SEQ ID NO 4和5的那些，可以任选地含有如以下实例中所示的B链的N-端缺失(des-B1、des-B1,B2或des-B1-B3)。这些N-端残基不是受体结合所需的，但它们在生物合成单链前体中的存在被认为增强内质网中天然二硫键配对的效率，并且因此增强生产产率。实例包括：
· AspB10和GluB29-胰岛素的des-(B1-B3)衍生物 (除了5F-PheB24以外)；
· GluA8、AspB10、GluB29-胰岛素的des-(B1-B3) 衍生物(除了5F-PheB24以外)；
· GluB31、GluB32-延伸形式的GluA8、AspB10和GluB29-胰岛素的des-(B1-B3) 衍生物 (除了5F-PheB24以外)；
· GluB31、GluB32-延伸形式的AspB10、GluB29-胰岛素的des-(B1-B3)衍生物 (除了5F-PheB24以外)；
· GluB31、GluB32-延伸形式的GluA8、AspB10、GluB29-胰岛素的des-(B1-B3)衍生物 (除了5F-PheB24以外)；
· HisA8、AspB10、GluB29-胰岛素的des-(B1-B3)衍生物 (除了5F-PheB24以外)；
· GluB31、GluB32-延伸形式的HisA8、AspB10和GluB29-胰岛素的des-(B1-B3)衍生物 (除了5F-PheB24以外)；
· GluB31、GluB32-延伸形式的AspB10和GluB29-胰岛素的des-(B1-B3)衍生物 (除了5F-PheB24以外)；
· AspB10和OrnB29-胰岛素的des-(B1-B3)衍生物 (除了5F-PheB24以外)；
· GluA8、AspB10、OrnB29-胰岛素的des-(B1-B3)衍生物 (除了5F-PheB24以外)；
· GluB31、GluB32-延伸形式的GluA8、AspB10和OrnB29-胰岛素的des-(B1-B3)衍生物 (除了5F-PheB24以外)；
· GluB31、GluB32-延伸形式的AspB10、OrnB29-胰岛素的des-(B1-B3)衍生物 (除了5F-PheB24以外)；
· GluB31、GluB32-延伸形式的GluA8、AspB10、OrnB29-胰岛素的des-(B1-B3)衍生物 (除了5F-PheB24以外)；
· HisA8、AspB10、OrnB29-胰岛素的des-(B1-B3)衍生物 (除了5F-PheB24以外)；
· GluB31、GluB32-延伸形式的HisA8、AspB10和OrnB29-胰岛素的des-(B1-B3)衍生物 (除了5F-PheB24以外)；
· GluB31、GluB32-延伸形式的AspB10和OrnB29-胰岛素的des-(B1-B3)衍生物 (除了5F-PheB24以外)；
· AspB10、LysB28和ProB29-胰岛素的des-(B1-B3)衍生物 (除了5F-PheB24以外)；
· GluA8、AspB10、LysB28和ProB29-的des-(B1-B3)衍生物 (除了5F-PheB24以外)；
· GluB31、GluB32-延伸形式的GluA8、AspB10、LysB28和ProB29-胰岛素的des-(B1-B3)衍生物 (除了5F-PheB24以外)；
· GluB31、GluB32-延伸形式的AspB10、LysB28和ProB29-胰岛素的des-(B1-B3)衍生物 (除了5F-PheB24以外)；
· GluB31、GluB32-延伸形式的GluA8、AspB10、LysB28和ProB29-胰岛素的des-(B1-B3)衍生物 (除了5F-PheB24以外)；
· HisA8、AspB10、LysB28和ProB29-胰岛素的des-(B1-B3)衍生物 (除了5F-PheB24以外)；
· GluB31、GluB32-延伸形式的HisA8、AspB10、LysB28和ProB29-胰岛素的des-(B1-B3)衍生物 (除了5F-PheB24以外)；
· GluB31、GluB32-延伸形式的AspB10和OrnB29-胰岛素 (除了5F-PheB24以外)；
· AspB10和AspB28-胰岛素的des-(B1-B3)衍生物 (除了5F-PheB24以外)；
· GluA8、AspB10、AspB28-胰岛素的des-(B1-B3)衍生物 (除了5F-PheB24以外)；
· GluB31、GluB32-延伸形式的GluA8、AspB10和AspB28-胰岛素 (除了5F-PheB24以外)；
· GluB31、GluB32-延伸形式的AspB10、AspB28-胰岛素的des-(B1-B3)衍生物 (除了5F-PheB24以外)；
· GluB31、GluB32-延伸形式的GluA8、AspB10、AspB28-胰岛素的des-(B1-B3)衍生物 (除了5F-PheB24以外)；
