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1、(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201610415873.8 (22)申请日 2016.06.14 (71)申请人 无锡源清天木生物科技有限公司 地址 214072 江苏省无锡市滨湖区建筑西 路777号A3幢2层 (72)发明人 王立言毕鲜荣 (51)Int.Cl. C12Q 1/02(2006.01) (54)发明名称 基于微流控芯片的单细胞液滴高通量筛选 方法 (57)摘要 本发明公开了一种基于微流控芯片的单细 胞液滴高通量筛选方法， 包含如下步骤： (1)在微 流控芯片上生成微生物单细胞液滴； (2)弃置。
2、未 包裹微生物液滴； (3)将培养后的微生物单细胞 液滴与小分子化合物生物传感器液滴在微流控 芯片上融合； (4)生物传感器响应融合液滴中的 代谢产物， 进行荧光检测和分选。 本发明提供的 高通量筛选方法， 通过在微流控芯片上进行单细 胞液滴培养， 相当于在芯片上构建上千个微型生 物反应器， 可以实现对待筛微生物细胞生长特性 的追踪和筛选； 通过液滴融合技术， 实现小分子 代谢产物生物传感器对含待筛微生物细胞液滴 的荧光标记， 进而实现对目标胞外产物的筛选。 权利要求书1页 说明书2页 附图1页 CN 107502648 A 2017.12.22 CN 107502648 A 1.基于微流控芯。
3、片的单细胞液滴高通量筛选方法， 其特征在于， 包括如下步骤： (1)在微流控芯片上生成微生物单细胞液滴； (2)弃置未包裹微生物液滴； (3)将培养后的微生物单细胞液滴与小分子化合物生物传感器液滴在微流控芯片上融 合； (4)生物传感器响应融合液滴中的代谢产物， 进行荧光检测和分选。 2.如权利要求1所述的高通量筛选方法， 其特征在于， 步骤(1)中所述微生物单细胞液 滴通过极端稀释、 油相包裹水相的方式实现。 3.如权利要求1所述的高通量筛选方法， 其特征在于， 步骤(2)中所述微生物单细胞液 滴经培养后产生胞外产物。 4.如权利要求3所述的高通量筛选方法， 其特征在于， 所述胞外产物为小分。
4、子化合物。 5.如权利要求4所述的高通量筛选方法， 其特征在于， 所述小分子化合物包括有机酸。 6.如权利要求1-5任一项所述的高通量筛选方法， 其特征在于， 所述步骤还包括所述融 合液滴的分离， 分离后的混合菌经过稀释涂布平板或者抗性筛选等手段可获得纯目标生产 菌株。 权利要求书 1/1 页 2 CN 107502648 A 2 基于微流控芯片的单细胞液滴高通量筛选方法 技术领域 0001 本发明涉及一种细胞筛选方法， 尤其涉及一种基于微流控芯片的单细胞液滴高通 量筛选方法。 背景技术 0002 近年来， 微流控芯片(MicrofluidicChip,MC)技术蓬勃发展， 并逐步进入产业化 。
5、时代。 微流控技术具有快速、 高效、 低耗等优点， 在生物学、 高通量药物筛选、 疾病诊断等众 多 应 用领 域 具 有 广阔 的 前 景 。 其中 ， 基 于 微 流 控 技 术的 微 液 滴 荧 光 筛 选 技 术 (Fluorescence-ActivatedDropletSorting,FADS)受到高通量筛选领域研究人员的高度 关注。 其核心是将待检样品和荧光标记物共同包裹在液滴内(油包水)， 从而实现待检样品 的流动检测和分选。 在我国， 中科院天津工业生物技术研究所的研究人员将该技术应用到 微生物培养胞外产物的包裹， 从而实现代谢物的高通量筛选， 其筛选效率可以达到10100 个。
