技术领域
本发明涉及一种用于对微生物细胞进行杀菌的方法，其通过用聚乙二醇类非离子型表面活性剂处理微生物细胞或含有微生物细胞的培养物，以实现微生物细胞的实质上完全杀菌，同时维持在微生物细胞中表达的酶活性在高水平；以及由此产生的已杀菌的微生物细胞。
更具体地说，本发明涉及一种对微生物细胞进行杀菌的方法，其通过用可以用于食品中的聚乙二醇类非离子型表面活性剂处理微生物细胞，从而能够使用已杀菌的微生物细胞用于食品生产；以及含有已杀菌的微生物细胞的物质。
背景技术
用于制备食品的一些工艺可能需要使用由各种微生物产生的各种酶。也就是说，可以从微生物获得所预期的酶，并且用作食品的一种构成材料。
因而，在食品生产工艺中采用微生物细胞时，存在有活的微生物细胞可能泄漏且并入产品中从而引起二次微生物污染的问题。
为了解决这些问题，所述微生物细胞的泄漏通常通过在封闭系统中使具有高稳定性的微生物反应并且固定所用的微生物细胞来减到最少。然而，近年来，为了大规模生产特定的酶，已经快速地增加基因工程微生物的使用。当所述基因工程微生物用于食品生产工艺时，要求微生物细胞完全杀菌以确保食品安全。
微生物细胞完全杀菌的方法基本上分为两种方法，即使用物理手段的方法和使用化学手段的方法。使用物理手段的方法的实例可以包含进行加热、紫外线照射、电磁波照射、杀菌过滤等的方法。使用化学手段的方法的实例可以包含使用苯酚、乙醇、氧化剂、重金属离子、杀菌气体等的方法。
韩国专利第10-0501864号揭示使用化学手段对微生物细胞进行杀菌的方法的一个实例。
此公开案揭示一种使用阳离子型或两性表面活性剂对红球菌属(Rhodococcus)进行杀菌的方法，所述红球菌属是一种重组细菌。此方法提高了使用阳离子型表面活性剂的微生物细胞杀菌效率。然而，此方法有因为用苄索氯铵(benzethonium chloride)作阳离子型表面活性剂引起的一个问题。
苄索氯铵具有强杀菌力并且用于治疗鼻炎和口腔炎药物、用作嗽口水等等。然而，近来的研究报导苄索氯铵被认为是一种会干扰内分泌的代表性环境激素并且对人体非常有害。
因此，以上方法可能只能用于出于工业目的对微生物细胞进行杀菌的方法，在专门应用中没有引入人体的风险。在这方面，以上方法并非如本发明中所提出的可以用于食品生产的对微生物细胞进行杀菌的方法。
发明内容
技术问题
本发明的发明人进行彻底的调查以解决如上所述的问题，并且研发了一种使用可以用于食品的聚乙二醇类非离子型表面活性剂对微生物细胞进行杀菌的方法。
确切地说，本发明目的在于提供一种用于对微生物细胞进行杀菌的方法，其通过用聚乙二醇类非离子型表面活性剂处理微生物细胞或含有微生物细胞的培养物，使得所述微生物细胞实质上完全杀菌，同时维持在微生物细胞中表达的酶活性在高水平。
另外，本发明目的在于提供一种含有已杀菌的微生物细胞的物质，通过用聚乙二醇类非离子型表面活性剂处理微生物细胞，所述含有已杀菌的微生物细胞的物质能够用于食品生产。
此外，本发明目的在于提供一种含有已杀菌的微生物细胞的物质，通过用聚乙二醇类非离子型表面活性剂处理产生半乳糖和/或阿拉伯糖异构酶的棒状杆菌属(genus Corynebacterium)微生物细胞，所述含有已杀菌的微生物细胞的物质能够用于塔格糖生产。
技术解决方法
本发明涉及一种对微生物细胞进行杀菌的方法，其通过用聚乙二醇类非离子型表面活性剂处理微生物细胞；以及含有已杀菌的微生物细胞的物质。
根据本发明的一个方面，提供一种对微生物细胞进行杀菌的方法，其包含用聚乙二醇类非离子型表面活性剂处理微生物细胞或含有微生物细胞的培养物。
在本发明的一个实施例中，所述聚乙二醇类非离子型表面活性剂包含由醚型、酯型和含氮型聚乙二醇类非离子型表面活性剂所组成的族群中选出的至少一个。
