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1、(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利 (10)授权公告号 (45)授权公告日 (21)申请号 201510226690.7 (22)申请日 2015.04.22 (65)同一申请的已公布的文献号 申请公布号 CN 104862296 A (43)申请公布日 2015.08.26 (62)分案原申请数据 201510195795.0 2015.04.22 (73)专利权人 江南大学 地址 214122 江苏省无锡市滨湖区蠡湖大 道1800号 (72)发明人 周哲敏崔文璟刘中美周丽 夏媛媛 (74)专利代理机构 北京爱普纳杰专利代理事务 所(特殊普通合伙) 11419 代理人 张。
2、勇 (51)Int.Cl. C12N 9/88(2006.01) C12N 15/70(2006.01) C12N 1/21(2006.01) C12P 13/02(2006.01) C12R 1/19(2006.01) 审查员 徐丹 (54)发明名称 一种比酶活和稳定性提高的融合型腈水合 酶 (57)摘要 本发明公开了一种比酶活和稳定性提高的 融合型腈水合酶， 属于基因工程领域。 本发明将 来源于恶臭假单胞菌的腈水合酶在大肠杆菌中 高效表达并采用亚基融合策略提高稳定性及产 物耐受性。 本发明方法简单高效安全， 能够在较 短的表达周期里获得稳定性高， 产物耐受性强的 大量可溶性腈水合酶， 有利。
3、于在简单条件下进行 大规模工业生产， 以及进一步对融合型腈水合酶 成熟机制的理论研究。 权利要求书1页 说明书6页 序列表12页 附图2页 CN 104862296 B 2017.12.12 CN 104862296 B 1.一种融合型腈水合酶， 其特征在于， 所述腈水合酶融合表达了 亚基、 亚基和调控亚 基； 所述 亚基和 亚基的基因之间通过核苷酸序列为SEQ ID NO.5所述的linker连接； 所述腈水合酶的 亚基的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示， 亚基的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示， 调控亚基的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示； 所述腈水合酶按照 亚基、 亚基。
4、、 调控亚基的基因顺序表达； 所述腈水合酶的核苷酸序列是SEQ ID NO.7所示的序列。 2.含有权利要求1所述的腈水合酶编码基因的质粒载体。 3.表达权利要求1所述的腈水合酶的基因工程菌。 4.根据权利要求3所述的基因工程菌， 其特征在于， 所述基因工程菌是大肠杆菌。 5.一种权利要求4所述的基因工程菌的构建方法， 其特征在于， 所述方法是将SEQ ID NO.7所示的核苷酸序列克隆到表达载体pET-28a中， 然后转化到Escherichia coli BL21 中， 即得到基因工程菌。 6.权利要求1所述的腈水合酶在丙烯酰胺生产方面的应用。 权利要求书 1/1 页 2 CN 10486。
5、2296 B 2 一种比酶活和稳定性提高的融合型腈水合酶 0001 本申请是申请号为： 201510195795.0， 申请日为： 2015年04月22日， 申请名称为： 一 种比酶活和稳定性提高的融合型腈水合酶的分案申请。 技术领域 0002 本发明涉及一种比酶活和稳定性提高的融合型腈水合酶， 属于基因工程领域。 背景技术 0003 腈水合酶(Nitrile hydratase， 简称NHase， EC4.2.1.84)， 是一类可以催化腈类物 质通过水合作用反应转化为高附加值的酰胺类化合物的金属酶。 腈水合酶的结构编码基因 包括一个 亚基、 一个 亚基和一个调控亚基三个基因。 根据活性中心。
