技术领域
本发明涉及一种糖胺聚糖类化合物硫酸化的方法，具体来说，涉及一种在微波作用下，对糖胺聚糖类化合物中未保护的羟基和氨基位点进行完全硫酸化(N,O-同时硫酸化)修饰制备肝素类化合物的方法。
背景技术
肝素(Heparin)是一种高度硫酸化的天然黏多聚糖，由重复的二糖单元：1-4连接的糖醛酸(α-L-艾杜糖醛酸或者β-D-葡萄糖醛酸)与己糖胺(α-D-氨基葡萄糖)交替连接而成。肝素类分子在体内和体外都有抗凝血作用，应用于临床治疗抗血栓和心血管疾病已经有近六十年历史。此外肝素还具有降血脂、抗动脉粥样硬化、抗中膜平滑肌细胞(SMC)增生、抗炎、抗过敏、抗病毒、抗癌等多种生物学功能，因此，其在医学上的应用非常广泛。
天然肝素本身就是混合物，经过降解处理的肝素片段结构更加多样性，很难提纯得到单一结构的肝素片段，这样就无法确定与蛋白作用的是肝素糖链中哪一段特征片段，往往因混合物中某一组分起促进作用，另一组分起抑制作用，使其表现出来的实验结果令人费解。显而易见，获得结构确定的肝素样品会给肝素的生物学研究带来极大的方便。
磺达肝素钠(Fondaparinux Sodium)是肝素类分子中最为有名的一个，由法国赛诺菲公司开发的一种具有高选择性Xa因子抑制剂。它是由化学合成的结构确定的肝素五糖片段，为目前副作用最小，最为高效的高选择性Xa因子抑制剂。它的作用机理是通过与抗凝血酶III(ATIII)结合，选择性抑制Xa因子而发挥抗血栓作用。它不会使凝血酶失活，也不影响血小板的功能。磺达肝素钠已被转让给葛兰素史克公司(GSK)，并于2001年获准在欧洲上市，2002年在美国上市，2008年在中国上市。
肝素类寡糖合成中的一大难点是对需要硫酸化的羟基和氨基位点进行完全硫酸化修饰。多位点的硫酸化反应很难进行完全。单独在羟基或者氨基上引入硫酸根不是很难，然而同时进行多个羟基和氨基位点的硫酸化就非常困难，常常会出现反应不完全的副产物(Eur.J.Org.Chem.2005,1849-1858)。目前，文献中的肝素合成通常采用分步硫酸化修饰：先将需要硫酸化的羟基选择性脱保护，然后进行O-硫酸化，接着Staudinger还原叠氮基团，再进行N-硫酸化。这样需要进行两步硫酸化反应，采取三次反相柱层析(O-硫酸化，Staudinger还原，N-硫酸化)，费时耗力。(J.Am.Chem.Soc.2009,129,17394-17405；Chem.Eur.J.2006,12,8664-8686，Chem.Eur.J.2010,16,8365)例如磺达肝素钠由于其结构复杂，分子有八个硫酸化位点，需要分别进行氧硫酸化和氮硫酸化，反应时间冗长，产率中等，并且分离困难。
在一步反应中对N,O同时硫酸化的尝试也有一些报道，(Chem.Eur.J.2004,10,4265-4282；J.Comb.Chem.2008,10,166–169；Chem.Eur.J.2006,12,8664-8686；Carbohydrate Research 2008,343,2853-2862；)但是要么硫酸化不彻底，得不到目标化合物，且增加了TLC监测和分离难度；要么适用范围很差，无法推广应用。
2012年中国专利“制备肝素五糖的新中间体及其制备方法”(申请公布号：CN 103360439A)，将合成的五糖的羧酸根和需要硫酸化的羟基和氨基全部脱保护，之后采用连续的分步硫酸化方法，其反应路线如下：
其中，第一步O-硫酸化需淬灭、分离后才能进行下一步N-硫酸化，得到N,O-硫酸化产物2。最后，采用加压氢化的条件脱除剩余保护基得到最终肝素五糖。该专利依然采取了分步硫酸化的方法，操作复杂，必须重复多次实验才能得到比较纯的完全硫酸化产物；反应时间较长，而且后处理繁琐，同时仅在硫酸化操作和氢化还原全部完成后，才给出结构鉴定的谱图，不适合大规模的工业合成。
因此，亟需一种高效、便捷的N,O-同时硫酸化方法，以简化反应监测、分离和纯化的操作，利于工业生产。
发明内容
本发明的目的是为了克服现有技术中糖胺聚糖类化合物硫酸化反应操作繁琐，多位点的硫酸化反应难以进行完全，使得产物分离分析困难的缺陷，而提供一种微波促进下糖胺聚糖类化合物N,O-同时硫酸化方法的新方法，其反应操作简单，硫酸化完全，反应速度较快且产率较高。
为达到上述目的，本发明提供了一种糖胺聚糖类化合物N,O-同时硫酸化的方法，该方法以糖胺聚糖类化合物I为原料，在微波作用下，碱性溶剂中，用硫酸化试剂处理，反应温度为50-200摄氏度，得到中间体产物II；该糖胺聚糖类化合物由糖醛酸单糖单元与己糖胺单糖单元交替连接构成，单糖单元之间以1→4糖苷键线性连接而成，其反应路线如下：
其中，x＝0-1，y＝0-5，z＝0-1，x,y,z取整数且不同时为0；
R1代表烷基或取代烷基，苄基或取代苄基；优选甲基、苄基或取代苄基；
R2为H或苄基、取代苄基、或者各种酯基、硅基，优选H或苄基，取代苄基或酯基，且同一分子式中的R2可以是相同或不同的基团；
R3代表C1-C20烷基或取代烷基，其中烷基为直链烷基或环状烷基；优选甲基、乙基、丙基、异丙基、丁基、异丁基、叔丁基、戊基、苄基或环己基。
上述的方法，其中，所述硫酸化试剂选自三氧化硫吡啶、三氧化硫·三甲胺、三氧化硫·三乙胺、三氧化硫·1,4-二氧六环、三氧化硫·N,N-二甲基甲酰胺、氯磺酸、三氧化硫气体。所述硫酸化试剂选自三氧化硫三甲胺、三氧化硫三乙胺等较强碱性的试剂时，反应中不加入碱性添加剂也可得到完全硫酸化产物。如加入溶剂体积5-30％的碱性添加剂，可以提高反应的收率。所述硫酸化试剂选自氯磺酸、三氧化硫气体、三氧化硫吡啶、三氧化硫1,4-二氧六环、三氧化硫N,N-二甲基甲酰胺等中性、酸性或弱碱性的试剂时，反应体系中需加入溶剂体积5-30％的碱性添加剂，否则硫酸化反应可能不完全，同时可以提高硫酸化反应的产率。硫酸化试剂与需硫酸化的反应位点的摩尔当量比为1～10：1，较佳的为2～5：1。
上述方法中，反应的时间为1-45分钟。
上述的方法，其中，所述碱性溶剂选自吡啶、取代吡啶、三乙胺的一种或多种(优选吡啶或三乙胺)；反应温度为50-120摄氏度，反应的时间为15-30分钟。
上述的方法，其中，反应中还加入溶剂体积5-30％的碱性添加剂，该碱性添加剂选自胺类溶剂或固体碱，该胺类溶剂包含三乙胺或二异丙基乙基胺，该固体碱包含4-二甲氨基吡啶，碱性添加剂的添料顺序为先加入硫酸化试剂再加入碱性添加剂。所述反应溶剂与有机碱添加剂的体积比为3～100：1，较佳的为8～15：1。总之，需要保证反应体系具有足够的碱性能中和硫酸化反应过程中产生的酸，以利于反应平衡向目标方向进行，得到完全硫酸化产物。
本发明还提供了一种糖胺聚糖类化合物，该糖胺聚糖类化合物由糖醛酸单糖单元与己糖胺单糖单元交替连接构成，单糖单元之间以1→4糖苷键线形连接而成，其结构如下结构式I所示：
其中，x＝0-1，y＝0-5，z＝0-1，x,y,z取整数且不同时为0；
其中，R1、R2与R3的定义与前述相同。
