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1、(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201710990408.1 (22)申请日 2017.10.23 (71)申请人 中国水产科学研究院黑龙江水产研 究所 地址 150070 黑龙江省哈尔滨市道里区河 松街232号 (72)发明人 贾智英石连玉白姗姗张金凤 李池陶葛彦龙胡雪松王世会 尚梅 (74)专利代理机构 哈尔滨市文洋专利代理事务 所(普通合伙) 23210 代理人 何强 (51)Int.Cl. C12Q 1/42(2006.01) C12Q 1/34(2006.01) C12Q 1/26(2006.01) 。
2、(54)发明名称 指示鲤抗疱疹病毒能力的免疫指标 (57)摘要 指示鲤抗疱疹病毒能力的免疫指标， 涉及一 种指示鲤抗病毒能力的免疫指标。 本发明指示鲤 抗疱疹病毒能力的免疫指标包括碱性磷酸酶 (AKP)的活性。 本发明找到了指示鲤抗疱疹病毒 能力的免疫指标， 受感染后该鲤抗疱疹病毒能力 的免疫指标分子的活性与受感染鲤成活率一致， 说明本发明指示鲤抗疱疹病毒能力的免疫指标 能更准确的反应抗病性能。 权利要求书1页 说明书4页 附图3页 CN 107488703 A 2017.12.19 CN 107488703 A 1.指示鲤抗疱疹病毒能力的免疫指标， 其特征在于指示鲤抗疱疹病毒能力的免疫指标 。
3、包括碱性磷酸酶(AKP)活性。 2.根据权利要求1所述的指示鲤抗疱疹病毒能力的免疫指标， 其特征在于碱性磷酸酶 的活性为鲤脾和/或肾组织中的碱性磷酸酶活性。 3.根据权利要求1或2所述的指示鲤抗疱疹病毒能力的免疫指标， 其特征在于指示鲤抗 疱疹病毒能力的免疫指标还包括还原性谷胱甘肽(GSH)活性、 总抗氧化能力(T-AOC)水平和 溶菌酶(LZM)活性中至少一种。 4.根据权利要求3所述的指示鲤抗疱疹病毒能力的免疫指标， 其特征在于指示鲤抗疱 疹病毒能力的免疫指标还包括酸性磷酸酶(ACP)的活性。 5.根据权利要求3所述的指示鲤抗疱疹病毒能力的免疫指标， 其特征在于还原性谷胱 甘肽的活性为鲤肾。
4、组织中的还原性谷胱甘肽活性。 6.根据权利要求3所述的指示鲤抗疱疹病毒能力的免疫指标， 其特征在于总抗氧化能 力水平为鲤肾组织中的总抗氧化能力的高低。 7.根据权利要求3所述的指示鲤抗疱疹病毒能力的免疫指标， 其特征在于溶菌酶的活 性为鲤血清中溶菌酶活性。 权利要求书 1/1 页 2 CN 107488703 A 2 指示鲤抗疱疹病毒能力的免疫指标 技术领域 0001 本发明涉及一种指示鲤抗病毒能力的免疫指标。 背景技术 0002 固有免疫(innate immunity)是机体在种系发育和进化过程中形成的天然免疫防 御功能， 即出生后就已具备的非特异性防御功能， 也称为非特异性免疫(non-。
5、specific immunity)， 是生物在长期进化过程中形成的一系列防御机制。 与之相对应的是适应性免疫 (adaptive immunity)， 指出生后通过与抗原物质接触所产生的一系列防御功能。 0003 但固有免疫在种系内稳定遗传， 因此在品系选育过程中其抗性的形成和逐渐增强 主要是其特异性免疫得到了强化， 与固有免疫无关； 而且， 这种特定免疫抗性的提高往往可 能导致其固有免疫性水平相对低下。 0004 锦鲤疱疹病毒病(Kio herpesvirus disease.， KHVD)由鲤疱疹病毒3型(Cyprinid herpesvirus 3， CyHV-3)引起， 锦鲤、 镜鲤。
6、等对其易感。 鱼体感染该病后不立即发病， 当环境 水温达到1827条件时才可能发病， 该病具有难预防、 长期潜伏性及高传染性的特点。 该 病于1998年5月在以色列首次被发现， 致使以色列鲤鱼和锦鲤大量死亡， 死亡率达到90左 右。 随着锦鲤及其它鲤产品全球性贸易流动， 欧洲、 美国、 日本(Sano M et al.， 2004)等国 家均发现该病。 中国自2002年首次在进口的锦鲤中检出该病至今， 在大部分地区均发现该 病， 目前该病已呈全国范围内爆发的特点。 由于该病给世界渔业造成了严重地危害， 引起了 世界动物卫生组织(OIE)和世界粮农组织(FAO)的高度关注， 但目前仍无有效治疗方。