6、螯合的金属离子的不 同， 腈水合酶一般可以分为钴型腈水合酶(Co-NHase)和铁型腈水合酶(Fe-NHase)。 0004 腈水合酶在工业生产上已经被广泛应用， 其中用这种酶所生产的丙烯酰胺已近百 万吨， 占整个丙烯酰胺产量的三分之一。 生物技术相对于传统的化学合成法有着成本低、 能 耗少、 少污染的优势。 然而， 在工业生产中， 大部分具有高酶活的工业腈水合酶都存在着稳 定性差的缺点。 例如， 来源于Pseudomonas chlororaphilsB23和Rhodococcus sp.N-774的 腈水合酶在20的条件下保持稳定， 而来源于第三代腈水合酶工业生产用菌Rhodococcus。
7、 rhodochrous J1的腈水合酶也仅仅在1030的条件下稳定。 而且由于腈类水合反应是一 个放热的过程， 所以生产过程中必须通过降温来保持酶活的发挥， 因此导致了大量的能耗， 提高了生产成本。 在工业生产过程中， 除了要提高腈水合酶的热稳定性， 提高腈水合酶对高 浓度产物酰胺的耐受性也是很有必要的。 发明内容 0005 为了解决上述问题， 本发明提供一种提高腈水合酶稳定性和耐受性的分子改造方 法。 由于原始腈水合酶的亚基是分离的， 在高温条件下可能会解聚， 从而终止酶活。 通过分 子手段在基因水平上以共价键的方式融合两个亚基， 消除了亚基解聚的可能性。 从而使得 融合型腈水合酶的稳定性。
8、提高， 更适用于工业生产。 该策略具有广泛的通用性， 对不同来源 的亚基分离的腈水合酶均适用。 0006 本发明的第一个目的是提供一种比酶活和稳定性提高的融合型腈水合酶。 0007 所述腈水合酶融合表达了 亚基和 亚基并同时表达调控亚基， 或者融合表达 亚 基、 亚基和调控亚基。 0008 所述腈水合酶， 在本发明的一种实施方式中， 其基因顺序按照 亚基、 亚基、 调控 亚基这样的顺序。 0009 所述腈水合酶 ， 在本发明的一种实施方式中 ， 是从来源于恶臭假单胞菌 (Pseudomonas putida NRRL-18668)的序列为SEQ ID NO.1所示的腈水合酶改造得到的。 其 亚。
9、基、 亚基、 调控亚基的氨基酸序列与恶臭假单胞菌的相同。 0010 所述腈水合酶， 在本发明的一种实施方式中， 其 亚基的氨基酸序列是SEQ ID 说明书 1/6 页 3 CN 104862296 B 3 NO.2， 亚基的氨基酸序列是SEQ ID NO.3， 调控亚基的氨基酸序列是SEQ ID NO.4。 0011 所述 亚基和 亚基的基因之间通过核苷酸序列为SEQ ID NO.5所示的linker连 接。 0012 所述腈水合酶， 在本发明的一种实施方式中， 其核苷酸序列是SEQ ID NO.6或SEQ ID NO.7所示的序列。 0013 本发明的第二个目的是提供含有所述腈水合酶的质粒载。
10、体。 0014 本发明的第三个目的是提供表达所述腈水合酶的基因工程菌。 0015 所述基因工程菌， 在本发明的一种实施方式中， 是大肠杆菌。 0016 本发明的第四个目的是提供一种所述基因工程菌的构建方法。 0017 所述方法， 在本发明的一种实施方式中， 是将SEQ ID NO.6或SEQ ID NO.7所示的 核苷酸序列克隆到表达载体pET-28a中， 然后转化到Escherichia coli BL21中， 即得到基 因工程菌。 0018 本发明的第五个目的是提供一种利用所述基因工程菌发酵生产腈水合酶的方法， 其特征在于， 所述方法是： 将重组大肠杆菌接种于含有16g/L胰蛋白胨、 10。
11、g/L酵母提取物、 5g/L NaCl的培养基中， 于37培养至OD6000.8， 然后加入IPTG和CoCl26H2O进行诱导， 诱 导温度为24， 诱导16h。 0019 本发明的第六个目的是提供一种提高腈水合酶比酶活和热稳定性的方法。 0020 所述方法是融合表达腈水合酶的 亚基和 亚基并同时表达调控亚基， 或者融合表 达 亚基、 亚基和调控亚基。 0021 所述方法， 在本发明的一种实施方式中， 是按照 亚基、 亚基、 调控亚基的基因顺 序表达腈水合酶， 亚基、 亚基通过序列如SEQ ID NO.5所示的linker连接。 0022 本发明还要求保护所述腈水合酶的应用， 尤其是在丙烯酰。