· HisA8、AspB10、AspB28-胰岛素的des-(B1-B3)衍生物 (除了5F-PheB24以外)；
· GluB31、GluB32-延伸形式的HisA8、AspB10和AspB28-胰岛素的des-(B1-B3)衍生物 (除了5F-PheB24以外)；
· GluB31、GluB32-延伸形式的AspB10和AspB28-胰岛素的des-(B1-B3)衍生物 (除了5F-PheB24以外)；
· AspB10、AspB28和OrnB29-胰岛素的des-(B1-B3)衍生物 (除了5F-PheB24以外)；
· GluA8、AspB10、AspB28和OrnB29-胰岛素的des-(B1-B3)衍生物 (除了5F-PheB24以外)；
· GluB31、GluB32-延伸形式的GluA8、AspB10、AspB28和OrnB29-胰岛素的des-(B1-B3)衍生物 (除了5F-PheB24以外)；
·GluB31、GluB32-延伸形式的AspB10、AspB28和OrnB29-胰岛素的des-(B1-B3)衍生物 (除了5F-PheB24以外)；
· GluB31、GluB32-延伸形式的GluA8、AspB10、AspB28和OrnB29-胰岛素的des-(B1-B3)衍生物 (除了5F-PheB24以外)；
· HisA8、AspB10、AspB28和OrnB29-胰岛素的des-(B1-B3)衍生物 (除了5F-PheB24以外)；
· GluB31、GluB32-延伸形式的HisA8、AspB10、AspB28和OrnB29-胰岛素的des-(B1-B3)衍生物 (除了5F-PheB24以外)；
· GluB31、GluB32-延伸形式的AspB10和AspB28-胰岛素的des-(B1-B3)衍生物 (除了5F-PheB24以外)。
以下DNA序列编码单链胰岛素类似物，并且密码子是针对巴斯德毕赤酵母中的使用模式优化的。这些单链胰岛素类似物提供用于产生上述双链胰岛素类似物的生物合成中间体。在每种情况下，最终密码子(AAT)代表终止密码子。
编码具有取代AspB10和GluB30且具有C-结构域Trp-Lys的53-残基单链胰岛素类似物的基因的有义链在SEQ ID NO:6中给出。
SEQ ID NO:6
编码具有取代AspB10和AlaB30且具有C-结构域Ala-Lys的53-残基单链胰岛素类似物的基因的有义链在SEQ ID NO:7中给出。
SEQ ID NO:7
编码具有取代AspB10、GluA8和GluB30且具有C-结构域Trp-Lys的53-残基单链胰岛素类似物的基因的有义链在SEQ ID NO:8中给出。
SEQ ID NO:8
SEQ ID NO:9中给出了编码具有取代AspB10和GluB30且具有C-结构域Trp-Lys的53-残基单链胰岛素类似物的基因的有义链，使得非标准氨基酸可以通过在密码子位置B24 (TAG)的无义抑制而插入。
SEQ ID NO:9
SEQ ID NO:10中给出编码具有取代GluA8、AspB10和GluB30且具有C-结构域Trp-Lys的53-残基单链胰岛素类似物的基因的有义链，使得非标准氨基酸可以通过在密码子位置B24 (TAG)的无义抑制而插入。
SEQ ID NO:10
SEQ ID NO:11-15中提供的合成基因组群提供DNA序列的集合，其任选地编码根据上文所述氨基酸序列，在位置A13和A14的任选的氨基酸取代。本领域已知在酵母的核基因中，亮氨酸由DNA密码子TTA、TTG、CTT、CTC和CTG编码；酪氨酸由DNA密码子TAT和TAC编码；色氨酸由DNA密码子TGG编码；且谷氨酸由DNA密码子GAA和GAG编码。
SEQ ID NO:11提供编码具有取代AspB10和GluB30且具有C-结构域Trp-Lys的53-残基单链胰岛素类似物的基因的有义链，使得在位置A13的密码子(XXX1)编码亮氨酸、酪氨酸或色氨酸且使得在位置A14的密码子(XXX2)编码酪氨酸或谷氨酸。
SEQ ID NO:11
XXX1是TTA、TTG、CTT、CTC、CTG、TAT、TAC或TGG
XXX2是TAT、TAC、GAA或GAG。
SEQ ID NO:12提供编码具有取代AspB10和AlaB30且具有C-结构域Ala-Lys的53-残基单链胰岛素类似物的基因的有义链，使得在位置A13的密码子(XXX1)编码亮氨酸、酪氨酸或色氨酸且在位置A14的密码子(XXX2)编码酪氨酸或谷氨酸。
SEQ ID NO:12
XXX1是TTA、TTG、CTT、CTC、CTG、TAT、TAC或TGG
XXX2是TAT、TAC、GAA或GAG。
SEQ ID NO:13提供编码具有取代AspB10、GluA8和GluB30且具有C-结构域Trp-Lys的53-残基单链胰岛素类似物的基因的有义链，使得在位置A13的密码子(XXX1)编码亮氨酸、酪氨酸或色氨酸且使得在位置A14的密码子(XXX2)编码酪氨酸或谷氨酸。
