中华鳖微卫星DNA标记.pdf

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1、(10)授权公告号 CN 101984055 B (45)授权公告日 2011.12.28 CN 101984055 B *CN101984055B* (21)申请号 201010528420.9 (22)申请日 2010.11.02 C12N 15/11(2006.01) C12Q 1/68(2006.01) (73)专利权人 安徽师范大学 地址 241000 安徽省芜湖市弋江区花津南路 安徽师范大学 (72)发明人 聂刘旺 卜兴江 刘罗 (74)专利代理机构 芜湖安汇知识产权代理有限 公司 34107 代理人 谢世红 CN 101368205 A,2009.02.18, 全文 . YANF。

2、U QUE.Isolation and characterization of microsatellites in Chinese. Molecular Ecology Notes .2007,(第 7 期 ),1265-1267. 魏振邦 . 中华鳖微卫星座位的分离与鉴 定 .大连水产学院学报 .2008, 第 23 卷 ( 第 4 期 ),304-308. (54) 发明名称 中华鳖微卫星 DNA 标记 (57) 摘要 本发明公开了中华鳖微卫星 DNA 标记， 包括 中华鳖微卫星 (CA)n、 (AAC)n、 (ACAG)n和 (GATA) n富集文库的构建， 微卫星序列的阳性克隆的筛选。

3、 及测序， 得到 63 个含有微卫星重复序列的克隆， 确定了 15 个多态性丰富的微卫星标记 PSW01、 PSW02、 PSW03、 PSW04、 PSW05、 PSW06、 PSW07、 PSW08、 PSW09、 PSW10、 PSW11、 PSW12、 PSW13、 PSW14、 PSW15 ； 本发明可应用于中华鳖不同地理种群的遗传多样 性研究以及亲权鉴定的研究， 重复性好， 是一种可 靠有效的分子标记。 (51)Int.Cl. (56)对比文件 审查员 李振鹏 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利 权利要求书 1 页 说明书 10 页 附图 15 页 CN 101。

4、984055 B1/1 页 2 1. 中华鳖微卫星 DNA 标记， 其特征在于 ： 所述的微卫星标记编号为 ： PSW01 其核苷酸序列为 ： PSW01 ： ctctctcacc cacatattcc cccatccatc caagaaacat gctgttgttt tgtatgatga 60 gaatagaaca gattaaaagg agaggattaa ctttcaagga gggtttagct agctatactt 120 acgggtgata ctttgaaatc atcacaaaca tttacgtcaa tcacatgttc catttaacga 180 tagatagata 。

5、gatagataga tagatagata gatagataga tagataggta gatagataga 240 tagatagata gatagataga tagataggta gatagccact attacagcaa atttaaaatg 300 ctgtataaaa gacaggtatt atataaaaga caggtattat cccagattta tagacacatg 360 atttgcagga aacaagtata ggatgttaaa atcccaattc agcaaaacac ttaagcacat 420 gcttaaatca cactgaagtg atcaggatt。

6、t aagtgctttg ctgaactgtt ta 472。 2. 根据权利要求 1 所述的中华鳖微卫星标记， 其特征在于 ： 所述的 PSW01 的引物序列 为 ： PSW01F ： TGTTGTTTTGTATGATGAGAA PSW01R ： ATTTGCTGTA ATAGTGGCT。 权 利 要 求 书 CN 101984055 B1/10 页 3 中华鳖微卫星 DNA 标记 技术领域 0001 本发明涉及一种分子标记技术， 具体涉及一种中华鳖微卫星 DNA 遗传标记。 背景技术 0002 微卫星 DNA 又称为短串连重复序列 (STR)、 简单重复序列 (SSR)、 简单序列长度多 。

7、态性 (SSLP)， 是指基因组中以 1-6 个核苷酸为单位串联重复组成的核苷酸序列 ； 其中， 最常 见的是双核苷酸重复， 如 (AC/TG)n 及 (AG/TC)n。不同的生物个体由于重复基序的重复次 数不同而显示出多态性。 研究表明， 可能是DNA复制过程中的 “链滑” (strand slippage)现 象造成微卫星 DNA 多态性信息容量 (polymorphic information content， PIC) 较高。微卫 星 DNA 的高突变性、 共显性表达及其在真核生物基因组中的普遍性， 使其成为群体遗传多 样性的分析、 亲缘关系的鉴定、 基因组作图和遗传育种的优越的分子标。