上述的糖胺聚糖类化合物，其中，所述糖醛酸单糖单元为α-L-艾杜糖醛酸或者β-D-葡萄糖醛酸单元，所述己糖胺单糖单元为α-D-氨基葡萄糖单元。
上述的糖胺聚糖类化合物，其中，该糖胺聚糖类化合物的结构为：
其中，R1选自甲基、苄基或取代苄基；R3选自甲基、乙基、丙基、异丙基、丁基、异丁基、叔丁基、戊基、苄基或环己基；R5选自苄基、取代苄基、或者酯基，同一分子式中的R5可以是相同或不同的基团。
上述的糖胺聚糖类化合物，其中，该糖胺聚糖类化合物为下列化合物的任意一种：
本发明还提供了一种上述的糖胺聚糖类化合物在制备肝素中的应用。
本发明还提供了一种上述的方法制备的中间体化合物，该中间体化合物的结构如下结构式II所示：
其中，x＝0-1，y＝0-5，z＝0-1，x,y,z均为整数，且不同时为0；
R1代表烷基或取代烷基，苄基或取代苄基；
R2为OSO3-Na+或苄基、取代苄基、或者各种酯基、硅基，同一分子式中的R2可以是相同或不同的基团；
R3代表C1-C20烷基或取代烷基，其中烷基为直链烷基或环状烷基。
上述的中间体化合物，其中，R1选自甲基、苄基或取代苄基；R2选自OSO3-Na+或苄基、取代苄基、或者酯基，同一分子式中的R2可以是相同或不同的基团；R3选自甲基、乙基、丙基、异丙基、丁基、异丁基、叔丁基、戊基、苄基或环己基。
上述的中间体化合物，其中，该中间体化合物的结构如下式所示：
其中，R1选自甲基、苄基或取代苄基；R3选自甲基、乙基、丙基、异丙基、丁基、异丁基、叔丁基、戊基、苄基或环己基；R5选自苄基、取代苄基、或者酯基，同一分子式中的R5可以是相同或不同的基团。
上述的中间体化合物，其中，该中间体化合物为下列化合物的任意一种：
本发明还提供了一种上述的中间体化合物在制备磺达肝癸钠中的应用。以糖胺聚糖类化合物I为原料，在微波作用下，碱性溶剂中，用硫酸化试剂处理，反应温度为50-200摄氏度，反应的时间为1-45分钟，得到中间体产物II；普通的硫酸化方法都需要在室温或者加热条件下反应较长时间。微波促进的方法能够为反应体系提供高能量，显著地减少反应时间。反应结束后，所得到中间体产物II还可通过后处理步骤进一步纯化。所述的后处理步骤较佳的包括以下步骤：浓缩有机相、柱层析、离子交换即可。所述的柱层析一般采用反相柱层析或者分子排阻凝胶柱Sephadex LH-20进行分离，其步骤和条件均可按常规的步骤和条件进行选择，更佳的，所述反相柱层析采用MeOH/H2O淋洗体系，分子排阻凝胶柱采用DCM/MeOH＝1:1+1％Et3N淋洗体系。所述化合物I为化合物14时，硫酸化优选以下步骤：在微波作用下，吡啶中，化合物26溶解转移到微波反应管后，先加入硫酸化试剂三氧化硫三乙胺，再加入有机碱添加剂三乙胺，80-120℃下，微波反应15-25分钟。然后经过常规后处理得到式26化合物。化合物II经过常规脱保护反应，获得肝素类化合物。其中，化合物26经过常规脱保护反应获得磺达肝癸钠。所述常规脱保护反应根据化合物中存在的保护基采取相应脱保护方法。例如：酯类保护基在LiOOH作用下脱除，苄基保护基通过氢化还原脱除。
本发明提供的硫酸化方法，其反应操作简单，N,O-多位点能同时硫酸化，硫酸化完全，反应速度较快且产率较高，适合工业化生产。
具体实施方式
下面通过实施例的方式进一步说明本发明，但并不因此将本发明限制在所述的实施例范围之中。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规方法和条件，或按照商品说明书选择。
硫酸化底物按照以下方法制备：
以全乙酰氨基葡萄糖27为原料，通过常规保护基操作(参考文献Org.Chem.Front.2014,1,405-414)，制备化合物3，4，5。
以氨基葡萄糖苷和葡萄糖为原料，通过常规保护基操作和糖苷化反应(参考文献Org.Chem.Front.2014,1,405-414；J.Comb.Chem.2008,10,166–169)制备得到硫酸化前体一至五糖片段6,7,8,9,10,11,12,13,14。
具体实验操作和步骤如下：
以化合物3的合成为例：
于25mL蛋形瓶中投入全乙酰化氨基葡萄糖27(500mg,1.28mol)，氘代甲醇(10mL)溶解，冰水浴冷却至0℃，缓慢滴入AcCl(1mL)，充分搅拌15min，油浴升温至90℃，回流过夜，TLC显示原料消失。停止加热，冷至室温，减压旋干溶剂得到黄色糖浆，直接下一步反应。
将上一步糖浆溶解于甲醇(4mL)中，加入CuSO4.5H2O(2mg)和NEt3(0.36mL)，0℃下将新制的TfN3的CH3CN溶液(1.54mmol)慢慢滴加进去，自然升至室温，继续搅拌24h，TLC监测反应完全，加入甘氨酸(100mg)，继续搅拌24h。随后过滤除去过量的甘氨酸，滤液直接旋干，甲苯带水三次后得黄色糖浆，直接用于下一步反应。
将上一步得到黄色糖浆溶解于乙腈(5mL)中，加入苯甲醛二甲基缩醛(224μL,1.48mmol)，然后加入适量CSA调节pH在3左右，室温反应10h。加入三乙胺淬灭反应，减压浓缩甲苯带水三次后得黄色糖浆，直接用于下步反应。
将上一步得到黄色糖浆溶于干燥的DMF(6mL)，冰水浴冷却至0℃，分批加入NaH固体(60％)(108mg,2.8mmol),搅拌0.5h后，缓慢滴加BnBr(224μL,1.84mmol)，室温反应1h后，TLC监测反应完全，加入甲醇淬灭反应。滤液用二氯甲烷稀释后，用饱和NaCl水溶液洗两次，无水Na2SO4干燥。过滤，旋干溶剂，柱层析分离(PE:EA＝8:1)得到3位上了苄基的β型产物28(123mg,0.31mmol)，产率12％；α型产物29(368mg,0.92mmol)，产率36％。
化合物29：1H NMR(400MHz,CDCl3:δ7.49-7.26(m,10H),5.56(s,1H),4.95(d,1H,J＝10.8Hz),4.80-4.75(m,2H),4.27(dd,1H,J＝10.0Hz,4.4Hz),4.05(t,1H,J＝9.2Hz),3.86-3.66(m,3H),3.42(dd,1H,J＝10.0Hz,3.2Hz)；13C NMR(100MHz,CDCl3:δ137.92,137.32,129.11,128.48,128.35,128.29,127.94,127.84,126.09,101.50,99.40,82.83,76.40,75.07,68.98,63.22,62.64；ESI-MS:423.3(M+Na+)。
化合物28：ESI-MS:423.3(M+Na+)。
将化合物28(72mg,0.18mmol)置于蛋形瓶中，冰浴冷却，加入1M BH3·THF(1.8mL)，搅拌五分钟，加入1M Bu2BOTf的二氯甲烷溶液(0.18mL)，冰浴下反应2h，TLC显示反应完全。加入0.2mL三乙胺后，缓慢滴加甲醇淬灭反应，减压浓缩，再分别加入甲醇稀释、浓缩三次，柱层析(PE:EA＝3:1)得到无色糖浆(61mg,0.15mmol)，产率85％。ESI-MS(m/z):425.2[M+Na+].