SEQ ID NO:13
XXX1是TTA、TTG、CTT、CTC、CTG、TAT、TAC或TGG
XXX2是TAT、TAC、GAA或GAG。
SEQ ID NO:14提供编码具有取代AspB10和GluB30且具有C-结构域Trp-Lys的53-残基单链胰岛素类似物的基因的有义链，使得非标准氨基酸可以通过在密码子位置B24 (TAG)的无义抑制而插入，使得在位置A13的密码子(XXX1)编码亮氨酸、酪氨酸或色氨酸且使得在位置A14的密码子(XXX2)编码酪氨酸或谷氨酸。
SEQ ID NO:14
XXX1是TTA、TTG、CTT、CTC、CTG、TAT、TAC或TGG
XXX2是TAT、TAC、GAA或GAG。
SEQ ID NO:15提供编码具有取代GluA8、AspB10和GluB30且具有C-结构域Trp-Lys的53-残基单链胰岛素类似物的基因的有义链，使得非标准氨基酸可以通过在密码子位置B24 (TAG)的无义抑制而插入，使得在位置A13的密码子(XXX1)编码亮氨酸、酪氨酸或色氨酸且使得在位置A14的密码子(XXX2)编码酪氨酸或谷氨酸。
SEQ ID NO:15
XXX1是TTA、TTG、CTT、CTC、CTG、TAT、TAC或TGG
XXX2是TAT、TAC、GAA或GAG。
以下提供的合成序列SEQ ID NO:16-30的以下组合提供DNA序列的集合，除了SEQ ID NO:11-15中定义的序列特征以外，其任选地编码在以下三个密码子位置之一处的赖氨酸残基：B1、B2或B3；生物合成单链胰岛素前体中的此类赖氨酸取代将能够产生本发明的胰岛素类似物，其B链含有根据上文所述氨基酸序列的N-端缺失des-B1、des-B1, B2或des-B1-B3。这些N-端截短分别通过在生物合成单链胰岛素前体中的位置B1、B2或B3处的赖氨酸的取代来引导。本领域已知在酵母的核基因中，赖氨酸由DNA密码子AAA和AAG (或AAR)编码。如上所示，本领域还已知在酵母的核基因中，亮氨酸由DNA密码子TTA、TTG、CTT、CTC和CTG编码；酪氨酸由DNA密码子TAT和TAC编码；色氨酸由DNA密码子TGG编码；且谷氨酸由DNA密码子GAA和GAG (GAR)编码。
SEQ ID NO:16提供编码具有取代AspB10和GluB30且具有C-结构域Trp-Lys的53-残基单链胰岛素类似物的基因的有义链，使得在位置A13的密码子(XXX1)编码亮氨酸、酪氨酸或色氨酸，使得在位置A14的密码子(XXX2)编码酪氨酸或谷氨酸，且使得B链序列的第一个密码子(AAR)编码赖氨酸。
SEQ ID NO:16
XXX1是TTA、TTG、CTT、CTC、CTG、TAT、TAC或TGG
XXX2是TAT、TAC、GAA或GAG。
SEQ ID NO:17提供编码具有取代AspB10和AlaB30且具有C-结构域Ala-Lys的53-残基单链胰岛素类似物的基因的有义链，使得在位置A13的密码子(XXX1)编码亮氨酸、酪氨酸或色氨酸，使得在位置A14的密码子(XXX2)编码酪氨酸或谷氨酸，且使得B链序列的第一个密码子编码赖氨酸。
SEQ ID NO:17
XXX1是TTA、TTG、CTT、CTC、CTG、TAT、TAC或TGG
XXX2是TAT、TAC、GAA或GAG。
SEQ ID NO:18提供编码具有取代AspB10、GluA8和GluB30且具有C-结构域Trp-Lys的53-残基单链胰岛素类似物的基因的有义链，使得在位置A13的密码子(XXX1)编码亮氨酸、酪氨酸或色氨酸，使得在位置A14的密码子(XXX2)编码酪氨酸或谷氨酸，且使得B链序列的第一个密码子编码赖氨酸。
SEQ ID NO:18
XXX1是TTA、TTG、CTT、CTC、CTG、TAT、TAC或TGG
XXX2是TAT、TAC、GAA或GAG。
以下序列提供编码具有取代AspB10和GluB30且具有C-结构域Trp-Lys的53-残基单链胰岛素类似物的基因的有义链，使得非标准氨基酸可以通过在密码子位置B24 (TAG)的无义抑制而插入，使得在位置A13的密码子(XXX1)编码亮氨酸、酪氨酸或色氨酸，使得在位置A14的密码子(XXX2)编码酪氨酸或谷氨酸，且使得B链序列的第一个密码子编码赖氨酸。
SEQ ID NO:19
XXX1是TTA、TTG、CTT、CTC、CTG、TAT、TAC或TGG
XXX2是TAT、TAC、GAA或GAG。
以下序列提供编码具有取代GluA8、AspB10和GluB30且具有C-结构域Trp-Lys的53-残基单链胰岛素类似物的基因的有义链，使得非标准氨基酸可以通过在密码子位置B24 (TAG)的无义抑制而插入，使得在位置A13的密码子(XXX1)编码亮氨酸、酪氨酸或色氨酸，使得在位置A14的密码子(XXX2)编码酪氨酸或谷氨酸，且使得B链序列的第一个密码子编码赖氨酸。
SEQ ID NO:20
XXX1是TTA、TTG、CTT、CTC、CTG、TAT、TAC或TGG.