8、记， 与等位酶、 RAPD 方法相比也有一定的优越性。 由于微卫星具有数量多、 在基因组内分布均匀、 多态性信息丰 富、 易于检测等优点被作为优良的遗传标记 (genetic marker) 而得到广泛应用。根据重复 单元的构成与分布， 微卫星 DNA 序列被分为三种类型 ： 单一型 (pure)， 复合型 (compound)， 间断型 (interrupted)， 例如 ： 0003 单一型 ： CACACACACACACACACACA 0004 复合型 ： CACACACACACAGAGAGAGA 0005 间断型 ： CACATTCACACATTCATTCA 0006 中华鳖， 又称甲。

9、鱼、 王八、 水鱼、 元鱼、 团鱼、 脚鱼和老鳖， 英文名 ChineseSoftshell Turtle， 拉丁文名 (Pelodiscus sinensis)， 中国除宁夏、 新疆、 青 海及西藏未见报道外， 其余各省、 市、 自治区均有分布， 以长江流域和华南地区为多见 ； 国外分布于日本、 朝鲜和越 南。 中华鳖由于其药用价值和营养价值， 长期被大量消耗。 而且， 近年来的过度捕捞、 生境破 坏、 化学污染等， 已经导致中华鳖野生种群数量急剧下降。因此， 中华鳖已被作为易危物种 列入了 1998 年 中国濒危动物红皮书 和 2000 年 IUCN( 世界自然保护联盟 ) 濒危物种红色 。

10、名录中。 可见对野生种群的保护已经迫在眉睫了， 但要制定切实有效的保护计划， 就必须要 了解野生种群结构和遗传多样性等方面的信息。已经有学者采用不同的分子标记技术 ( 包 括线粒体细胞色素 b 基因序列、 12S rRNA、 RAPD 等 ) 对中华鳖的遗传多样性进行研究， 但是 上述遗传标记不能提供足够的遗传信息， 如张永正等， 中华鳖 (Pelodiscus sinensis)5 个 不同地理种群细胞色素 b 基因序列变异及种群遗传结构分析 ； 吴平等， 亚洲淡水和陆生龟 鳖类 12S rRNA 基因片段的序列分析和系统发生研究 ； 肖亚梅等， 中华鳖种群 RAPD 分析。为 了进一步了解。

11、中华鳖野生种群结构和遗传多样性等方面的信息， 需要开发新的分子遗传标 记。 发明内容 0007 本发明所要解决的技术问题在于 ： 分离克隆中华鳖微卫星 DNA 标记， 建立中华鳖 微卫星 DNA 的技术体系并利用这些分子标记进行中华鳖的分类， 亲权鉴定及遗传多样性的 说 明 书 CN 101984055 B2/10 页 4 分析。 0008 本发明解决技术问题的技术方案 ： 中华鳖微卫星 DNA 标记， 包括中华鳖微卫星 (CA)n、 (AAC)n、 (ACAG)n和 (GATA)n富集文库的构建， 含微卫星序列的阳性克隆的筛选及测 序， 得到 63 个含有微卫星重复序列的克隆， 确定了 22。

12、 个多态性丰富的微卫星标记 PSW01、 PSW02、 PSW03、 PSW04、 PSW05、 PSW06、 PSW07、 PSW08、 PSW09、 PSW10、 PSW11、 PSW12、 PSW13、 PSW14、 PSW15 ； PSW01为472个核苷酸、 PSW02为375个核苷酸、 PSW03为368个核苷酸、 PSW04 为 416 个核苷酸、 PSW05 为 346 个核苷酸、 PSW06 为 423 个核苷酸、 PSW07 为 337 个核苷酸、 PSW08 为 379 个核苷酸、 PSW09 为 291 个核苷酸、 PSW10 为 336 个核苷酸、 PSW11 为 3。

13、45 个核 苷酸、 PSW12 为 367 个核苷酸、 PSW13 为 356 个核苷酸、 PSW14 为 371 个核苷酸、 PSW15 为 396 个核苷酸。 附图说明 0009 图 1 ： PSW01 位点的引物扩增 22 只中华鳖基因组 DNA 的 STR 分型图 0010 图 2 ： PSW02 位点的引物扩增 22 只中华鳖基因组 DNA 的 STR 分型图 0011 图 3 ： PSW03 位点的引物扩增 22 只中华鳖基因组 DNA 的 STR 分型图 0012 图 4 ： PSW04 位点的引物扩增 22 只中华鳖基因组 DNA 的 STR 分型图 0013 图 5 ： PS。