将上一步产物溶于吡啶(0.2M,1mL)和水(0.25mL)，分别加入三乙胺(0.04mL)和丙二硫醇(0.08mL)，室温搅拌。TLC监测原料消失，减压浓缩，之后加入3mL甲苯和乙醇(v/v＝5:1)，减压浓缩三次，柱层析(DCM:MeOH＝20:1+1％Et3N)，得到产物3(56mg,0.15mmol,99％)。产物3：[α]D24＝+3.8(c 0.9,CHCl3)；1H NMR(400MHz,CDCl3)δ7.47–7.18(m,10H),4.97(d,J＝11.3Hz,1H),4.84(d,J＝10.9Hz,1H),4.71(dd,J＝11.1,6.1Hz,2H),4.15(d,J＝7.9Hz,1H),3.88(dd,J＝12.0,2.1Hz,1H),3.76(dd,J＝12.0,4.0Hz,1H),3.66(t,J＝9.3Hz,1H),3.47(t,J＝9.4Hz,1H),3.42–3.33(m,1H),2.80(dd,J＝9.7,8.0Hz,1H)；13C NMR(100MHz,cdcl3)δ138.26,137.89,128.53,128.49,127.92,127.89,127.86,127.82,104.75,84.57,78.21,75.60,75.30,74.82,61.37,56.94；ESI-MS:m/z calcd for C21H24D3NO5Na,399.1970；found,399.1962[M+Na]+。
化合物4的合成
将化合物29(36mg,0.09mmol)置于蛋形瓶中，冰浴冷却，加入1M BH3·THF(1.8mL)，搅拌五分钟，加入1M Bu2BOTf的二氯甲烷溶液(0.18mL)，冰浴下反应2h，TLC显示反应完全。加入0.2mL三乙胺后，缓慢滴加甲醇淬灭反应，减压浓缩，再分别加入甲醇稀释、浓缩三次，柱层析(PE:EA＝3:1)得到无色糖浆(32mg,0.08mmol)，产率89％，其核磁质谱数据如下：1H NMR(400MHz,CDCl3):δ7.36-7.24(m,10H),4.88-4.65(m,5H),3.99(t,1H,J＝9.2Hz),3.81-3.58(m,4H),3.38(d,1H,J＝10.0Hz),2.88-2.83(m,1H)；13C NMR(100MHz,CDCl3:δ137.91,137.87,128.59,128.53,128.16,128.02,127.96,127.93,98.70,80.38,77.94,75.54,75.08,71.27,63.73,61.56；ESI-MS(m/z):425.2[M+Na+]。
将上一步产物溶于吡啶(0.2M,1mL)和水(0.25mL)，分别加入三乙胺(0.04mL)和丙二硫醇(0.08mL)，室温搅拌。TLC监测原料消失，减压浓缩，之后加入3mL甲苯和乙醇(v/v＝5:1)，减压浓缩三次，柱层析(DCM:MeOH＝20:1+1％Et3N)，得到产物4(30mg,0.08mmol,99％)。产物4：[α]D25＝122.2(c 1.4,CHCl3)；1H NMR(400MHz,CDCl3)δ7.63–6.91(m,20H),5.48(d,J＝3.7Hz,1H),4.94(t,J＝11.2Hz,2H),4.90–4.80(m,4H),4.78(dd,J＝7.1,3.5Hz,2H),4.67(dd,J＝15.5,9.3Hz,2H),4.10–3.59(m,14H),3.53(t,J＝9.4Hz,1H),3.45–3.18(m,6H)；13C NMR(100MHz,CHCl3)δ138.57,138.15,128.66,128.62,128.01,127.96,100.50,83.70,78.72,77.48,77.16,76.84,75.69,74.89,71.61,61.78,56.07；ESI-MS:m/z calcd for C21H24D3NO5Na,399.1970；found,399.1964[M+Na]+。
化合物5的合成：
化合物30参考文献(Xu,P.；Xu,W.；Dai,Y.；Yang,Y.；Yu,B*.Org.Chem.Front.2014,1,405.)制备，再通过以下步骤制备化合物5：
将化合物30(200mg,0.50mmol)置于蛋形瓶中，冰浴冷却，加入1M BH3·THF(5mL)，搅拌五分钟，加入1M Bu2BOTf的二氯甲烷溶液(0.5mL)，冰浴下反应2h，TLC显示反应完全。加入0.2mL三乙胺后，缓慢滴加甲醇淬灭反应，减压浓缩，再分别加入甲醇稀释、浓缩三次，柱层析(PE:EA＝3:1)得到无色糖浆(172mg,0.43mmol)，产率86％。1H NMR(400MHz,CDCl3):δ7.38-7.29(m,10H),4.88-4.86(m,3H),4.78(d,1H,J＝3.6Hz),4.67(d,1H,J＝11.2Hz),3.99(dd,1H,J＝10.0Hz,1.2Hz),3.82-3.58(m,4H),3.41-3.36(m,4H)；ESI-MS(m/z):422.3[M+Na+].
将上一步产物溶于吡啶(0.2M,2mL)和水(0.5mL)，分别加入三乙胺(0.08mL)和丙二硫醇(0.16mL)，室温搅拌。TLC监测原料消失，减压浓缩，之后加入3mL甲苯和乙醇(v/v＝5:1)，减压浓缩三次，柱层析(DCM:MeOH＝20:1+1％Et3N)，得到产物5(150mg,0.40mmol,93％)。产物5：[α]D22＝110.8(c 1.9,CHCl3)；1H NMR(400MHz,CDCl3)δ7.48–7.13(m,10H),4.97(d,J＝11.4Hz,1H),4.85(d,J＝11.0Hz,1H),4.78–4.58(m,3H),3.88–3.48(m,5H),3.35(s,3H),2.75(dd,J＝9.4,3.5Hz,1H)；13C NMR(100MHz,CDCl3)δ138.60,138.17,128.66,128.00,100.67,83.89,78.73,77.48,77.16,76.84,75.71,74.88,71.63,61.78,56.14,55.22；ESI-MS:m/z calcd for C21H27NO5Na,396.1782；found,396.1790[M+Na]+。
化合物6的合成：
按照文献(Xu,P.；Xu,W.；Dai,Y.；Yang,Y.；Yu,B*.Org.Chem.Front.2014,1,405)的方法，以氨基葡萄糖盐酸盐为原料，通过常规保护基操作和糖苷反应制备得到化合物37。化合物37：[α]D28＝-20.9(c 1.5,CHCl3)；1H NMR(400MHz,CDCl3)δ8.19(d,J＝7.4Hz,2H),7.56–7.20(m,16H),7.13–7.05(m,4H),6.83(d,J＝9.0Hz,2H),5.81(s,1H),5.35(s,1H),5.12(t,J＝9.8Hz,1H),5.00(d,J＝12.1Hz,2H),4.87–4.76(m,2H),4.47(dd,J＝24.6,11.8Hz,2H),4.27(s,1H),4.08(dd,J＝23.2,14.5Hz,3H),3.88(s,1H),3.76(s,3H),3.72(s,3H),3.64–3.49(m,2H),3.41(dd,J＝11.1,3.7Hz,1H),3.33(dd,J＝10.0,3.1Hz,1H),1.85(s,3H)；13C NMR(100MHz,CDCl3)δ169.43,169.33,165.70,155.41,150.67,137.84,137.66,137.60,133.51,130.15,129.82,128.70,128.56,128.47,128.43,128.12,127.88,127.80,118.10,114.80,99.03,98.36,78.33,75.32,74.57,73.78,72.94,72.72,70.78,70.00,68.49,63.37,55.79,52.39,20.91；ESI-MS:m/z calcd for C50H51N3O14Na:940.3263；Found:940.3264[M+Na]+。
将化合物37(500mg,0.54mmol)，溶于无水甲醇(2.5mL)，加入甲醇钠(29mg,0.54mmol)，氩气保护条件下搅拌过夜。TLC监测原料消失，加入酸性树脂中和，过滤，旋干，柱层析得到白色固体(733mg,95％)。其核磁质谱数据如下：[α]D28＝-23.4(c 1.8,CHCl3)；1H NMR(400MHz,CDCl3)δ7.52–7.27(m,15H),7.13–7.02(m,2H),6.91–6.79(m,2H),5.69(s,1H),5.05(dd,J＝5.7,2.5Hz,2H),4.93–4.79(m,3H),4.71–4.58(m,2H),4.53(d,J＝12.0Hz,1H),4.27(s,1H),4.12–3.96(m,2H),3.83–3.69(m,9H),3.67–3.47(m,3H)；13C NMR(100MHz,CDCl3)δ169.77,155.11,150.71,138.04,137.64,137.58,128.70,128.63,128.28,128.15,128.10,128.04,127.85,127.77,117.70,114.78,100.14,94.99,80.87,75.67,73.88,72.12,72.03,71.59,70.88,69.47,67.66,66.06,63.26,55.77,52.52；ESI-MS:m/z calcd for C41H45N3O12Na:794.2896；Found:794.2920[M+Na]+。