XXX2是TAT、TAC、GAA或GAG。
以下序列提供编码具有取代AspB10和GluB30且具有C-结构域Trp-Lys的53-残基单链胰岛素类似物的基因的有义链，使得在位置A13的密码子(XXX1)编码亮氨酸、酪氨酸或色氨酸，使得在位置A14的密码子(XXX2)编码酪氨酸或谷氨酸，且使得B链序列的第二个密码子编码赖氨酸。
SEQ ID NO:21
XXX1是TTA、TTG、CTT、CTC、CTG、TAT、TAC或TGG
XXX2是TAT、TAC、GAA或GAG。
以下序列提供编码具有取代AspB10和AlaB30且具有C-结构域Ala-Lys的53-残基单链胰岛素类似物的基因的有义链，使得在位置A13的密码子(XXX1)编码亮氨酸、酪氨酸或色氨酸，使得在位置A14的密码子(XXX2)编码酪氨酸或谷氨酸，且使得B链序列的第二个密码子编码赖氨酸。
SEQ ID NO:22
XXX1是TTA、TTG、CTT、CTC、CTG、TAT、TAC或TGG
XXX2是TAT、TAC、GAA或GAG。
以下序列提供编码具有取代AspB10、GluA8和GluB30且具有C-结构域Trp-Lys的53-残基单链胰岛素类似物的基因的有义链，使得在位置A13的密码子(XXX1)编码亮氨酸、酪氨酸或色氨酸，使得在位置A14的密码子(XXX2)编码酪氨酸或谷氨酸，且使得B链序列的第二个密码子编码赖氨酸。
SEQ ID NO:23
XXX1是TTA、TTG、CTT、CTC、CTG、TAT、TAC或TGG
XXX2是TAT、TAC、GAA或GAG。
以下序列提供编码具有取代AspB10和GluB30且具有C-结构域Trp-Lys的53-残基单链胰岛素类似物的基因的有义链，使得非标准氨基酸可以通过在密码子位置B24 (TAG)处的无义抑制而插入，使得在位置A13的密码子(XXX1)编码亮氨酸、酪氨酸或色氨酸，使得在位置A14的密码子(XXX2)编码酪氨酸或谷氨酸，且使得B链序列的第二个密码子编码赖氨酸。
SEQ ID NO:24
XXX1是TTA、TTG、CTT、CTC、CTG、TAT、TAC或TGG
XXX2是TAT、TAC、GAA或GAG。
以下序列提供编码具有取代GluA8、AspB10和GluB30且具有C-结构域Trp-Lys的53-残基单链胰岛素类似物的基因的有义链，使得非标准氨基酸可以通过在密码子位置B24 (TAG)的无义抑制而插入，使得在位置A13的密码子(XXX1)编码亮氨酸、酪氨酸或色氨酸，使得在位置A14的密码子(XXX2)编码酪氨酸或谷氨酸，且使得B链序列的第二个密码子编码赖氨酸。
SEQ ID NO:25
XXX1是TTA、TTG、CTT、CTC、CTG、TAT、TAC或TGG
XXX2是TAT、TAC、GAA或GAG。
以下序列提供编码具有取代AspB10和GluB30且具有C-结构域Trp-Lys的53-残基单链胰岛素类似物的基因的有义链，使得在位置A13的密码子(XXX1)编码亮氨酸、酪氨酸或色氨酸，使得在位置A14的密码子(XXX2)编码酪氨酸或谷氨酸，且使得B链序列的第三个密码子编码赖氨酸。
SEQ ID NO:26
XXX1是TTA、TTG、CTT、CTC、CTG、TAT、TAC或TGG
XXX2是TAT、TAC、GAA或GAG。
以下序列提供编码具有取代AspB10和AlaB30且具有C-结构域Ala-Lys的53-残基单链胰岛素类似物的基因的有义链，使得在位置A13的密码子(XXX1)编码亮氨酸、酪氨酸或色氨酸，使得在位置A14的密码子(XXX2)编码酪氨酸或谷氨酸，且使得B链序列的第三个密码子编码赖氨酸。
SEQ ID NO:27
XXX1是TTA、TTG、CTT、CTC、CTG、TAT、TAC或TGG
XXX2是TAT、TAC、GAA或GAG。
以下序列提供编码具有取代AspB10、GluA8和GluB30且具有C-结构域Trp-Lys的53-残基单链胰岛素类似物的基因的有义链，使得在位置A13的密码子(XXX1)编码亮氨酸、酪氨酸或色氨酸，使得在位置A14的密码子(XXX2)编码酪氨酸或谷氨酸，且使得B链序列的第三个密码子编码赖氨酸。
SEQ ID NO:28
XXX1是TTA、TTG、CTT、CTC、CTG、TAT、TAC或TGG
XXX2是TAT、TAC、GAA或GAG。
以下序列提供编码具有取代AspB10和GluB30且具有C-结构域Trp-Lys的53-残基单链胰岛素类似物的基因的有义链，使得非标准氨基酸可以通过在密码子位置B24 (TAG)处的无义抑制而插入，使得在位置A13的密码子(XXX1)编码亮氨酸、酪氨酸或色氨酸，使得在位置A14的密码子(XXX2)编码酪氨酸或谷氨酸，且使得B链序列的第三个密码子编码赖氨酸。
SEQ ID NO:29
XXX1是TTA、TTG、CTT、CTC、CTG、TAT、TAC或TGG
XXX2是TAT、TAC、GAA或GAG。
以下序列提供编码具有取代GluA8、AspB10和GluB30且具有C-结构域Trp-Lys的53-残基单链胰岛素类似物的基因的有义链，使得非标准氨基酸可以通过在密码子位置B24 (TAG)的无义抑制而插入，使得在位置A13的密码子(XXX1)编码亮氨酸、酪氨酸或色氨酸，使得在位置A14的密码子(XXX2)编码酪氨酸或谷氨酸，且使得B链序列的第三个密码子编码赖氨酸。
SEQ ID NO:30
XXX1是TTA、TTG、CTT、CTC、CTG、TAT、TAC或TGG
XXX2是TAT、TAC、GAA或GAG。
本发明的两种单链胰岛素类似物通过在巴斯德毕赤酵母中生物合成前体多肽来制备；该系统分泌含有天然二硫键和裂解N-端延长肽的折叠蛋白。该前体蛋白的胰蛋白酶裂解产生含有在残基PheB1开始且在ArgB22结束的截短的B链和完整A链的双链胰岛素片段。前体多肽由其序列在SEQ ID NO:4和5的一般描述内的合成基因编码，其在每种情况下都含有取代AspB10，并且可以任选地含有额外取代GluA8、TrpA13、TyrA13和/或GluA14。还设想单链胰岛素前体，其含有位置B24的无义密码子，使得非标准氨基酸取代可以经由工程改造的正交的tRNA合成酶插入；此类前体不会由胰蛋白酶加工，而是由赖氨酸特异性内肽酶切开。