12、胺生产方面的应用。 0023 本发明的有益效果： 0024 (1)本发明的酶， 相对于野生酶， 其比酶活提高、 热稳定性增强、 对产物的耐受性提 高， 可以克服现有的腈水合酶热稳定性不高、 底物耐受性不足的问题； 0025 (2)本发明的基于亚基融合的提高比酶活和热稳定性的方法， 利用亚基融合策略 将B和A基因用连接肽linker1融合为一个单独的肽段， 并在BA基因下游共表达调控蛋白 P14K基因， 避免了在高温条件下可能会亚基解聚， 提高了融合型腈水合酶的稳定性； 同时为 了避免P14K降解， 还可以在BA融合的基础上将P14K基因融合在A基因下游。 附图说明 0026 图1： 野生型腈水。
13、合酶和融合型腈水合酶在大肠杆菌中的表达电泳图； 其中泳道1 为marker， 泳道2为wild-type NHase， 泳道3为NHase-(BA)， 泳道4为NHase-(BA)P14K， 泳道5 为NHase-(BAP14K)； 0027 图2： 野生型腈水合酶和融合型腈水合酶在50处理时的半衰期； 0028 图3： 野生型腈水合酶和融合型腈水合酶的产物耐受性； 0029 图4： 野生型腈水合酶和融合型腈水合酶的最适pH。 具体实施方式 说明书 2/6 页 4 CN 104862296 B 4 0030 2YT培养基： 蛋白胨16g/L， 酵母浸膏10g/L， NaCl5g/L 0031 。
14、腈水合酶反应体系： 底物为500 l200mM的烟腈， 加入10 l适宜浓度的纯酶反应 10min后用500 l乙腈终止反应， 并离心去除沉淀， 取上清过0.22 m的膜后作为液相测定的 样品。 0032 腈水合酶HPLC检测： 流动相水乙腈缓冲液； 检测波长215nm； 色谱柱为C18柱。 0033 实施例1： 表达野生型腈水合酶BAP14K的重组菌的构建 0034 构建方法如下： 0035 (1)根据NCBI公开的恶臭假单胞菌的腈水合酶序列设计上游及下游引物， 通过PCR 得到原始腈水合酶基因ABP14K， 其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。 恶臭假单胞菌来源的腈 水合酶的 亚基的。
15、氨基酸序列如SEQ ID NO.2， 亚基的氨基酸序列如SEQ ID NO.3， 调控亚 基的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示。 0036 (2)利用限制性内切酶Nde I和Hind III同时处理扩增得到的腈水合酶基因和 pET-24a质粒， 并连接两酶切产物得到含有原始腈水合酶基因的表达载体， 得到pET-24a- ABP14K。 0037 (3)以B-up和B-down(BA)， A-up(BA)和A-down(AP)， P14K-up(AP)和P-down为引物， pET24a-ABP14K质粒为模板， 进行重叠PCR扩增。 首先以B-up和B-down(BA)扩增得到基因B， 。
16、以A-up(BA)和A-down(AP)为引物扩增得到基因A， 以P14K-up(AP)和P-down为引物扩增得到 基因P， 再取等量的基因B、 A和P， 以B-up和P-down为引物PCR扩增得到全长的基因BAP14K， 得 到野生型腈水合酶表达质粒pET-24a-BAP14K， 表达出的腈水合酶定义为wild-type NHase。 0038 (4)将上一步得到的质粒pET-24a-BAP14K转化大肠杆菌表达宿主BL21(DE3)， 验 证筛选阳性转化子， 即得到表达野生型腈水合酶BAP14K的重组菌。 0039 表1为本发明用到的引物。 0040 表1本发明中用到的引物 说明书 3。
17、/6 页 5 CN 104862296 B 5 0041 0042 注： 限制性酶切位点用斜体和粗体标出； 重叠序列部分用下划线标出。 0043 实施例2： 融合表达 亚基、 亚基的NHase-(BA)P14K的重组菌的构建 0044 构建方法如下： 0045 (1)基于野生型腈水合酶pET-24a-BAP14K， 设计引物Linker1-up和Linker1-down， 并用全质粒扩增方法连接B和A基因， 链接肽为linker1(序列如SEQ ID NO.5所示)， 得到 pET-24a-(BA)P14K， 设计上游及下游引物B-Nde I-up和P-Hind III-down， 通过PCR。