7、法， 该 病已给鲤养殖业造成了严重经济损失。 发明内容 0005 本发明的目的是找到用于指示鲤抗疱疹病毒能力的免疫指标。 0006 本发明指示鲤抗疱疹病毒能力的免疫指标包括碱性磷酸酶(AKP)； 该碱性磷酸酶 的活性为鲤脾和/或肾组织中的碱性磷酸酶活性。 0007 受鲤疱疹病毒3型病毒感染后， 鲤体内本发明指示鲤抗疱疹病毒能力的免疫指标 分子的活性与受感染鲤成活率一致， 说明本发明指示鲤抗疱疹病毒能力的免疫指标能更准 确的反应鲤个体及品系的抗病性能。 0008 本发明指示鲤抗疱疹病毒能力的免疫指标为固有免疫应答分子， 无需使用免疫增 强剂， 因此检定鲤抗疱疹病毒能力所获得的结果不受其他因素的干。
8、扰和影响， 具有反应速 度快、 准确性高、 可靠、 免疫稳定性好的优势。 0009 采用本发明技术可以准确的反应鲤品系的抗疱疹病毒能力， 对鲤品系选育具有指 导意义， 为提高鲤品质、 减少鲤养殖业经济损失奠定了基础。 附图说明 0010 图1是实施例1中染病后F1、 F2、 F3脾、 肾组织中酸性磷酸酶活性检测结果图。 说明书 1/4 页 3 CN 107488703 A 3 0011 图2是实施例1中染病后F1、 F2、 F3脾、 肾组织中还原性谷胱甘肽活性检测结果图。 0012 图3是实施例1中染病后F1、 F2、 F3脾、 肾组织中总抗氧化能力水平检测结果图。 0013 图4是实施例1中。
9、染病后F1、 F2、 F3血清中溶菌酶活性检测结果图。 0014 图5是实施例1中染病后F1、 F2、 F3脾组织中碱性磷酸酶活性检测结果图。 0015 图6是实施例1中染病后F1、 F2、 F3肾组织中碱性磷酸酶活性检测结果图。 具体实施方式 0016 本发明技术方案不局限于以下所列举具体实施方式， 还包括各具体实施方式间的 任意组合。 0017 具体实施方式一： 本实施方式指示鲤抗疱疹病毒能力的免疫指标包括碱性磷酸酶 (AKP)的活性。 0018 本发明所使用免疫指标均为固有免疫(非特异性)应答指标， 能在病毒感染初期快 速应答， 因而可以在病原感染短时间内对抗病和易感个体做出判别， 加快。
10、抗病品系选育历 程。 而且本发明的免疫指标均是从蛋白水平做出的应答机制， 蛋白是生理功能的执行者， 是 生命现象的直接体现者， 对功能基因编码蛋白质的研究将直接阐明生命在病理条件下的变 化。 以本发明指标用于鲤其他品种抗疱疹病毒品系选育可大大缩短选育历程。 0019 具体实施方式二： 本实施方式与具体实施方式一的不同点是： 碱性磷酸酶的活性 为鲤脾和/或肾组织中的碱性磷酸酶活性。 其它步骤及参数与实施方式一相同。 0020 具体实施方式三： 本实施方式与具体实施方式一或二的不同点是： 指示鲤抗疱疹 病毒能力的免疫指标还包括还原性谷胱甘肽(GSH)活性、 总抗氧化能力(T-AOC)水平和溶菌 酶。
11、(LZM)活性中至少一种。 其它步骤及参数与实施方式一或二相同。 0021 具体实施方式四： 本实施方式与具体实施方式三的不同点是： 指示鲤抗疱疹病毒 能力的免疫指标还包括酸性磷酸酶(ACP)的活性为鲤脾和/或肾组织中的酸性磷酸酶活性。 其它步骤及参数与实施方式三相同。 0022 酸性磷酸酶(ACP)的活性与鲤抗疱疹病毒能力呈负相关性。 0023 具体实施方式五： 本实施方式与具体实施方式三的不同点是： 还原性谷胱甘肽的 活性为鲤肾组织中的还原性谷胱甘肽活性。 其它步骤及参数与实施方式三相同。 0024 具体实施方式六： 本实施方式与具体实施方式三的不同点是： 总抗氧化能力水平 为鲤肾组织中的。
12、总抗氧化能力的高低。 其它步骤及参数与实施方式三相同。 0025 具体实施方式七： 本实施方式与具体实施方式三的不同点是： 溶菌酶的活性为鲤 血清中溶菌酶活性。 其它步骤及参数与实施方式三相同。 0026 实施例1 0027 自2004年以来相继开展了镜鲤抗疱疹病毒(CyHV-3)品系的选育， 获得选育世代 F1、 F2和F3(选育世代F1、 F2和F3均由中国水产科学研究院黑龙江水产研究所培育、 提供) 0028三个选育世代(F1、 F2和F3)分别在同一水域相邻网箱中进行养殖； 采用等( J et al.,2010)攻毒实验方法； 网箱养殖密度为60尾/m3， 水温为2227， 个体体 长。
13、为812cm。 0029 2016年度选育世代F1、 F2、 F3的锦鲤疱疹病毒病抗病成活率差异显著， 分别为 61.1、 88.6、 92.5。 显著性分析表明， F2、 F3代成活率较F1得到了显著性提高(P 说明书 2/4 页 4 CN 107488703 A 4 0.000)， 而F2、 F3代之间无显著差异， 说明F2、 F3代抗病性状基本达到了稳定。 0030 试剂盒检测镜鲤脾、 肾组织中酸性磷酸酶(ACP)、 碱性磷酸酶(AKP)、 还原性谷胱甘 肽(GSH)、 超氧化物歧化酶(SOD)、 总抗氧化能力(T-AOC)以及血清中补体C3、 补体C4、 溶菌酶 (LZM)共8个非特异。