我们设想两个相关的DNA序列的集合可以编码制造中间体，使得(i) 利用在最终位置B29含有谷氨酸的合成C-端B链肽，经由半合成将位置B29的谷氨酸引入胰岛素类似物，或(ii) 位置B29的谷氨酸可以经由标准遗传密码子直接引入单链生物合成前体。
我们进一步设想两个相关的DNA序列的集合可以编码制造中间体，使得(i) 利用在最终位置B24含有五氟-Phe的合成C-端B链肽，经由半合成将位置B24的五氟-Phe引入胰岛素类似物，或(ii) 可以利用位置B24的无义密码子和正交工程改造的tRNA合成酶，经由扩展的遗传密码技术将位置B24的五氟-Phe直接引入单链生物合成前体。
在巴斯德毕赤酵母中生物合成前体多肽之后，本发明的两种单链胰岛素类似物通过胰蛋白酶介导的半合成来制备；该系统分泌含有天然二硫键和裂解N-端延长肽的折叠蛋白。一个实施方案除了位置B24的五氟-Phe以外，还含有取代AspB10、LysB28和ProB29(Sigselin-1)；第二个实施方案除了位置B24的五氟-Phe以外，还含有取代AspB10和OrnB29。该前体蛋白的胰蛋白酶裂解产生含有在残基PheB1开始且在ArgB22结束的截短的B链(SEQ ID NO:5的氨基酸1-22)和完整A链(SEQ ID NO:4)的双链胰岛素片段。Segeselin-1的前体多肽可以由概括为SEQ ID NO:31的多核苷酸编码。
SEQ ID NO:31 (Asp B10, 5F-Phe B24, 赖脯胰岛素)
XXX是TGG或GCN。
还设想单链胰岛素前体，其含有位置B24的无义密码子，使得非标准氨基酸取代可以经由工程改造的正交的tRNA合成酶插入；此类前体不会由胰蛋白酶加工，而是由赖氨酸特异性内肽酶切开。
天然样结构得到保留。Sigselin-1的远UV CD光谱与KP-胰岛素或KP-胰岛素的AspB10-衍生物的远UV CD光谱非常相似。通过CD监测的胍变性探测Sigselin-1的热力学稳定性。该方法如所述(Hua, Q.X.,等人 J. Biol. Chem. 283, 14703-16 (2008))。结果表明，该类似物对于化学变性比野生型胰岛素、KP-胰岛素或KP-胰岛素的AspB10衍生物更稳定(如在25℃和pH 7.4下通过CD-检测的胍变性探测)。去折叠的自由能(ΔGu)如下：WT胰岛素，3.3 kcal/摩尔；胰岛素赖脯胰岛素，2.8 kcal/摩尔；和Sigselin-1，4.8 kcal/摩尔。鉴于由于KP-胰岛素的不稳定性(相对于WT，ΔΔGu 0.5(±0.2) kcal/摩尔)而对Humalog®的配制构成的挑战，Sigselin-1的增强的稳定性(ΔΔGu 1.5(±0.2) kcal/摩尔)预示了稳定的制剂。
软琼脂中的MCF-7集落形成的测定。本领域已知AspB10取代使胰岛素对IR的亲和力增强两倍，阻断锌介导的六聚体组装，并且有利地增加激素的固有稳定性。事实上，由于在治疗一年后在Sprague-Dawley大鼠中的过多乳腺肿瘤的意外观察结果，Novo Nordisk停止了AspB10-胰岛素作为开创性候选快速作用胰岛素的临床开发。相当多的文献接着描述AspB10-胰岛素在人肿瘤细胞系的细胞培养研究中的促有丝分裂活性。为了解决该问题，鉴于本发明的类似物中的AspB10 (或实施方案的替代集合中的GluB10)的存在，进行促有丝分裂性的测定，如下所述。
这一背景促动了胰岛素类似物刺激人乳腺癌细胞系MCF-7的增殖的能力的比较研究。本领域已知MCF-7细胞表达三种同源受体(IR-A、IR-B和IGF-1R)，并且因此提供胰岛素反应性恶性肿瘤的模型，具有IGF-I > AspB10-胰岛素>野生型胰岛素的相对促有丝分裂性。在我们的初步测定中，将MCF-7细胞(0.75ml中的1.5 x 103个细胞，获得自ATCC目录号HTB-22)与等体积的Bacto-琼脂在42℃下混合。将该0.3％琼脂悬浮液倒入12孔板中的0.6％琼脂的1.5-ml基质上，并用有(或无)蛋白浓度为100nM的胰岛素或胰岛素类似物的基础生长培养基覆盖，其每周补充3次。将板在37℃下在CO2组织培养箱中孵育3周，此时将集落用结晶紫染色并在倒置显微镜下计数。阳性对照由IGF-I提供(未显示)，并且阴性对照由缺乏胰岛素或胰岛素类似物的培养基提供(图6中的“基础”)。尽管根据公开的研究，高剂量的WT胰岛素增强MCF-7细胞增殖，但我们的结果表明，Sigselin-1 (图6中标记为“5F-DKP”)表现出可忽略的促有丝分裂性，其与相关的缺少AspB10的五氟-PheB24类似物(“5F-POT”)的促有丝分裂性不可区分，且与人胰岛素原(“HPI”)和无活性类似物LeuA3-胰岛素的可忽略的活性一致。
生物活性和药效动力学在通过链脲霉素而致糖尿病的雄性Lewis大鼠(约300g)中测试(图7)。相对于Humalog®和胰岛素赖脯胰岛素的AspB10衍生物(DKP-胰岛素)，评估各自含有核心的三个取代(在其它任选的设计元件存在或不存在的情况下的AspB10、AlaB12和GluB29)的四种代表性胰岛素类似物的皮下(s.q.)注射的PD影响；所得的血液-葡萄糖浓度的总体概况表明，Sigselin-1的PD特性与Humalog®的PD特性类似，但在定义的蛋白剂量(以纳摩尔定义)，使得1个单位的Sigselin-1需要多达1个单位的KP-胰岛素的三倍的蛋白分子。在这些测定中，皮下注射(SQ)大鼠；从夹尾的尾尖部以连续间隔获得血液。分别绘制平均血液-葡萄糖(BG)浓度和距初始BG的百分比变化(图7A和7B)。对4种不同剂量的Sigselin-1和赖脯胰岛素重复研究(图7C和7D中的绝对和百分比变化)以测定每mg (其在市售的胰岛素产品中不同)的功效(定义为在SQ注射后的前60分钟内BG的下降)。
这些数据显示，尽管胰岛素赖脯胰岛素的五氟-PheB24 (5F-PheB24)衍生物表现出可忽略的生物学活性(图7A和7B中的菱形)，但生物活性通过相对于胰岛素赖脯胰岛素(KP-胰岛素；正方形)的共同修饰HisB10→Asp (圆形)而得到拯救。AspB10还增强KP-胰岛素的活性，但方式不那么急剧(菱形)。5F-PheB24-AspB10-KP-胰岛素(Sigselin-1)相对于KP-胰岛素的剂量-反应研究证实，需要三倍纳摩尔的Sigselin以达到等效的治疗效果，对于目前的胰岛素产品地特胰岛素(detemir; Levemir®; Novo-Nordisk)也是如此。