将上一步产物溶于吡啶(2.5mL)和水(0.63mL)，分别加入三乙胺(0.1mL)和丙二硫醇(0.2mL)，室温搅拌。TLC监测原料消失，减压浓缩，之后加入3mL甲苯和乙醇(v/v＝5:1)，减压浓缩三次，柱层析(DCM:MeOH＝20:1+1％Et3N)，得到白色固体化合物6(352mg,92％)。化合物6：1H NMR(400MHz,CDCl3)δ7.44–7.27(m,15H),7.06(d,J＝9.1Hz,2H),6.83(d,J＝9.1Hz,2H),5.64(s,1H),5.07–4.89(m,3H),4.83(d,J＝11.5Hz,1H),4.73–4.48(m,4H),4.28(s,1H),4.02(s,2H),3.79–3.60(m,9H),3.55(dd,J＝9.4,4.5Hz,1H),3.50–3.40(m,1H),2.90(dd,J＝10.1,3.7Hz,1H)；13C NMR(100MHz,CDCl3)δ169.99,155.09,150.88,138.69,137.79,137.71,128.76,128.66,128.62,128.08,128.07,128.04,128.02,127.94,127.76,117.83,114.79,100.45,97.02,82.44,75.58,73.94,73.25,71.94,71.82,71.16,70.76,70.29,67.95,66.28,55.82,54.52,52.41；ESI-MS:m/z C41H47NO12Na:768.2991；Found:768.3005[M+Na]+。
化合物7的合成：
化合物31参考文献(李家昆博士论文，中国科学技术大学，2013)制备，再参考化合物6的制备方式，制备化合物7，两步收率88％，[α]D22＝169.9(c1.0,MeOH)；1H NMR(400MHz,MeOD)δ7.43-7.28(m,5H),5.28(d,J＝3.6Hz,1H),5.02(d,J＝11.2Hz,1H),4.74–4.71(m,2H),4.2(d,J＝11.2Hz,1H),3.81–3.48(m,8H),3.48–3.43(m,7H),2.71(dd,J＝4.0,10.4Hz,1H)；13C NMR(100MHz,MeOD)δ171.32,140.29,129.37,129.19,128.70,101.68,83.58,80.31,76.05,74.59,74.48,72.67,71.80,71.75,61.85,56.27,56.10,53.21；ESI-MS:m/z calcd for C21H31NO11Na,496.1789；found,496.4791[M+Na]+。
化合物8的合成：
化合物32参考文献(李家昆博士论文，中国科学技术大学，2013)制备，再参考化合物6的制备方式，制备化合物8，两步收率78％，[α]D24＝+5.8(c 0.4,MeOH)；1H NMR(400MHz,MeOD)δ7.56–7.17(m,5H),7.03(d,J＝9.0Hz,2H),6.84(d,J＝9.0Hz,2H),5.47(d,J＝2.3Hz,1H),5.02(d,J＝3.4Hz,1H),4.73(d,J＝11.6Hz,1H),4.22(brs,1H),4.10–3.90(m,2H),3.90–3.62(m,8H),3.49–3.37(m,2H),2.60(dd,J＝10.0,3.4Hz,1H)；13C NMR(100MHz,MeOD)δ171.48,156.59,152.23,139.58,129.43,128.87,128.80,118.95,115.59,101.76,99.13,75.77,75.15,74.64,73.39,73.34,71.53,69.95,69.03,62.41,57.04,56.02,52.93；ESI-MS:m/z calcd for C27H35NO12Na,588.2052；found,588.2047[M+Na]+。
化合物9的合成：
化合物33参考文献(Xu,P.；Xu,W.；Dai,Y.；Yang,Y.；Yu,B*.Org.Chem.Front.2014,1,405.)制备，再参考化合物6的制备方式，制备化合物9，两步收率85％：[α]D22＝94.6(c 0.6,CHCl3)；1H NMR(400MHz,MeOD)δ7.55–7.14(m,20H),5.23(d,J＝3.4Hz,1H),5.14(t,J＝10.6Hz,2H),4.85–4.61(m,6H),4.55(d,J＝11.0Hz,1H),4.12–3.97(m,3H),3.93–3.82(m,2H),3.80–3.64(m,7H),3.64–3.45(m,6H),3.40(s,3H),3.37–3.27(m,2H),2.67(dd,J＝10.0,3.6Hz,2H)；13C NMR(100MHz,MeOD)δ170.45,140.35,139.99,139.96,139.86,129.67,129.45,129.40,129.38,129.36,129.00,128.78,128.70,128.63,104.69,101.13,100.84,84.88,83.67,82.94,79.27,78.98,77.30,76.35,76.27,76.19,75.60,75.55,74.26,73.03,61.25,56.93,56.43,55.50,53.08；ESI-MS:m/z calcd for C48H60N2O15Na,927.3886；found,927.3886[M+Na]+。
化合物10的合成：
化合物34参考文献(Xu,P.；Xu,W.；Dai,Y.；Yang,Y.；Yu,B*.Org.Chem.Front.2014,1,405.)制备，再参考化合物6的制备方式，制备化合物10，两步收率80％，[α]D22＝37.9(c 0.8,CHCl3)；1H NMR(400MHz,CDCl3)δ7.50–7.00(m,25H),5.27(d,J＝6.1Hz,2H),4.99–4.80(m,4H),4.74(d,J＝9.6Hz,1H),4.72–4.66(m,2H),4.66–4.35(m,7H),4.18(s,1H),3.99(t,J＝9.5Hz,1H),3.93(s,1H),3.89–3.71(m,7H),3.71–3.59(m,3H),3.53–3.28(m,10H),2.87–2.72(m,3H)；13C NMR(100MHz,CDCl3)δ170.09,169.83,138.69,138.53,137.58,136.77,128.61,128.47,128.45,128.28,128.18,128.05,128.02,127.93,127.85,127.77,127.41,127.30,127.04,101.34,100.98,100.44,96.97,82.00,81.76,775.74,75.32,74.79,74.74,74.69,74.08,72.91,72.78,72.59,72.13,71.88,71.25,69.79,69.23,68.66,68.22,61.14,61.04,55.89,55.22,55.13,51.85；ESI-MS:m/z calcd for C62H76N2O21Na,1207.4833；found,1207.4867[M+Na]+.
化合物11的合成：
化合物35参考文献(Xu,P.；Xu,W.；Dai,Y.；Yang,Y.；Yu,B*.Org.Chem.Front.2014,1,405)制备，再参考化合物6的制备方式，制备化合物11，1H NMR(400MHz,CDCl3)δ7.53–7.12(m,30H),5.26(d,J＝3.7Hz,1H),5.14(d,J＝11.2Hz,1H),5.02(d,J＝11.1Hz,1H),4.96–4.67(m,7H),4.56(ddd,J＝25.6,17.3,9.3Hz,4H),4.13(t,J＝8.7Hz,1H),4.04–3.64(m,9H),3.64–3.39(m,13H),3.35(s,3H),2.78(d,J＝6.2Hz,4H),2.69(td,J＝10.4,3.8Hz,2H)；ESI-MS:m/z calcd for C69H82N2O21Na,1297.5302；found,1297.5306[M+Na]+.
化合物12的合成：
化合物36参考文献(Xu,P.；Xu,W.；Dai,Y.；Yang,Y.；Yu,B*.Org.Chem.Front.2014,1,405.)制备，再通过以下步骤制备化合物12：将化合物36(22mg,0.015mmol)溶于1mL THF和0.1mL H2O，充分搅拌后，加入硅胶44mg，PPh3(40mg,0.15mmol)，室温反应1天。TLC监测原料消失，过滤旋干，凝胶柱Sephadex LH-20(DCM:MeOH＝1:1)分离得到白色固体12(18mg,0.013mmol,85％)。1H NMR(500MHz,CDCl3)δ8.05(d,J＝7.4Hz,2H),8.01(d,J＝7.4Hz,2H),7.62–7.00(m,31H),5.38-5.28(m,3H),5.20(d,J＝11.2Hz,1H),5.08(d,J＝11.4Hz,1H),4.94–4.69(m,4H),4.62(dd,J＝11.0,8.5Hz,2H),4.53(t,J＝10.6Hz,2H),4.46(d,J＝11.4Hz,1H),4.14(t,J＝8.6Hz,1H),4.01(d,J＝6.1Hz,2H),3.90(d,J＝8.9Hz,1H),3.88–3.74(m,3H),3.74–3.50(m,6H),3.33(ddd,J＝18.9,16.0,9.5Hz,3H),3.17(s,2H),3.13(d,J＝10.0Hz,1H),3.00(s,3H),2.66–2.57(m,2H)；13C NMR(125MHz,CDCl3)δ169.77,168.26,166.01,165.57,164.87,138.22,138.09,137.83,137.75,137.35,133.44,133.31,132.91,130.15,129.98,129.90,129.85,129.68,129.33,129.27,128.64,128.57,128.52,128.45,128.42,128.31,128.30,128.23,128.11,128.02,127.98,127.79,127.71,127.68,127.34,102.06,101.46,98.56,98.06,81.10,79.49,79.45,78.26,78.17,77.41,77.16,76.91,75.73,75.54,75.39,75.27,74.70,74.61,74.57,73.52,73.21,73.15,72.89,70.86,70.66,68.89,66.72,63.17,62.64,62.50,55.53,52.88,51.77；ESI-MS:m/z calcd for C76H85N2O23,1393.6；found,1393.9[M+H]+。