14、免疫相关指标在F1、 F2、 F3的指标。 (碱性磷酸酶、 酸性磷酸酶、 还原型谷胱 甘肽、 总抗氧化能力检测试剂盒均购自南京建成生物工程研究所； 超氧化物歧化酶(SOD， WST-8法)、 总抗氧化能力(T-AOC， FRAP法)检测试剂盒购自碧云天生物技术研究所； 血清免 疫指标检测试剂盒购自南京建成生物工程研究所) 0031 攻毒、 待锦鲤疱疹病毒病爆发后在选育世代F1、 F2、 F3中各随机挑选50尾染病个体， 共计150尾。 将所有样本均液氮保存后， 转移至实验室-80超低温冰箱中。 准确称取0.1g组 织样品， 加入9倍体积预冷除菌的0.86生理盐水， 制成10组织匀浆(电动组织匀。
15、浆机， 匀 浆时间5秒/次， 间隙30秒， 连续3次， 冰水浴中研磨)， 将制备好的10匀浆用4离心机 3000r/min离心1015分钟， 取上清， 分装后低温保存并待用获得组织匀浆液。 0032 攻毒、 待锦鲤疱疹病毒病爆发后在选育世代F1、 F2、 F3中各随机挑选30尾无发病症 状的个体， 共计90尾。 尾静脉采血， 4静置6h， 4、 5000rpm/min离心15分钟， 取上清， 编号 并液氮保存获得血清样本。 0033 将每个选育世代选出的样本以6个为一组， 分别在脾、 肾组织中检测酸性磷酸酶 (ACP)、 碱性磷酸酶(AKP)、 还原性谷胱甘肽(GSH)、 超氧化物歧化酶(SO。
16、D)、 总抗氧化能力(T- AOC)水平； 分别在血清中检测补体C3、 补体C4、 溶菌酶(LZM)水平。 0034 实验所得数据均以平均值标准差(meanSD)形式表示， SPSS 17.0进行单因子 方差分析(one-way ANOVA)。 P0.05为存在显著性差异， 将实验结果进行Excel 2010作图。 0035 8个非特异免疫指标中， GSH和T-AOC在肾， 溶菌酶在血清、 AKP在脾和肾中， F1与F3、 F1与F2/F3皆出现显著差异(P0.05)， 如图26所示； ACP在脾中F1与F3、 F1与F2/F3皆出现 显著差异， 但其酶活性与个体免疫抗性呈负相关性， 如图1所。
17、示； 而另外3种非特异免疫指标 超氧化物歧化酶(SOD)和补体C3、 补体C4则未在F1与F2/F3中显示出明显差异。 说明ACP、 GSH、 T-AOC、 溶菌酶和AKP可作为鲤抗疱疹病毒的免疫学指示指标； 其中， 仅AKP在脾和肾两 组织中出现F2/F3与F1显著差异(P0.05)， 且仅AKP的显著性水平与对应群体受感染鲤成活 率一致， 说明AKP酶活性更易反应抗病性能， 将AKP与其它指标同时进行检测， 综合分析准确 性进一步提高。 0036 本实施方式中使用的药品、 试剂盒、 酶等均容易购得， 若无特殊要求则浓度为产品 标注浓度。 检测步骤参见试剂盒使用操作手册。 0037 实施例2。
18、 0038 取中国水产科学研究院黑龙江水产研究所培育的镜鲤和黑龙江野鲤作为实验对 象， 标记、 收集个体精子或卵子并人工授精后对其脾、 肾组织及血清进行检测， 每个个体进 行5组检测： 0039 第1组检测脾和肾组织中AKP的活性； 0040 第2组检测脾和肾组织中ACP的活性 0041 第3组检测脾、 肾组织中超氧化物歧化酶(SOD)的活性， 以及血清中补体C3、 补体C4 的水平； 检测方法和操作过程与实施例1相同。 0042 获得检测结果后， 对培育出的健康子代进行鲤疱疹病毒3型攻毒实验， 测定子代的 说明书 3/4 页 5 CN 107488703 A 5 成活率。 0043 实验结果， 每个亲代个体第1组的实验结果均与子代染病后存活率接近； 每个亲代 个体第2组的实验结果均与子代染病后存活率相反； 每个亲代个体第3组中各项实验的结果 自相矛盾， 而且与子代染病后存活率差异显著。 0044 实验证明本发明方法可以准确的反应鲤品系的抗疱疹病毒能力， 对鲤品系选育具 有指导意义。 说明书 4/4 页 6 CN 107488703 A 6 图1 图2 说明书附图 1/3 页 7 CN 107488703 A 7 图3 图4 说明书附图 2/3 页 8 CN 107488703 A 8 图5 图6 说明书附图 3/3 页 9 CN 107488703 A 9 。