总之，上述基于细胞和基于大鼠的发现提供了证据，证明Sigselin-1可以引导导致治疗性低血糖反应的信号传导事件，而不刺激胰岛素反应性和IGF-1反应性人癌细胞系中的促有丝分裂途径。
非糖尿病Sprague-Dawley大鼠中的选择性信号传导的证据。在内源β-细胞胰岛素分泌被奥曲肽(生长抑素类似物)抑制的非糖尿病大鼠的高胰岛素血糖-正常血糖钳制(HIEC)研究中，调查Sigselin-1的药效动力学(PD)。每组采用4只大鼠。这些基线研究证实，三倍剂量的Sigselin-1输注(以摩尔/min/kg计)赋予与胰岛素赖脯胰岛素相当的治疗强度。
使用氚化-葡萄糖示踪剂技术寻求选择性信号传导的证据。简言之，在对HIEC环境驯化30分钟后，如所述开始[3H-3]-葡萄糖(Perkin-Elmer NEN)的初次连续输注(推注20.8μCi，然后0.52 µCi/min)，并在整个研究中维持。30分钟的示踪剂平衡后，每10分钟取血液样品用于葡萄糖和血浆放射性分析，持续30分钟，以建立基线。使用GM7 Micro-stat分析仪(ANALOX Instruments)，在HIEC期间实时测量BG。在时间零时，开始胰岛素赖脯胰岛素(1.5 mU/kg/min)或Sigselin-1 (以mg/ml计三倍的蛋白)的初次连续输注和25％普通葡萄糖溶液(IVX Animal Health)的可变输注。根据需要调整葡萄糖输注的速率，以将血浆葡萄糖浓度钳制在130-140 mg/dl。在60分钟高胰岛素血症期间，每10分钟取血液样品。在用Ba(OH)2和ZnSO4脱蛋白和蒸发以去除氚化水之后测定来自[3H-3]-葡萄糖的血浆放射性。在60、90、120、150和180分钟测量血浆胰岛素水平。在类似的方案中，我们采用[14C]-2-脱氧葡萄糖(100μL盐水中的20 µCi的[14C]2-脱氧葡萄糖)作为探针，以测量钳制的最终40分钟期间的胰岛素刺激的葡萄糖摄取的组织特异性相对速率(图8中的灰色区域)。
为了评估受体后信号传导偏倚，我们集中在两种肌肉，慢抽搐比目鱼肌和快抽搐趾长伸肌(EDL)。如用[14C]-2-脱氧葡萄糖探测的，这些肌肉中的胰岛素导向的葡萄糖摄取的速率在胰岛素赖脯胰岛素和Sigselin-1之间是相似的，并且类似于媒介物；考虑到这些研究中使用的低剂量的胰岛素，该结果是预期的(图9)。
尽管如此，在目鱼肌中[3H-3]-葡萄糖掺入糖原的相对速率在通过Sigselin-1的信号传导后远远高于在通过赖脯胰岛素的信号传导后(图10，左侧)，尽管WT胰岛素治疗的动物的比目鱼肌中的葡萄糖摄取速率与Sigselin-1治疗的动物相比相等；类似的趋势见于EDL中，但没有达到统计学显著性(N = 4只大鼠)。这些发现是显著的，并且表明葡萄糖衍生的3H-C的流动优先地去往糖原(相对于氧化或脂质合成)。肌肉中的较少脂肪可以降低胰岛素抵抗，其具有重要的临床意义。
治疗患有糖尿病的患者的方法包括施用如本文中所述的双链胰岛素类似物。本发明的另一个方面是，所述双链胰岛素类似物可以在酵母(巴斯德毕赤酵母)中制备或通过天然片段连接进行总化学合成。在非标准修饰(诸如D-氨基酸取代或通过碳水化合物对丝氨酸或苏氨酸的O-连接的修饰)的情况下，合成制备途径是优选的；但是，可行的是借助扩展的遗传密码技术或四碱基密码子技术，制造含有非标准修饰的单链类似物的子集(对于综述，参见Hohsaka, T., & Sisido, M., 2012)。本发明的又另一方面是采用非标准氨基酸取代可以提高双链胰岛素类似物对化学降解或对物理降解的抗性。我们进一步设想，本发明的类似物提供了治疗糖尿病或代谢综合征的方法。该胰岛素类似物的递送途径是通过经由使用注射器或注射笔装置的皮下注射。本发明的胰岛素类似物还可以含有其它修饰，诸如在位置A13和/或A14的取代。本发明的胰岛素类似物还可以含有由于缺失残基B1-B3而缩短的B链，或含有在位置B31的酸性残基或在两个残基延伸B31-B32中的至少一个酸性残基的C-端延伸的B链。
药物组合物可以包含此类胰岛素类似物，并且其可以任选地包括锌。因为本发明的胰岛素类似物不形成经典的锌稳定的六聚体(并且对于稳定性，实际上不需要此组装)，所以可以以低于主要含有胰岛素六聚体的制剂中通常采用的不同的锌离子：蛋白比率包括锌离子；此类比率可以在每摩尔胰岛素类似物0.01-0.10摩尔锌离子的范围内。制剂的pH在pH 7.0-8.0的范围内；可以存在或不存在缓冲剂(通常为磷酸钠或Tris-盐酸盐)。在此类制剂中，所述胰岛素类似物的浓度可通常在约0.6-5.0 mM之间；在试剂瓶或注射笔中可以使用高至5 mM的浓度；更浓缩的制剂(U-200或更高)在具有显著胰岛素抗性的患者中具有特别的益处。赋形剂可以包括甘油、甘氨酸、精氨酸、Tris、其它缓冲液和盐、以及抗微生物防腐剂如苯酚和间甲酚；后一种防腐剂已知提高胰岛素六聚体的稳定性。还可以添加非离子表面活性剂诸如Tween-20以增强物理稳定性。此类药物组合物可用于通过向患有糖尿病或其它病症的患者施用生理有效量的所述组合物来治疗该患者。
基于上述公开内容，现在应当清楚的是，提供的双链胰岛素类似物将实现上文列举的目标。也就是说，这些胰岛素类似物表现出与野生型胰岛素的生物活性类似的生物活性(如通过皮下或静脉内注射后，降低哺乳动物中的血液-葡萄糖浓度所需的蛋白单体的纳摩尔数所定义)，从而保持快速作用并减少促有丝分裂性。因此应理解的是，任何变化显然落在要求保护的本发明的范围内，并且由此可以确定特定组分要素的选择，而不脱离开本文中公开和描述的本发明的精神。
引用下列文献以证明本领域普通技术人员将理解本文中描述的测试和分析方法。
序列表
<110> CASE WESTERN RESERVE UNIVERSITY
<120> 具有选择性信号传导特性和降低的促有丝分裂性的胰岛素类似物
<130> 200512-00327
<150> 62/105,713
<151> 2015-01-20
<160> 31