化合物13的合成：
五糖38参考文献(Xu,P.；Xu,W.；Dai,Y.；Yang,Y.；Yu,B*.Org.Chem.Front.2014,1,405.)合成，再经BomCl保护，合成化合物39，再参考化合物6的制备方式，制备化合物13，具体步骤如下：
将五糖38(420mg,0.24mmol)溶解于5mL二氯甲烷中，分别加入二异丙基乙基胺(DIPEA,0.42mL,2.4mmol)和苄氧亚甲基氯(BomCl,0.14mL,0.96mmol)，加热回流，TLC监测，旋干，过柱(PE:EA＝1:1)得到化合物五糖39(376mg,0.20mmol,83％)。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ8.10(d,J＝7.2Hz,2H),8.02(d,J＝7.2Hz,2H),7.59–7.03(m,36H),5.78(d,J＝6.5Hz,1H),5.47(d,J＝3.7Hz,1H),5.33–5.22(m,2H),5.15(d,J＝3.4Hz,1H),5.07(d,J＝11.1Hz,1H),5.01–4.90(m,3H),4.89–4.64(m,9H),4.62–4.40(m,7H),4.35–3.94(m,10H),3.94–3.76(m,4H),3.74(s,3H),3.66(dt,J＝18.8,9.4Hz,3H),3.51(d,J＝5.1Hz,5H),3.40(dd,J＝10.1,3.6Hz,1H),3.35(s,3H),3.30(dd,J＝10.4,3.7Hz,1H),3.19(dd,J＝10.8,3.4Hz,1H),2.08(s,3H),2.03(s,3H),2.02(s,3H)；13C NMR(100MHz,CDCl3)δ170.76,170.36,169.99,169.88,168.38,166.18,165.36,138.10,138.01,137.60,137.56,137.41,133.65,133.12,130.00,129.97,129.11,128.81,128.65,128.50,128.45,128.43,128.40,128.37,128.19,128.06,128.02,127.94,127.72,127.61,126.94,110.14,103.24,98.49,98.24,97.93,97.72,95.47,83.41,80.35,78.56,77.48,75.97,75.69,75.36,75.13,74.90,74.68,73.15,72.69,71.98,70.55,69.92,69.69,69.22,63.45,62.29,60.78,55.54,52.82,52.44,21.01,20.96,20.72。
化合物13由化合物39制备，两步收率75％，1H NMR(500MHz,CDCl3)δ7.38–7.08(m,17H),5.38(s,1H),5.30(d,J＝3.5Hz,1H),5.04(d,J＝3.3Hz,1H),4.96–4.42(m,14H),4.30–4.19(m,2H),4.12(s,1H),4.00(t,J＝9.4Hz,2H),3.96–3.85(m,2H),3.85–3.62(m,7H),3.62–3.37(m,6H),3.35(d,J＝5.6Hz,2H),3.32–3.20(m,2H),2.80(dd,J＝9.7,3.3Hz,2H),2.73(d,J＝6.4Hz,1H)；13CNMR(100MHz,CDCl3)δ170.47,169.66,138.69,138.36,138.07,137.74,137.71,137.36,128.56,128.51,128.47,128.44,128.43,128.39,128.28,127.96,127.91,127.88,127.80,127.77,127.76,127.62,127.45,127.40,101.87,100.75,100.54,95.62,94.90,82.60,82.16,79.50,78.41,77.48,77.36,77.16,76.84,75.60,75.33,74.77,74.29,73.90,72.90,72.20,72.02,71.35,70.97,70.25,69.24,61.36,60.65,60.38,55.91,55.63,55.18,54.92,53.13,51.94；ESI-MS:m/z calcd for C76H96N3O26,1466.6277；found,1466.6256[M+H]+。
化合物14的合成：
将五糖39(90mg,0.048mmol)溶于5mL THF中，冰浴冷却，加入预先混合的1M LiOH(4.8mL)和30％双氧水(0.96mL)，冰浴下反应一天时间；接着加入6mL甲醇和2.4mL 3M KOH水溶液，反应过夜。TLC监测反应，加入2M HCl调节pH＝3，加入饱和亚硫酸钠水溶液，二氯甲烷萃取三次，合并有机层，饱和食盐水洗，无水硫酸钠干燥，过滤，旋干，甲苯带水得到白色泡沫状糖浆。
将上一步粗产物溶解于2mL DMF中，分别加入碳酸氢钾(29mg,0.29mmol)和溴化苄(23μm,0.19mmol)，室温搅拌，TLC监测反应。EA稀释，水洗三次，饱和食盐水洗两次，无水硫酸钠干燥，过滤旋干得到带黄色糖浆；ESI-MS:m/z calcd for C88H97N9O26Na,1718.6437；found,1718.6434[M+Na]+。
将上一部粗产物溶于2mL吡啶和0.5mL水中，分别加入三乙胺(0.05mL)和丙二硫醇(0.1mL)，室温搅拌。TLC监测原料消失，减压浓缩，之后加入3mL甲苯和乙醇(v/v＝5:1)，减压浓缩三次，柱层析(DCM:MeOH＝20:1+1％Et3N)，得到白色固体化合物14(39mg,0.024mmol,三步收率50％)。
1H NMR(500MHz,CDCl3)δ7.42–7.01(m,40H),5.35(s,1H),5.27(s,1H),5.21(d,J＝12.3Hz,1H),5.09(d,J＝12.3Hz,1H),5.04–4.83(m,7H),4.83–4.68(m,7H),4.68–4.62(m,2H),4.59(d,J＝11.6Hz,1H),4.48(ddd,J＝17.8,13.0,9.0Hz,4H),4.28(dt,J＝22.4,8.3Hz,3H),4.01(s,1H),3.97–3.83(m,3H),3.82–3.57(m,11H),3.57–3.49(m,2H),3.49–3.37(m,4H),3.36–3.27(m,1H),3.31(s,3H),2.75(dd,J＝9.9,3.5Hz,1H),2.67(dd,J＝9.7,3.2Hz,2H)；13C NMR(100MHz,CDCl3)δ170.27,168.82,139.03,138.46,138.04,137.71,137.60,137.34,135.09,134.55,128.68,128.64,128.61,128.52,128.51,128.47,128.38,128.24,128.05,127.94,127.88,127.82,127.79,127.75,127.68,127.58,127.46,127.42,102.15,101.39,100.46,99.24,96.85,94.87,83.30,82.40,82.01,79.65,78.35,77.48,77.16,76.84,76.35,75.54,75.06,74.93,74.72,74.21,73.99,72.93,72.18,72.10,71.78,71.46,71.05,70.17,69.33,68.15,66.99,61.40,60.74,59.19,55.83,55.77,55.09,55.05；ESI-MS:m/z calcd for C88H104N3O26,1618.6903；found,1618.6920[M+H]+。
以下结合实施例对本发明的硫酸化方法做进一步说明。
表1列出了实施例1-20的反应条件、操作步骤、所得产物及收率。
表1:实施例1-20的反应条件及结果
表1中各个符号或字母所表示的含义：
P1：硫酸化产物；S：硫酸化试剂相对原料当量；B：碱性添加剂；V：碱性添加剂与溶剂体积比；Y1：硫酸化反应收率；T：脱保护反应步骤；P2：脱保护产物；Y2：脱保护反应收率，符号“--”代表未添加、为未操作或无收率。
实施例1肝素二糖40的制备
二糖6硫酸化后通过脱甲酯和还原氢化反应得到肝素二糖40。
步骤(a)，硫酸化反应：将化合物6溶于无水吡啶(0.1mmol)，加入三乙胺(溶剂体积的十分之一)，SO3·Py(5eq，每个反应位点)，微波反应100℃，15min。TLC监测，加入甲醇淬灭反应，后加入Et3N调节pH至碱性，减压浓缩，反相柱层析(MeOH:H2O＝3:1)，分离得到目标产物，之后通过Dowex50WX4Na+柱交换成钠型，得到白色固体化合物18，产率：92％，纯度为99％。
化合物18：[α]D28＝5.7(c 0.1,MeOH)；1H NMR(400MHz,MeOD)δ7.65(d,J＝7.2Hz,2H),7.53–7.15(m,12H),7.05(d,J＝9.0Hz,2H),6.85(d,J＝9.0Hz,2H),5.88(s,1H),5.43(d,J＝3.2Hz,1H),5.05–4.93(m,3H),4.80–4.71(m,2H),4.66(d,J＝11.8Hz,1H),4.53(d,J＝10.6Hz,3H),4.28(s,1H),3.98–3.70(m,8H),3.65(s,3H),3.54(dd,J＝10.7,3.2Hz,1H)；13C NMR(125MHz,MeOD)δ171.28,156.64,151.87,139.92,139.66,130.46,129.26,129.21,129.18,128.98,128.78,128.55,128.43,128.32,119.09,115.63,99.66,99.45,79.02,77.49,75.50,74.39,74.33,74.27,73.20,72.48,72.29,69.90,68.59,58.76,56.03,53.06；ESI-MS:m/z calcd for C41H45NO21S3,491.6；found,492.2[M-3Na+H]2-.