在本发明的另一个实施例中，所述聚乙二醇类非离子型表面活性剂以基于微生物细胞或含有微生物细胞的培养物0.1％到10％的浓度使用。
在本发明的另一个实施例中，微生物细胞或含有微生物细胞的培养物的处理在0℃到70℃的温度下进行。
在本发明的另一个实施例中，所述微生物细胞是棒状杆菌属。
在本发明的另一个实施例中，所述微生物细胞是能够产生半乳糖和/或阿拉伯糖异构酶的棒状杆菌属。
在本发明的另一个实施例中，所述方法用于制备塔格糖的工艺中。
本发明的又一个实施例提供一种含有已杀菌的微生物细胞的物质，所述微生物细胞通过本发明的方法杀菌。
根据本发明的另一个方面，提供一种含有已杀菌的微生物细胞的物质，其中所述已杀菌的微生物细胞用于塔格糖的制备。
根据本发明的另一个方面，提供一种含有已杀菌的微生物细胞的物质，其能够用于食品生产并且包含：a)聚乙二醇类非离子型表面活性剂；以及b)半乳糖或阿拉伯糖异构酶。
有利作用
在根据本发明用于对微生物细胞进行杀菌的方法中，微生物细胞或含有微生物细胞的培养物用聚乙二醇类非离子型表面活性剂处理，从而实现微生物细胞实质上完全杀菌，同时允许在微生物细胞中表达的酶活性维持在高水平。
另外，根据本发明，用于对微生物细胞进行杀菌的方法防止在食品制备中产品由于微生物细胞泄漏而遭到二次污染并且促进随后工艺中微生物细胞的处理。
此外，本发明提供一种含有已杀菌的微生物细胞的物质，通过用聚乙二醇类非离子型表面活性剂对微生物细胞进行杀菌，所述物质能够用于食品生产。
此外，本发明提供一种含有已杀菌的微生物细胞的物质，通过用聚乙二醇类非离子型表面活性剂对能够产生半乳糖和/或阿拉伯糖异构酶的棒状杆菌属微生物细胞进行杀菌，所述物质能够用于食品生产。
附图说明
图1是显示实例2中在30℃下对微生物细胞进行杀菌后残余酶活性结果的图。
图2是显示实例2中在50℃下对微生物细胞进行杀菌后残余酶活性结果的图。
具体实施方式
最佳模式
在下文中，本发明的实施例将参考附图更详细地描述。对于本领域的技术人员显而易见的细节描述将在本文中省略。
根据本发明的一个方面，提供一种用于对微生物细胞进行杀菌的方法，其包含用聚乙二醇类非离子型表面活性剂处理微生物细胞或含有微生物细胞的培养物。
用于本发明的微生物细胞不具体限制，并且包含野生型和基因工程微生物的任何众所周知的微生物都可以使用。
微生物细胞优选地包含棒状杆菌属微生物细胞，更优选地谷氨酸棒状杆菌(Corynebacterium glutamicum)ATCC 13032。
谷氨酸棒状杆菌ATCC 13032在本领域中已知并且由国际保藏单位ATCC(美国马纳萨斯州的美国模式培养物保藏所(American Type Culture Collection,Manassas,USA))保藏。
可用于本发明的谷氨酸棒状杆菌ATCC 13032能够产生半乳糖(Galactose)和/或阿拉伯糖(Arabinose)异构酶(isomerase)并且可以进行基因重组以产生异构酶。
如本文所用，培养物可以指培养微生物细胞的培养基或培养液，以及含有微生物细胞在培养基或培养液中的培养结果的培养物。
培养物可以包含培养微生物细胞所需的营养来源，例如碳源、氮源等等，以及天然盐组分、氨基酸、维生素、核酸和/或培养基(或培养液)中通常含有的其它组分。
此外，培养物可以包含由微生物细胞产生和分泌的酶作为培养微生物细胞的结果。
如本文所用，术语“对微生物细胞进行杀菌”意指在相对高浓度的微生物细胞悬浮液中相应微生物细胞的活微生物细胞数实质上接近0。表述“实质上接近0”意指微生物细胞的存活率(杀菌后的活微生物细胞数/杀菌前的活微生物细胞数)是1/105或更小。