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 86
<212> PRT
<213> 智人
<400> 1
Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr
1 5 10 15
Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Lys Thr Arg Arg
20 25 30
Glu Ala Glu Asp Leu Gln Val Gly Gln Val Glu Leu Gly Gly Gly Pro
35 40 45
Gly Ala Gly Ser Leu Gln Pro Leu Ala Leu Glu Gly Ser Leu Gln Lys
50 55 60
Arg Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys Thr Ser Ile Cys Ser Leu Tyr Gln
65 70 75 80
Leu Glu Asn Tyr Cys Asn
85
<210> 2
<211> 21
<212> PRT
<213> 智人
<400> 2
Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys Thr Ser Ile Cys Ser Leu Tyr Gln Leu
1 5 10 15
Glu Asn Tyr Cys Asn
20
<210> 3
<211> 30
<212> PRT
<213> 智人
<400> 3
Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr
1 5 10 15
Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Lys Thr
20 25 30
<210> 4
<211> 21
<212> PRT
<213> 智人
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<223> Xaa是除Val, Leu或Ile以外的任何氨基酸
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Glu Asn Tyr Cys Xaa
20
<210> 5
<211> 32
<212> PRT
<213> 智人
<220>
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<223> Xaa是Phe-Val-Asn, Val-Asn, Asn或无氨基酸
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<223> Xaa是Glu或Asp
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<223> Xaa是五氟-苯丙氨酸
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Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Xaa Phe Tyr Thr Xaa Xaa Thr Xaa Xaa
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gagagaggat tcttctacac ccctaaggct gctaagggaa tcgttgagca atgctgtact 120
tccatctgct cannnnnnca attggagaac tactgcaact aa 162
<210> 23
<211> 162
<212> DNA
<213> 智人
<220>
<221> misc_feature
<222> (133)..(135)
<223> NNN是TTA, TTG, CTT, CTC, CTG, TAT, TAC或TGG
<220>
<221> misc_feature
<222> (136)..(138)
<223> NNN是TAT, TAC, GAA或GAG
<400> 23
ttcaaraatc aacacttgtg tggtagtgac ttggtcgagg cattgtactt ggtctgtggt 60
gagagaggat tcttctacac cccaaaggag tggaagggta tcgttgagca atgttgtgaa 120
tccatctgct cannnnnnca attggagaac tactgcaact aa 162
<210> 24
<211> 162
<212> DNA
<213> 智人
<220>
<221> misc_feature
<222> (133)..(135)
<223> NNN是TTA, TTG, CTT, CTC, CTG, TAT, TAC或TGG
<220>
<221> misc_feature
<222> (136)..(138)
<223> NNN是TAT, TAC, GAA或GAG
<400> 24
ttcaaraatc aacacttgtg tggtagtgac ttggtcgagg cattgtactt ggtctgtggt 60
gagagaggat agttctacac cccaaaggag tggaagggta tcgttgagca atgttgtact 120
tccatctgct cannnnnnca attggagaac tactgcaact aa 162
<210> 25
<211> 162
<212> DNA
<213> 智人
<220>
<221> misc_feature
<222> (133)..(135)
<223> NNN是TTA, TTG, CTT, CTC, CTG, TAT, TAC或TGG
<220>
<221> misc_feature
<222> (136)..(138)
<223> NNN是TAT, TAC, GAA或GAG
<400> 25