步骤(b)，脱除甲酯：将步骤(a)中得到的化合物18溶于THF(0.1M)中，预混合30％H2O2(100eq.)和1M LiOH(50eq.)加入到体系中，室温搅拌过夜。TLC监测原料消失，酸性树脂中和，过滤，减压浓缩，反相柱层析，之后Dowex50WX4Na+柱交换成钠型。
步骤(c)，氢化还原：将步骤(b)中得到的化合物溶于1mL甲醇和1mL纯水中(0.1M)，加入等质量的Pd(OH)2/C，10个大气压氢气条件下加压氢化一天，滤纸滤去Pd(OH)2/C，减压浓缩，凝胶柱G-10柱层析，Dowex50WX4Na+柱交换成钠型，之后冷冻干燥，得到白色固体化合物40，产率：98％，纯度为99％。
化合物40：1H NMR(400MHz,D2O)δ7.63–6.91(m,20H),5.48(d,J＝3.7Hz,1H),4.94(t,J＝11.2Hz,2H),4.90–4.80(m,4H),4.78(dd,J＝7.1,3.5Hz,2H),4.67(dd,J＝15.5,9.3Hz,2H),4.10–3.59(m,14H),3.53(t,J＝9.4Hz,1H),3.45–3.18(m,6H)；13C NMR(100MHz,D2O)δ174.53,154.90,150.37,129.27,125.44,119.68,115.18,99.21,97.03,77.18,76.10,75.61,70.26,69.62,69.07,68.51,60.22,57.96,55.92；ESI-MS:m/z calcd for C19H25NO21S3(质谱显示，大部分时候都不带Na，可能与质谱条件有关),349.5；found,349.6[M-3Na+H]2-。
实施例2-5：化合物6在微波作用下的N,O同时硫酸化
按照实施例1中的步骤(a)的操作，具体的反应条件参见表1。其中，化合物18的核磁数据同实施例1。
实施例6
化合物6在常温无微波条件下只得到纯的N-硫酸化的产物42，参考实施例1中的步骤(a)的操作，具体的反应条件参见表1，说明无微波条件，糖胺聚糖类多需硫酸化位点化合物无法硫酸化完全。
将化合物6(6mg,0.008mmol)溶于1mL无水吡啶，加入SO3·Py(19mg,0.12mmol)，室温搅拌过夜。TLC监测，加入甲醇淬灭反应，后加入Et3N调节pH至碱性，减压浓缩，反相柱层析(MeOH:H2O＝4:1)，分离之后通过Dowex50WX4Na+柱交换成钠型42(5mg,0.006mmol)，产率72％，纯度99％。化合物42：[α]D28＝7.7(c 0.3,MeOH)；1H NMR(400MHz,MeOD)δ7.55–7.15(m,15H),7.03(d,J＝9.1Hz,2H),6.85(d,J＝9.1Hz,2H),5.51(s,1H),5.44(d,J＝3.2Hz,1H),5.01(d,J＝10.9Hz,1H),4.93(s,1H),4.82–4.67(m,3H),4.58(s,2H),4.30(s,1H),4.20(s,1H),4.05(s,1H),3.81–3.63(m,8H),3.61–3.41(m,4H)；ESI-MS:m/z calcd for C41H46NO15S,824.3；found,824.7[M-Na]-。
实施例7
化合物6在常温无微波条件下只得到纯的N-硫酸化的产物42，参考实施例1中的步骤(a)的操作，具体的反应条件参见表1，说明无微波条件，糖胺聚糖类多需硫酸化位点化合物无法硫酸化完全。
实施例8：化合物6在微波条件下的O-硫酸化41
采用SO3·Py作为硫酸化试剂(一个反应位点加入5当量硫酸化试剂)，吡啶作为溶剂，微波条件下再55℃加热反应15分钟，得到O-硫酸化、而N-裸露的二糖41，具体的反应条件参见表1，对比实施例4，本实施例采用了碱性较弱的SO3·Py作为硫酸化试剂，在不加入碱性添加剂时，由于碱性不够，糖胺聚糖类多需硫酸化位点化合物无法硫酸化完全。
具体实验操作如下：将化合物6(6mg,0.008mmol)溶于1mL无水吡啶，加入SO3·Py(19mg,0.12mmol)，微波反应100℃ 20分钟。TLC监测，加入甲醇淬灭反应，后加入Et3N调节pH至碱性，减压浓缩，反相柱层析(MeOH:H2O＝3:1)，分离得到目标产物，之后通过Dowex50WX4Na+柱交换成钠型。得到化合物41(7.3mg,0.0077mmol)，收率96％，纯度98％。
化合物41：[α]D28＝26.4(c 1.0,MeOH)；1H NMR(400MHz,MeOD)δ7.51(d,J＝7.0Hz,2H),7.31(m,13H),7.03(d,J＝9.1Hz,2H),6.87(d,J＝9.1Hz,2H),5.79(s,1H),5.36(t,J＝6.6Hz,2H),5.08(s,1H),4.72–4.52(m,5H),4.43(t,J＝9.4Hz,1H),4.34(d,J＝19.4Hz,2H),4.10(d,J＝9.6Hz,1H),3.93–3.63(m,9H)；13C NMR(100MHz,MeOD)δ171.13,156.92,151.68,139.85,139.34,138.82,130.24,129.47,129.29,129.12,129.01,128.94,128.91,128.75,128.53,119.15,115.81,99.53,92.45,77.98,77.80,76.38,74.43,73.09,72.87,70.41,69.86,69.26,68.14,56.09,54.83,53.32；ESI-MS:m/z calcd for C41H46NO18S2,904.2；found,904.8[M-2Na+H]-。
实施例9：化合物6在微波条件下的O-硫酸化产物41
化合物6在微波条件下只得到纯的O-硫酸化的产物41，参考实施例8中的操作，具体的反应条件参见表1，对比实施例4，本实施例采用了碱性较弱的SO3·Py作为硫酸化试剂，在不加入碱性添加剂时，由于碱性不够，糖胺聚糖类多需硫酸化位点化合物无法硫酸化完全(本实施例9较于实施例8调整了时间和温度)。
实施例10：单糖43的制备
参考实施例1中的操作，化合物3经硫酸化步骤(a)制得化合物15(产率91％，纯度99％)，氢化步骤(c)制得化合物43，(产率99％，纯度99％)，具体的反应条件参见表1。
化合物15
[α]D25＝-26.9(c 0.2,MeOH)；1H NMR(300MHz,CD3OD)δ7.57–7.13(m,10H),5.17(d,J＝10.7Hz,1H),4.83(d,J＝10.7Hz,3H),4.69(d,J＝6.2Hz,1H),4.36(s,2H),4.00(s,1H),3.73(s,3H)；13C NMR(100MHz,MeOH)δ140.21,139.66,129.37,129.21,129.21,129.18,128.58,128.43,104.19,82.82,78.68,75.31,75.25,74.64,67.86,60.56；ESI-MS:m/z calcd for C21H22D3NO11S2,267.1；found,267.0[M-2Na]2-。
化合物43：
1H NMR(400MHz,D2O)δ8.45(s,1H),4.48(d,J＝8.4Hz,1H),4.35(dd,J＝11.1,2.0Hz,1H),4.23(dd,J＝11.2,5.2Hz,1H),3.73–3.59(m,2H),3.57–3.44(m,1H),3.02(dd,J＝10.0,8.4Hz,1H)；13C NMR(100MHz,D2O)δ102.43,74.45,73.36,69.46,66.95,59.77；ESI-MS:m/z calcd for C7H10D3NO11S2,177.0；found,176.8[M-2Na]2-。
实施例11：硫酸化单糖44的制备
参考实施例1中的操作，化合物4经硫酸化步骤(a)，制得化合物16(产率：90％，纯度99％)，氢化步骤(c)制得化合物44(产率：99％，纯度99％)，具体的反应条件参见表1。
化合物16:
[α]D25＝37.8(c 0.2,MeOH)；1H NMR(400MHz,MeOD)δ7.42(d,J＝6.6Hz,2H),7.37–7.16(m,7H),5.08(dd,J＝7.1,3.4Hz,2H),4.80–4.66(m,3H),4.27(d,J＝3.1Hz,2H),3.80(dt,J＝9.8,3.0Hz,1H),3.71–3.52(m,2H),3.47(dd,J＝10.1,3.6Hz,1H)；13C NMR(100MHz,MeOD)δ140.20,139.70,129.36,129.21,129.18,129.14,128.56,128.42,100.14,81.93,78.99,76.20,75.94,70.55,67.66,59.50；ESI-MS:m/z calcd for C21H23D3NO11S2,535.1；found,535.3[M-H]-；C21H22D3NO11S2,267.1；found,267.2[M-2Na]2-.
化合物44:
1H NMR(400MHz,D2O)δ4.98(d,J＝3.5Hz,1H),4.28(dd,J＝11.2,2.0Hz,1H),4.21(dd,J＝11.2,5.0Hz,1H),3.88–3.78(m,1H),3.52(dt,J＝18.9,9.2Hz,2H),3.22(dd,J＝10.1,3.6Hz,1H)；13C NMR(100MHz,D2O)δ98.35,71.12,69.54,69.33,67.00,57.43；ESI-MS:m/z calcd for C7H10D3NO11S2,177.0；found,176.8[M-2H]2-；ESI-MS:m/z calcd for C7H10D3NO11S2,177.0；found,176.8[M-2Na]2-.
实施例12硫酸化单糖45的制备
参考实施例1中的操作，化合物5经硫酸化步骤(a)，制得化合物17(产率：92％，纯度99％)，氢化步骤(c)制得化合物45(产率：99％，纯度99％)，具体的反应条件参见表1。
化合物17:
1H NMR(400MHz,MeOD)δ7.46–7.38(m,2H),7.34–7.18(m,8H),5.12–4.99(m,2H),4.81–4.67(m,3H),4.27(d,J＝3.2Hz,2H),3.80(dt,J＝9.8,3.1Hz,1H),3.61(dt,J＝18.7,9.0Hz,2H),3.47(dd,J＝10.1,3.6Hz,1H),3.43(s,3H)；13C NMR(100MHz,cd3od)δ140.22,139.71,129.37,129.23,129.18,129.14,128.57,128.42,100.22,81.95,78.99,76.22,75.95,70.56,67.66,59.51,55.82；ESI-MS:m/z calcd for C21H26NO11S2,532.1；found,532.3[M-H]-；C21H24NO11S2,265.6；found,265.7[M-2Na]2-.
化合物45:
1H NMR(400MHz,D2O)δ5.03(d,J＝3.6Hz,1H),4.33(dd,J＝11.2,2.1Hz,1H),4.26(dd,J＝11.2,5.1Hz,1H),3.88(ddd,J＝9.7,4.9,2.0Hz,1H),3.64–3.48(m,2H),3.43(s,3H),3.28(dd,J＝10.1,3.6Hz,1H)；13C NMR(100MHz,D2O)δ98.50,71.26,69.62,69.45,67.09,57.56,55.42；ESI-MS:m/z calcd for C7H13NO11S2,352.0；found,351.9[M-2Na+H]-；C7H13NO11S2,175.5；found,175.3[M-2Na]2-.