18、得到 (BA)P14K基因， 再利用限制性内切酶Nde I和Hind III同时处理扩增得到的腈水合酶基因 和pET-28a质粒， 并连接两酶切产物得到含有亚基融合型腈水合酶基因(序列为SEQ ID NO.6所示)的表达质粒pET-28a-(BA)P14K， 表达出的腈水合酶定义为NHase-(BA)P14K。 0046 (2)将上一步得到的质粒pET-28a-(BA)P14K转化大肠杆菌表达宿主BL21(DE3)， 验证筛选阳性转化子， 即得到融合表达 亚基、 亚基的NHase-(BA)P14K的重组菌。 0047 实施例3： 融合表达 亚基、 亚基、 调控亚基的NHase-(BAP14K)。
19、的重组菌的构建 0048 构建方法如下： 0049 (1)以pET-28a-(BA)P14K为模板， 设计引物Linker2-up和Linker2-down， 并用全质 粒扩增方法连接A和P14K亚基基因， 链接肽为linker2， 得到含有亚基融合型腈水合酶基因 (序列为SEQ ID NO.7所示)的表达质粒pET-28a-(BAP14K)， 表达出的腈水合酶定义为 NHase-(BAP14K)。 0050 (2)将成功构建的pET-28a-(BAP14K)质粒转化大肠杆菌表达宿主(Escherichia 说明书 4/6 页 6 CN 104862296 B 6 coli BL21(DE3)。
20、， 验证筛选阳性转化子， 即得到融合表达 亚基、 亚基、 调控亚基的NHase- (BAP14K)的重组菌。 0051 实施例4： 腈水合酶的表达及酶学性质分析 0052 本实施例是用实施例1-3得到的重组菌进行腈水合酶的表达。 0053 重组大肠杆菌首先在10ml的2YT液体培养基(卡那霉素终浓度为50 g/ml)中活化 培养， 温度为37， 然后以1的接种量转接至500ml的2YT液体培养基中， 待OD600达到0.8 时， 加入IPTG(终浓度为0.4mM)诱导， 并加入钴离子(终浓度为0.05g/l)以获得成熟酶， 然后 在24培养16小时。 收集成熟的大肠杆菌， 用SDS-PAGE检。
21、测表达量。 0054 SDS-PAGE结果显示， 本发明构建的野生型及融合型腈水合酶均可以在大肠杆菌中 大量表达， 如图1。 其中泳道3为仅融合表达了 亚基和 亚基、 不表达调控亚基的重组菌。 0055 (1)酶活力的比较： 0056 腈水合酶活力的测定： 将表达正常的大肠杆菌大量培养， 离心收集成熟的细胞， 用 0.01M的磷酸盐缓冲液(pH7.5)重悬， 反复离心重悬两次后， 用超声波破碎法破碎细胞， 离心 得到上清， 然后进行纯化， 得到纯化的酶测定酶浓度， 稀释到合适的酶浓度用HPLC检测酶 活。 0057 结果显示， 与野生型腈水合酶wild-type NHase相比， 融合型腈水合。
22、酶NHase-(BA) P14K的比酶活499.2U/mg， NHase-(BAP14K)的比酶活为452.5U/mg， 相比野生型腈水合酶 wild-type NHase的324.8U/mg， 分别提高了53.7、 39.3。 此外， 图1中泳道3的酶， 酶活仅 为69.1U/mg。 0058 同时， 还比较了wild-type NHase、 NHase-(BA)与NHase-(BA)P14K的反应动力学参 数。 结果显示， NHase-(BA)P14K和NHase-(BAP14K)的催化常数Kcat大约为wild-type NHase 的2倍， 表明NHase-(BA)P14K和NHase。