活微生物细胞数可以通过以下来计算：将微生物细胞悬浮液稀释到预定浓度，在其中微生物细胞有活力的培养基上散布(spreading)微生物细胞悬浮液，并且基于稀释比，测定培养基上活微生物细胞数。
根据本发明用于对微生物细胞进行杀菌的方法包含用聚乙二醇类非离子型表面活性剂处理微生物细胞或含有微生物细胞的培养物。表述“用聚乙二醇类非离子型表面活性剂处理”意指所有形式的处理，例如通过微生物细胞与聚乙二醇类非离子型表面活性剂直接接触，或通过含有微生物细胞的培养物与所添加的聚乙二醇类非离子型表面活性剂接触。杀菌可以在搅拌表面活性剂的同时进行。
在本发明中，可以使用聚乙二醇类非离子型表面活性剂，但不限于非离子型表面活性剂是聚乙二醇类表面活性剂的范围。
聚乙二醇类非离子型表面活性剂的实例可以包含醚型聚乙二醇类非离子型表面活性剂，例如聚氧乙烯等等；酯型聚乙二醇类非离子型表面活性剂，例如聚乙二醇脂肪酸酯等等；或含氮型聚乙二醇类非离子型表面活性剂，例如聚氧乙烯脂肪酰胺等等，不限于此。这些可以单独使用或两个或超过两个组合使用。
在本发明中聚乙二醇类非离子型表面活性剂优选为含氮型非离子型表面活性剂，例如聚氧乙烯脂肪酰胺。
在用聚乙二醇类非离子型表面活性剂处理微生物细胞或含有微生物细胞的培养物中，表面活性剂的浓度不具体限制。优选地，表面活性剂的浓度是基于微生物细胞或含有微生物细胞的培养物的0.1％到10％，更优选地0.5％到8％，例如1％到8％。
当所用表面活性剂的浓度小于0.1％时，难以实现微生物细胞的充分杀菌。当所用表面活性剂的浓度超过10％时，表面活性剂的量变得过多，其并不有效，并且有破坏酶活性的可能性。此外，已杀菌的微生物细胞中表面活性剂的含量增加，使得已杀菌的微生物细胞变得不适用于多种应用，例如食品生产等等。
根据本发明用于对微生物细胞进行杀菌的方法可以在任何温度下进行，只要温度不抑制由微生物细胞产生的酶的稳定性即可。优选地，用于对微生物细胞进行杀菌的方法在0℃到70℃，更优选地10℃到60℃的温度下进行。
当温度小于0℃或超过70℃时，由微生物细胞产生的酶可能被破坏，从而降低酶活性。
根据本发明，所述方法可以进一步包含添加酶的底物和/或底物类似物，以在不破坏酶活性下维持由相应微生物细胞产生的酶的稳定性。
在本发明的另一方面，所述方法可以用于生产塔格糖的工艺中。
根据本发明的另一方面，提供一种含有已杀菌的微生物细胞的物质，所述微生物细胞通过根据本发明的方法进行杀菌。
含有已杀菌的微生物细胞的物质可以包含已杀菌的微生物细胞和在杀菌前由微生物细胞产生的酶。
含有已杀菌的微生物细胞的物质可以通过对能够产生半乳糖和/或阿拉伯糖异构酶的棒状杆菌属微生物细胞，优选地谷氨酸棒状杆菌微生物细胞，更优选地谷氨酸棒状杆菌ATCC 13032微生物细胞进行杀菌来制备。
含有已杀菌的微生物细胞的物质可以包含半乳糖和/或阿拉伯糖异构酶。
含有已杀菌的微生物细胞的物质的使用不具体限制，并且含有已杀菌的微生物细胞的物质可以用于食品生产，优选地生产塔格糖的工艺中。
塔格糖是半乳糖的一种异构体并且是已知具有类似于果糖的物理和化学性质的天然糖。
塔格糖被FDA(食品与药物管理局(Food and Drug Administration))认为是GRAS(通常认为安全的)，并且批准其用作食品、饮料、健康食品、食物添加剂等的甜味剂。塔格糖没有副作用并且是几乎零卡路里的低热量糖。塔格糖是一种重要的甜味剂，它替代引起例如肥胖症、糖尿病等各种成人疾病的糖。
塔格糖可以利用生物学方法，通过使用半乳糖或阿拉伯糖异构酶使半乳糖或阿拉伯糖异构化来制备。
根据本发明的另一个方面，提供一种含有已杀菌的微生物细胞的物质，其能够用于食品生产并且包含：a)聚乙二醇类非离子型表面活性剂；以及b)半乳糖或阿拉伯糖异构酶。
如本文所用，术语“食品生产”可以包含其中含有已杀菌的微生物细胞的物质直接或间接用于食品生产的所有情况。