实施例13硫酸化二糖19的制备
参考实施例1中的操作，化合物7经硫酸化步骤(a)，制得化合物19(产率：98％，纯度99％)，具体的反应条件参见表1。
化合物19:
1H NMR(400MHz,D2O)δ7.68–7.27(m,5H),5.42(d,J＝3.5Hz,1H),5.22(d,J＝3.1Hz,1H),4.51(d,J＝7.9Hz,1H),4.46(dd,J＝8.7,3.2Hz,1H),4.40–4.28(m,3H),4.23(dd,J＝10.9,4.7Hz,1H),4.19–4.11(m,1H),3.89–3.80(m,5H),3.55(d,J＝4.7Hz,3H),3.40(dd,J＝10.7,3.5Hz,1H)；13C NMR(125MHz,D2O)δ170.33,137.77,129.13,128.38,128.03,98.90,97.17,77.41,77.15,76.14,75.15,74.97,73.79,71.68,69.49,66.58,57.44,56.12,55.46,53.50；ESI-MS:m/z calcd for C21H29NO26S5,435.5；found,435.8[M-5Na+3H]2-.
实施例14化合物20的制备
参考实施例1中的操作，化合物8经硫酸化步骤(a)，制得化合物20(产率：94％，纯度99％)，具体的反应条件参见表1。
化合物20:
1H NMR(400MHz,D2O)δ7.49–7.26(m,5H),7.07–6.99(m,2H),6.93–6.85(m,2H),5.67(d,J＝2.4Hz,1H),5.30(d,J＝3.2Hz,1H),5.01(d,J＝2.6Hz,1H),4.80(dd,J＝26.5,11.2Hz,2H),4.54(dd,J＝4.5,2.6Hz,1H),4.32-4.23(m,5H),4.16(dd,J＝11.0,5.6Hz,1H),3.96–3.84(m,1H),3.74(d,J＝17.0Hz,6H),3.42(dd,J＝10.6,3.2Hz,1H)；13C NMR(100MHz,D2O)δ173.08,157.52,152.50,139.80,131.37,131.00,121.78,117.75,101.48,99.79,77.87,77.69,77.00,76.64,75.56,75.48,72.41,71.31,69.50,59.30,58.48,55.87；ESI-MS:m/z calcd for C27H33NO27S5,481.5；found,481.7[M-5Na+3H]2-；C27H32NO27S5Na,492.5；found,492.7[M-4Na+2H]2-.
实施例15化合物46的制备
参考实施例1中的操作，化合物9经硫酸化步骤(a)，制得化合物21(产率：95％，纯度99％)，去甲酯步骤(b)和氢化步骤(c)制得化合物46(产率：99％，纯度99％)，具体的反应条件参见表1。
化合物21:
[α]D25＝38.1(c 0.2,MeOH)；1H NMR(400MHz,MeOD)δ7.81–6.96(m,20H),5.38(brs,J＝3.4Hz,1H),5.15–5.05(m,3H),5.02(d,J＝11.2Hz,1H),4.95(d,J＝10.8Hz,1H),4.82–4.73(m,1H),4.70(d,J＝11.0Hz,2H),4.54(t,1H),4.32(d,J＝8.4Hz,1H),4.27–4.19(m,2H),4.18–4.07(m,3H),3.96(d,J＝6.1Hz,2H),3.76–3.52(m,11H),3.51–3.37(m,4H)；13C NMR(100MHz,MeOD)δ170.78,140.62,140.28,140.07,139.00,130.33,129.40,129.32,129.16,129.14,129.09,129.05,128.73,128.38,128.24,128.19,102.20,99.97,99.83,81.66,80.51,80.17,79.44,78.65,78.50,77.13,76.41,75.90,74.94,74.46,71.43,70.22,67.18,66.95,59.67,58.42,58.29,55.78,53.25；ESI-MS:m/z calcd for C48H58N2O30S5,651.1；found,651.5[M-5Na+3H]2-；C48H57N2O30S5,433.7；found,434.1[M-5Na+2H]3-.
化合物46:
1H NMR(400MHz,D2O):δ5.69(d,1H,J＝2.4Hz),5.07(d,1H,J＝2.8Hz),4.79(d,1H),4.62(d,1H,J＝10.0Hz),4.40(d,1H,J＝10.4Hz),4.29(d,1H,J＝11.2Hz),4.23-4.15(m,2H),4.04-3.60(m,9H),3.46(s,3H),3.33-3.27(m,2H)；13C NMR(100MHz,D2O):δ100.07,98.31,97.82,79.93,77.91,76.47,75.05,71.30,69.95,69.48,69.08,68.10,66.39,65.97,57.94,57.26,55.51；ESI-MS:m/z calcd for C19H31N2O30S5,309.0；found,309.2[M-3H]3-；m/z calcd for C19H32N2O30S5,464.0；found,464.2[M-6Na+4H]2-.
实施例16化合物48的制备
参考实施例1中的操作，化合物10经硫酸化步骤(a)，制得化合物22(产率：96％，纯度99％)，去甲酯步骤(b)制得化合物47(产率：92％，纯度99％)，氢化步骤(c)制得化合物48(产率：99％，纯度99％)，具体的反应条件参见表1。
化合物22:
[α]D25＝10.1(c 0.8,MeOH)；1H NMR(400MHz,MeOD)δ7.79–6.94(m,25H),5.46(s,1H),5.40(s,1H),5.33(brs,J＝8.4Hz,1H),5.14–5.05(m,2H),5.02(s,1H),4.93(d,J＝9.8Hz,2H),4.84–4.75(m,2H),4.67(t,J＝4.7Hz,2H),4.63–4.45(m,5H),4.39–4.11(m,7H),4.05(s,1H),3.94(t,J＝9.2Hz,2H),3.83(dd,J＝22.2,9.8Hz,2H),3.56–3.36(m,11H),3.17(s,3H)；13C NMR(100MHz,MeOD)δ172.49,172.06,139.91,139.51,139.49,138.86,138.20,130.15,130.07,129.97,129.90,129.72,129.67,129.32,129.26,129.04,128.89,128.84,128.71,128.24,128.01,100.79,100.08,99.17,98.43,79.92,79.06,76.88,76.58,76.08,73.83,73.64,72.95,72.34,72.10,71.48,71.37,71.12,70.76,70.63,68.33,68.23,67.59,67.43,59.95,59.87,55.91,53.02,52.41,49.85；ESI-MS:m/z calcd for C62H73N2O39S6,553.7；found,554.1[M-6Na+3H]3-.
化合物47:
[α]D26＝11.2(c 0.8,MeOH)；1H NMR(400MHz,MeOD)δ7.72–6.90(m,25H),5.54(s,1H),5.43(s,1H),5.34(s,1H),5.08(s,2H),5.02(s,1H),4.81–4.14(m,18H),4.11(s,1H),4.04–3.77(m,4H),3.65(s,1H),3.57–3.49(m,2H),3.48–3.39(m,5H)；13C NMR(100MHz,MeOD)δ173.63,173.42,139.82,139.35,139.20,138.76,138.28,130.05,129.89,129.82,129.73,129.57,129.27,129.24,128.88,128.80,127.99,99.96,99.07,79.79,76.60,73.57,72.93,72.77,71.21,70.66,67.78,59.72,55.87；ESI-MS:m/z calcd for C60H70N2O39S6,817.1；found,818.4[M-2H]2-；m/z calcd for C60H69N2O39S6Na,828.1；found,829.5[M+Na-3H]2-；C60H70N2O36S5,777.1；found,778.4[M-SO3-2H]2-；m/z calcd for C60H69N2O39S6,544.4；found,544.8[M-8Na+5H]3-.
化合物48:
1H NMR(400MHz,D2O)δ5.44(d,J＝3.5Hz,1H),5.23(d,J＝3.2Hz,1H),5.19(s,1H),5.04(d,J＝3.6Hz,1H),4.87(d,J＝2.3Hz,1H),4.41–4.24(m,7H),4.20(dd,J＝6.3,3.8Hz,1H),4.13(d,J＝3.7Hz,2H),4.07(d,J＝9.7Hz,1H),4.03–3.95(m,2H),3.83–3.62(m,4H),3.44(s,3H),3.29(dt,J＝10.2,3.7Hz,2H)；13C NMR(100MHz,D2O)δ176.38,174.53,99.47,99.19,98.32,96.51,77.09,76.48,76.04,74.16,69.98,69.72,69.21,68.98,68.62,67.00,58.08,57.80,55.50；ESI-MS:m/z calcd for C25H42N2O39S6,394.3；found,394.6[M-8Na+5H]3-.
实施例17化合物49的制备
参考实施例1中的操作，化合物11经硫酸化步骤(a)，制得化合物23(产率：95％，纯度99％)，去甲酯步骤(b)和氢化步骤(c)制得化合物49(产率：98％，纯度99％)，具体的反应条件参见表1。
化合物23:
1H NMR(400MHz,MeOD)δ7.56–7.02(m,34H),5.43(d,J＝3.3Hz,1H),5.20(d,J＝10.6Hz,1H),5.11–5.00(m,4H),4.84–4.59(m,10H),4.49(t,J＝8.4Hz,2H),4.40(d,J＝8.4Hz,1H),4.23–4.00(m,6H),3.98–3.79(m,7H),3.68(s,3H),3.64–3.44(m,8H),3.42–3.37(m,5H)；13C NMR(100MHz,MeOD)δ171.15,170.70,140.34,140.10,140.04,139.93,139.73,139.53,130.02,129.99,129.88,129.79,129.24,129.20,129.14,129.10,128.98,128.69,128.47,128.44,128.35,128.07,103.36,102.31,100.78,99.92,84.07,82.45,80.90,80.37,80.22,79.00,78.71,77.89,77.19,76.38,76.06,75.85,75.57,75.38,75.19,75.11,71.79,70.46,66.82,59.17,58.50,55.87,53.81,52.75；ESI-MS:m/z calcd for C69H79N2O36S5,557.1；found,557.6[M-5Na+2H]3-.