23、-(BAP14K)比wild-type NHase可以进行更快的催化反 应。 此外， NHase-(BA)P14K的kcat/Km值约为wild-type NHase的1.5倍， 表明NHase-(BA)P14K 具有更高的催化效率。 0059 (2)酶的热稳定性比较： 0060 比较方法： 首先将酶溶液加入空的EP管中， 置于50金属浴中处理， 处理一定时间 置于冰上， 然后再置于25金属浴中加入200mM烟腈底物进行反应， 反应十分钟后加入色谱 纯乙腈终止反应。 0061 热稳定性结果如图2所示。 在50温浴处理时， NHase-(BA)P14K的半衰期(26min) 是wild-type。
24、 NHase(9min)的3倍左右， 而NHase-(BAP14K)(18min)的半衰期为wild-type NHase的2倍左右。 0062 (3)腈水合酶产物耐受性比较 0063 比较方法： 反应体系内有20mM底物烟腈， 并加入或不加0.5M产物烟酰胺， 柱状图为 反应十分钟时检测到的底物减少量。 计算同一种酶在含有产物的反应体系中的底物减少量 占不含产物的反应体系中的底物减少量的比率， 来比较不同酶的产物耐受性。 0064 结果如图3所示。 0065 对于产物耐受性， 在含有产物烟酰胺的反应体系中， 与wild-type NHase相比， NHase-(BA)P14K和NHase-(。
25、BAP14K)的底物消耗量分别提高了26、 18。 在不含有烟酰胺 的反应体系中， 与wild-type NHase相比， NHase-(BA)P14K和NHase-(BAP14K)的底物消耗量 说明书 5/6 页 7 CN 104862296 B 7 分别提高了23、 15。 而对于酶自身， wild-type NHase的底物减少比率(含有产物的反应 体系中的底物减少量占不含产物的反应体系中的底物减少量的比率)为0.8， NHase-(BA) P14K和NHase-(BAP14K)的分别为0.86和0.83， NHase-(BA)P14K和NHase-(BAP14K)的比率均 比wild-。
26、type NHase高， 表明融合型腈水合酶具有更高的产物耐受性。 0066 (4)酶的最适pH值比较 0067 比较了wild-type NHase、 NHase-(BA)P14K和NHase-(BAP14K)在不同pH条件下的 酶活， 将各自在最适pH下的酶活定义为1(即100)， 结果如图4所示。 结果显示， 这3个酶的 最适pH都在7.5左右。 0068 以上数据表明， 通过融合表达 亚基和 亚基并同时表达调控亚基， 或者融合表达 亚基、 亚基和调控亚基， 能够显著提高腈水合酶的酶活力、 热稳定性和产物耐受性。 0069 虽然本发明已以较佳实施例公开如上， 但其并非用以限定本发明， 任。
27、何熟悉此技 术的人， 在不脱离本发明的精神和范围内， 都可做各种的改动与修饰， 因此本发明的保护范 围应该以权利要求书所界定的为准。 说明书 6/6 页 8 CN 104862296 B 8 0001 序列表 1/12 页 9 CN 104862296 B 9 0002 序列表 2/12 页 10 CN 104862296 B 10 0003 序列表 3/12 页 11 CN 104862296 B 11 0004 序列表 4/12 页 12 CN 104862296 B 12 0005 序列表 5/12 页 13 CN 104862296 B 13 0006 序列表 6/12 页 14 CN。
28、 104862296 B 14 0007 序列表 7/12 页 15 CN 104862296 B 15 0008 序列表 8/12 页 16 CN 104862296 B 16 0009 序列表 9/12 页 17 CN 104862296 B 17 0010 序列表 10/12 页 18 CN 104862296 B 18 0011 序列表 11/12 页 19 CN 104862296 B 19 0012 序列表 12/12 页 20 CN 104862296 B 20 图1 图2 说明书附图 1/2 页 21 CN 104862296 B 21 图3 图4 说明书附图 2/2 页 22 CN 104862296 B 22 。