6、液滴每秒。 然而， 这些工作在解决工业微生物高通量筛选方面仍然面临如下技术缺陷： (1)缺乏单细胞培养技术， 微生物的培养过程是在深孔板体系执行的， 其通量成为整体筛选 效率的瓶颈； (2)荧光标记体系采用传统的双酶偶联法， 成本高、 体系兼容性差， 应用范围有 限。 发明内容 0003 本发明的目的在于提供一种基于微流控芯片的单细胞液滴高通量筛选方法。 0004 本发明的技术方案如下： 一种基于微流控芯片的单细胞液滴高通量筛选方法， 其特征在于， 包括如下步骤： (1)在微流控芯片上生成微生物单细胞液滴； (2)弃置未包裹微生物液滴； (3)将培养后的微生物单细胞液滴与小分子化合物生物传感器。
7、液滴在微流控芯片上融 合； (4)生物传感器响应融合液滴中的代谢产物， 进行荧光检测和分选。 0005 其中， 步骤(1)中所述微生物单细胞液滴通过极端稀释、 油相包裹水相的方式实 现。 这种方法将不需要更低尺度的微流控芯片， 极大的降低了芯片的加工成本。 0006 其中， 步骤(2)中所述微生物单细胞液滴经培养后产生胞外产物。 0007 优选地， 所述胞外产物为小分子化合物。 0008 进一步优选地， 所述小分子化合物包括有机酸。 0009 上述步骤还包括所述融合液滴的分离。 培养后的微液滴和小分子生物传感器液 滴， 在芯片中进行融合， 形成新的检测液滴； 共培养后， 新的检测液滴将通过荧光。
8、检测并进 行评价， 并进行分离； 分离后的混合菌经过稀释涂布平板或者抗性筛选等手段可获得纯目 标生产菌株。 0010 有益效果： 本发明所提供的方法， 通过在微流控芯片上进行单细胞液滴培养， 相当 说明书 1/2 页 3 CN 107502648 A 3 于在芯片上构建上千个微型生物反应器， 可以实现对待筛微生物细胞生长特性的追踪和筛 选； 通过液滴融合技术， 实现小分子代谢产物生物传感器对含待筛微生物细胞液滴的荧光 标记， 进而实现对目标胞外产物的筛选。 这一独特的设计原理， 保证了在筛选目的产物表型 的同时不丢失生长优势表型， 大大提高筛选效率； 液滴融合技术不需要将生物传感器导入 待筛细。
9、胞中(这是FACS技术必须步骤)， 避免了基因操作， 特别适合于大量没有基因操作工 具的工业菌株的高效选育。 附图说明 0011 图1为本发明实施例的基于微流控芯片的单细胞液滴高通量筛选方法的原理图。 具体实施方式 0012 下面结合实施例， 进一步阐述本发明。 0013 图1给出了基于微流控芯片的单细胞液滴高通量筛选方法的原理图。 0014 第1步， 在微流控芯片上生成微生物单细胞液滴。 通过极端稀释、 油相包裹水相的 方式实现在微流控芯片每一个微液滴里包埋单个细胞， 进而在微流控芯片溶氧控制装置里 进行培养， 实现微生物的扩增、 目的待测产物的生成。 0015 第2步， 弃置未包裹微生物液。
10、滴。 0016 第3步， 经培养后微生物产生胞外产物， 比如有机酸等小分子化合物。 0017 第4步， 融合小分子化合物生物传感器液滴， 即将培养后的微生物单细胞液滴与小 分子化合物生物传感器液滴在微流控芯片上融合。 采用有别于FACS胞内荧光标记的技术路 线， 通过液滴融合技术将小分子生物传感器整合到检测系统中， 避免了基因操作， 特别适合 于大量没有基因操作工具的工业菌株的筛选。 0018 第5步， 生物传感器响应小分子代谢产物形成荧光， 用于测定和分选。 比如， 通过研 制特异性小分子生物传感器， 将微液滴中小分子的浓度与荧光强度偶联起来， 实现对该小 分子产量的实时高通量筛选。 将该调控蛋白系统置于大肠杆菌中， 做成特定有机酸分子的 生物传感器， 放入每个微液滴中， 则可通过荧光强度对各个微液滴中菌群产生有机酸的产 量进行表征并实现高通量筛选。 该方法不会对待测菌株的生长状态产生干扰， 特异性强， 灵 敏度高， 同时又适于菌群的整体检测。 0019 此外， 经混合液滴荧光检测、 分选后所得混合菌群， 可以通过简单的稀释涂布或者 抗性筛选等方法， 较为容易的获得目标生产菌株的单菌落。 说明书 2/2 页 4 CN 107502648 A 4 图1 说明书附图 1/1 页 5 CN 107502648 A 5 。