化合物49:
1H NMR(400MHz,D2O):δ5.52(d,1H,J＝3.6Hz),5.05(d,1H,J＝3.2Hz),4.79(d,1H),4.60(d,1H,J＝8.0Hz),4.56(d,1H,J＝10.8Hz),4.42(d,1H,J＝10.8Hz),4.33(dd,1H,J＝11.2Hz,3.6Hz),4.20(d,1H,J＝10.8Hz),4.12(t,1H,J＝8.8Hz),4.03-4.01(m,2H),3.88-3.68(m,9H),3.60(t,1H,J＝9.6Hz),3.44(s,3H),3.42-3.31(m,3H)；13C NMR(100MHz,D2O):δ181.53,175.60,102.23,100.81,99.84,98.21,79.70,78.81,78.67,77.58,76.63,75.74,75.68,74.48,72.96,71.74,69.70,69.36,69.01,68.25,66.62,65.87,57.86,57.24,55.50；ESI-MS(m/z):m/z calcd for C25H39N2O36S5:367.7；found:367.5[M-7Na+4H+]3-.
实施例18化合物50的制备
参考实施例1中的操作，化合物12经硫酸化步骤(a)，制得化合物24(产率：92％，纯度99％)，去甲酯步骤(b)和氢化步骤(c)制得化合物50(产率：96％，纯度99％)，具体的反应条件参见表1。
化合物24
1H NMR(500MHz,MeOD)δ8.29–8.20(m,2H),8.17–8.06(m,2H),7.71–6.96(m,30H),5.55(d,J＝3.3Hz,1H),5.29–5.22(m,2H),5.21–5.15(m,1H),5.07(d,J＝8.1Hz,1H),4.97(d,J＝3.5Hz,1H),4.94(dd,J＝11.2,2.3Hz,2H),4.86(d,J＝10.6Hz,1H),4.80–4.70(m,4H),4.61(dd,J＝13.6,11.0Hz,3H),4.50–4.39(m,2H),4.33(dd,J＝10.9,2.3Hz,1H),4.22(d,J＝9.8Hz,1H),4.10(tt,J＝9.8,6.5Hz,4H),4.01(d,J＝9.6Hz,1H),3.98–3.93(m,1H),3.93–3.80(m,3H),3.56(s,3H),3.50–3.41(m,3H),3.39(dd,J＝10.6,3.4Hz,1H),3.31(d,J＝1.8Hz,3H),3.22(s,3H)；13C NMR(125MHz,MeOD)δ170.59,170.11,166.75,166.63,139.88,139.84,139.42,139.14,139.08,134.76,134.57,131.16,131.10,130.71,130.58,130.00,129.95,129.84,129.75,129.55,129.25,129.14,129.12,128.94,128.90,128.73,128.67,128.60,128.37,128.33,128.29,101.63,101.55,99.88,99.23,83.73,82.54,81.22,78.81,77.93,77.58,77.48,76.70,76.01,75.77,75.69,75.53,75.47,75.27,74.98,71.38,70.29,66.16,65.75,58.66,58.27,55.75,53.14,52.91.
化合物50
1H NMR(400MHz,D2O)δ5.66(d,J＝3.5Hz,1H),5.05(d,J＝3.5Hz,2H),4.60(d,J＝7.8Hz,3H),4.48(d,J＝10.0Hz,1H),4.41(d,J＝10.0Hz,1H),4.33(dd,J＝11.1,4.9Hz,1H),4.19(d,J＝10.8Hz,1H),4.03(d,J＝9.7Hz,2H),3.91–3.63(m,9H),3.60–3.25(m,10H),ESI-MS:m/z calcd for C25H39N2O33S4Na,523.1；found,523.6[M-5Na+3H]2-.
实施例19化合物25的制备
参考实施例1中的操作，化合物13经硫酸化步骤(a)，制得化合物25(产率：85％，纯度99％)。
化合物25：
1H NMR(400MHz,MeOD)δ7.60–7.03(m,30H),5.48(s,1H),5.44(d,J＝3.1Hz,1H),5.25(d,J＝3.3Hz,1H),5.10(d,J＝3.3Hz,1H),5.04(dd,J＝11.5,4.7Hz,4H),4.96(d,J＝7.5Hz,1H),4.81–4.16(m,23H),4.10(d,J＝9.9Hz,2H),4.01–3.82(m,10H),3.77(d,J＝9.9Hz,2H),3.64(d,J＝9.9Hz,1H),3.59(d,J＝9.6Hz,1H),3.55–3.40(m,9H),3.37(s,2H),3.16(brs,3H)；13C NMR(100MHz,MeOD)δ173.54,171.49,140.39,139.93,139.65,139.60,139.31,139.25,129.74,129.68,129.52,129.38,129.30,129.16,129.14,129.09,128.97,128.84,128.47,128.44,128.33,128.19,128.13,126.76,103.37,100.18,100.01,99.10,96.66,82.82,81.48,79.94,79.34,78.64,77.44,76.45,76.19,75.90,75.76,75.57,74.55,74.35,73.66,71.86,71.68,71.36,70.79,67.91,67.75,67.50,66.24,60.06,59.80,58.57,55.92,54.17,52.82；ESI-MS:m/z calcd for C76H91N3O50S8,525.3；found,525.9[M-8Na+4H]4-；m/z calcd for C76H92N3O50S8Na,708.1；found,708.5[M-7Na+4H]3-。
实施例20：肝素五糖磺达肝素钠的制备
参考实施例1中的操作，化合物14经硫酸化步骤(a)，制得化合物26(产率：82％，纯度99％)，氢化步骤(c)制得化合物Q(磺达肝癸钠)(产率：93％，纯度99％)，具体的反应条件参见表1。
化合物26：
1H NMR(400MHz,MeOD)δ7.52–6.89(m,40H),5.65(d,J＝3.2Hz,1H),5.49(s,1H),5.44(d,J＝12.5Hz,1H),5.29(d,J＝3.3Hz,1H),5.16–4.98(m,8H),4.81(dd,J＝20.4,9.3Hz,3H),4.72(q,J＝6.9Hz,4H),4.64(s,1H),4.61–4.43(m,7H),4.43–4.13(m,8H),4.08(s,1H),4.05–3.77(m,6H),3.66(s,1H),3.58–3.38(m,9H).13C NMR(101MHz,MeOD)δ173.38,170.85,140.53,139.86,139.48,139.30,139.21,136.37,136.04,129.74,129.57,129.53,129.50,129.44,129.37,129.28,129.22,129.19,129.16,129.12,129.00,128.95,128.88,128.71,128.59,128.28,128.15,103.03,100.36,99.97,99.86,97.92,96.98,83.27,81.95,79.83,79.57,78.75,77.86,76.29,76.12,76.06,75.67,75.58,74.72,74.51,73.87,71.93,71.74,71.51,70.53,69.47,68.33,68.05,67.76,66.28,59.68,59.57,58.47,55.87,53.66；ESI-MS:m/z calcd for C88H99N3O50S8,563.3；found,563.9[M-8Na+4H]4-；m/z calcd for C88H99N3O50S8Na,758.8；found,759.1[M-7Na+4H]3-。
Q：Fondaparinux Sodium：
1H NMR(400MHz,D2O):δ5.47(d,J＝3.6Hz,1H),5.36(d,J＝3.3Hz,1H),5.02(d,J＝3.7Hz,1H),4.86(d,J＝3.5Hz,1H),4.46(d,J＝7.9Hz,1H),4.34–4.22(m,2H),4.22–3.98(m,6H),3.98–3.91(m,1H),3.91–3.51(m,7H),3.51–3.37(m,2H),3.37–3.21(m,4H),3.11(td,J＝10.2,3.6Hz,3H)；13C NMR(101MHz,D2O):δ175.22,173.99,100.98,99.41,98.12,97.39,95.92,77.04,76.94,76.66,76.12,76.09,75.95,75.90,72.72,72.60,70.98,70.19,70.06,69.64,69.59,69.41,68.83,68.40,66.56,66.16,65.83,57.82,57.56,56.49,55.28；ESI-MS:m/z calcd for C31H48N3O49S8Na2,516.0；found,516.4[M-8Na+5H]3-；m/z calcd for C31H50N3O49S8,501.3；found,501.9[M-10Na+7H]3-。
尽管本发明的内容已经通过上述优选实施例作了详细介绍，但应当认识到上述的描述不应被认为是对本发明的限制。在本领域技术人员阅读了上述内容后，对于本发明的多种修改和替代都将是显而易见的。因此，本发明的保护范围应由所附的权利要求来限定。