ttcaaraatc aacacttgtg tggtagtgac ttggtcgagg cattgtactt ggtctgtggt 60
gagagaggat agttctacac cccaaaggag tggaagggta tcgttgagca atgttgtgaa 120
tccatctgct cannnnnnca attggagaac tactgcaact aa 162
<210> 26
<211> 162
<212> DNA
<213> 智人
<220>
<221> misc_feature
<222> (133)..(135)
<223> NNN是TTA, TTG, CTT, CTC, CTG, TAT, TAC或TGG
<220>
<221> misc_feature
<222> (136)..(138)
<223> NNN是TAT, TAC, GAA或GAG
<400> 26
ttcgtcaarc aacacttgtg tggtagtgac ttggtcgagg cattgtactt ggtctgtggt 60
gagagaggat agttctacac cccaaaggag tggaagggta tcgttgagca atgttgtact 120
tccatctgct cannnnnnca attggagaac tactgcaact aa 162
<210> 27
<211> 162
<212> DNA
<213> 智人
<220>
<221> misc_feature
<222> (133)..(135)
<223> NNN是TTA, TTG, CTT, CTC, CTG, TAT, TAC或TGG
<220>
<221> misc_feature
<222> (136)..(138)
<223> NNN是TAT, TAC, GAA或GAG
<400> 27
ttcgtcaarc aacacttgtg tggtagtgac ttggtcgagg ctttgtactt ggtctgtggt 60
gagagaggat tcttctacac ccctaaggct gctaagggaa tcgttgagca atgctgtact 120
tccatctgct cannnnnnca attggagaac tactgcaact aa 162
<210> 28
<211> 162
<212> DNA
<213> 智人
<220>
<221> misc_feature
<222> (133)..(135)
<223> NNN是TTA, TTG, CTT, CTC, CTG, TAT, TAC或TGG
<220>
<221> misc_feature
<222> (136)..(138)
<223> NNN是TAT, TAC, GAA或GAG
<400> 28
ttcgtcaarc aacacttgtg tggtagtgac ttggtcgagg cattgtactt ggtctgtggt 60
gagagaggat tcttctacac cccaaaggag tggaagggta tcgttgagca atgttgtgaa 120
tccatctgct cannnnnnca attggagaac tactgcaact aa 162
<210> 29
<211> 162
<212> DNA
<213> 智人
<220>
<221> misc_feature
<222> (133)..(135)
<223> NNN是TTA, TTG, CTT, CTC, CTG, TAT, TAC或TGG
<220>
<221> misc_feature
<222> (136)..(138)
<223> NNN是TAT, TAC, GAA或GAG
<400> 29
ttcgtcaarc aacacttgtg tggtagtgac ttggtcgagg cattgtactt ggtctgtggt 60
gagagaggat agttctacac cccaaaggag tggaagggta tcgttgagca atgttgtact 120
tccatctgct cannnnnnca attggagaac tactgcaact aa 162
<210> 30
<211> 162
<212> DNA
<213> 智人
<220>
<221> misc_feature
<222> (133)..(135)
<223> NNN是TTA, TTG, CTT, CTC, CTG, TAT, TAC或TGG
<220>
<221> misc_feature
<222> (136)..(138)
<223> NNN是TAT, TAC, GAA或GAG
<400> 30
ttcgtcaarc aacacttgtg tggtagtgac ttggtcgagg cattgtactt ggtctgtggt 60
gagagaggat agttctacac cccaaaggag tggaagggta tcgttgagca atgttgtgaa 120
tccatctgct cannnnnnca attggagaac tactgcaact aa 162
<210> 31
<211> 162
<212> DNA
<213> 智人
<220>
<221> misc_feature
<222> (87)..(87)
<223> n是a, c, g,或t
<220>
<221> misc_feature
<222> (90)..(90)
<223> n是a, c, g,或t
<220>
<221> misc_feature
<222> (91)..(93)
<223> NNN是TGG或GCN
<220>
<221> misc_feature
<222> (99)..(99)
<223> n是a, c, g,或t
<400> 31
ttcgtcaatc aacacttgtg tggtagtgac ttggtcgagg cattgtactt ggtctgtggt 60
gagagaggat agttctacac caarccnacn nnnaarggna tcgttgagca atgttgtact 120
tccatctgct cattgtacca attggagaac tactgcaact aa 162