【本发明之模式】
然后，本发明将参考实例和比较实例更详细地描述。然而，应了解以下实例和比较实例仅为说明而提供并且不应以任何方式解释为限制本发明的范围。
实例1
与聚乙二醇类非离子型表面活性剂的浓度相关的微生物细胞的杀菌
将重组谷氨酸棒状杆菌ATCC 13032菌株用作为非离子型表面活性剂提供的不同浓度的含氮聚乙二醇类表面活性剂(日本协同有限公司的奈明S-215(Nymeen S-215,Nihon Yushi Co.,Ltd.)和吐温80(Tween 80)(聚氧乙烯脱水山梨糖醇单油酸酯)处理，以测定谷氨酸棒状杆菌ATCC 13032的杀菌程度和酶活性。用于进行所述测量的详细方法如下。
(1)谷氨酸棒状杆菌ATCC 13032的培养
含有10微克/毫升浓度的卡那霉素(kanamycin)的MB培养基(10克/升细菌用胰蛋白胨、5克/升细菌用酵母提取物、5克/升NaCl、5克/升大豆胨)用谷氨酸棒状杆菌ATCC 13032接种，使得初始浓度O.D.600是0.1，接着在30℃下培养24小时，以诱导重组半乳糖异构酶的表达。
含有3升含有10微克/毫升浓度的卡那霉素的突变培养基(80克/升葡萄糖、20克/升大豆胨、10克/升(NH4)2SO4、1.2克/升KH2PO4、1.4克/升MgSO4)的5升发酵缸用所得培养液接种，使得O.D.600是0.6，接着在30℃下培养20小时。
(2)微生物细胞的杀菌
制备由40ml含有微生物细胞的培养物构成的11个样本。表面活性剂未添加到第一样本，添加各种浓度(分别基于培养物的0.05％、0.1％、0.5％、1％以及5％)的聚乙二醇类非离子型表面活性剂(PEG)到第二样本到第六样本，并且添加各种浓度的吐温80到第七样本到第十一样本，接着将微生物细胞置于30℃下3小时以对微生物细胞进行杀菌。
(3)活微生物细胞数的测定
在微生物细胞杀菌后，11个样本施加于含有卡那霉素的MB琼脂培养基，接着在30℃下培养24小时，以测定活微生物细胞数。
(4)酶活性的测量
含有已杀菌的微生物细胞的培养物(含有已杀菌的微生物细胞的物质)经受8000x g(＝10,000rpm)离心10分钟，收获微生物细胞。无微生物细胞的培养物悬浮于含有300克/升半乳糖底物的50mM Tris-HCl缓冲溶液(从西格玛奥德里奇(Sigma-Aldrich)购买)(pH 7.5)中，接着在55℃下从半乳糖异构化成塔格糖，历时2小时。
异构化后，测量半乳糖异构酶的残余活性。
杀菌处理后的酶活性通过将反应结束后塔格糖的产生量与异构化开始时半乳糖的量比较来测量。
杀菌后，测量活微生物细胞数和残余酶活性。结果展示于表1中。
表1
实例2
与温度变化相关的使用聚乙二醇类非离子型表面活性剂对微生物细胞的灭菌
除了每种条件的两个样本用变化的类别和浓度的表面活性剂制备以制备22个样本并且用于杀菌处理的温度设置为30℃和50℃，杀菌通过与实例1中相同的程序进行。
杀菌后，测量活微生物细胞数和残余酶活性。结果展示于表2和表3中。
表2
表3
如表1到表3中所示，可以看出，当使用吐温80时，即使使用5％吐温80处理，微生物细胞也未完全杀菌。然而，当使用聚乙二醇类非离子型表面活性剂时，从0.5％的浓度，活微生物细胞数就开始显著减少并且在1％的浓度下微生物细胞完全杀菌。
此外，可以看出，与杀菌用相同浓度的吐温80进行的情况相比较，用聚乙二醇类非离子型表面活性剂杀菌显示出较高的残余酶活性。从使用聚乙二醇类非离子型表面活性剂杀菌后酶活性比酶未用所述表面活性剂处理的情况高的结果，确定表面活性剂可以促进酶与底物之间的相互作用。
不同的杀菌温度下的测量结果展示当微生物细胞在50℃下处理时杀菌更有效地进行。