14、W05 位点的引物扩增 22 只中华鳖基因组 DNA 的 STR 分型图 0014 图 6 ： PSW06 位点的引物扩增 22 只中华鳖基因组 DNA 的 STR 分型图 0015 图 7 ： PSW07 位点的引物扩增 22 只中华鳖基因组 DNA 的 STR 分型图 0016 图 8 ： PSW08 位点的引物扩增 22 只中华鳖基因组 DNA 的 STR 分型图 0017 图 9 ： PSW09 位点的引物扩增 22 只中华鳖基因组 DNA 的 STR 分型图 0018 图 10 ： PSW10 位点的引物扩增 22 只中华鳖基因组 DNA 的 STR 分型图 0019 图 11 ： 。

15、PSW11 位点的引物扩增 22 只中华鳖基因组 DNA 的 STR 分型图 0020 图 12 ： PSW12 位点的引物扩增 22 只中华鳖基因组 DNA 的 STR 分型图 0021 图 13 ： PSW13 位点的引物扩增 22 只中华鳖基因组 DNA 的 STR 分型图 0022 图 14 ： PSW14 位点的引物扩增 22 只中华鳖基因组 DNA 的 STR 分型图 0023 图 15 ： PSW15 位点的引物扩增 22 只中华鳖基因组 DNA 的 STR 分型图 0024 在图 1- 图 15 中， 1-22 分别代表 1-22 只中华鳖。 具体实施方式 0025 下面结合附。

16、图进一步详述本发明。 0026 1、 中华鳖微卫星 DNA 富集文库的构建 ： 0027 1.1 基 因 组 的 提 取 与 酶 切 ： 参 照 Sambrook 等 (2002， Molecular C1oning， 3nd463-471) 的方法提取中华鳖基因组 DNA， 用限制性内切酶 Sau3AI( 购自 TaKaRa 公司 ) 酶切基因组， 酶切产物在1琼脂糖凝胶上电泳， 紫外光下切下400-1000bp大小的DNA片段 并用胶回收试剂盒 ( 购自上海生工 ) 纯化回收的酶切产物。 0028 1.2 加接头 ： 0029 将纯化回收的酶切产物的两端加入接头 ： 0030 SauL-F。

17、(5 -GGCCAGAGACCCCAAGCTTCG-3 ) 说 明 书 CN 101984055 B3/10 页 5 0031 SauL-R(5 -PO4-GATCCGAAGCTTGGGGTCTCTGGCC-3 )， 0032 在 T4 连接酶 ( 购自 Promega 公司 ) 作用下 16水浴连接过夜。 0033 1.3PCR 检测接头连接 ： 0034 以 SauL-F 为引物， 以 1.2 工序制的连接产物为模板进行 PCR， 50L 反应体系如 下 ： 5L 10exTaq 缓冲液， 4L MgCl2， 4L dNTP， 0.25L exTaq 酶 ( 购自 TaKaRa 公 司 )。

18、， 2L 引物 SauL-F， 5L 连接产物， 加双蒸水 (ddH2O) 补至 50L。PCR 反应程序如下 ： 95预变性 5 分钟， 94变性 45 秒， 60退火 45 秒， 72延伸 1 分钟， 变性至退火三个步 骤重复 35 次， 72充分延伸 10 分钟。PCR 产物用纯化试剂盒 ( 购于 Axygen 公司 ) 进行纯 化。 0035 1.4 磁珠富集 ： 0036 将 1.3 所制的纯化产物与生物素标记的寡核苷酸探针杂交探针 (CA)12、 (AAC)8、 (ACAG)6和 (GATA)6分别在 72、 58、 67、 55下杂交 7 小时。将杂交液加入已平衡好的 磁珠， 室。

19、温放置 30 分钟。将离心管依次用洗涤缓冲液 (6SSC， 0.1 SDS ； 2SSC， 0.1 SDS ； 1SSC， 0.1 SDS) 于 45洗两次， 再用双蒸水室温洗一次。最后加双蒸水， 在 PCR 仪 上 95变性 15 分钟， 收集上清。 0037 1.5PCR 富集 ： 0038 以磁珠富集产物为模板， SauL-F 为引物进行 PCR 扩增， 50L 反应体系如下 ： 0039 富集后的 DNA30L， 5L 10exTaq 缓冲液， 4L MgCl2， 4L dNTP， 0.25L exTaq聚合酶， 2L引物SauL-F， 加双蒸水补至50L。 PCR反应程序如下 ： 9。

20、5预变性5分 钟， 94变性 40 秒， 60退火 45 秒， 72延伸 1 分钟， 变性至退火三个步骤重复 35 次， 72 充分延伸 10 分钟。PCR 产物用纯化试剂盒进行纯化。 0040 1.6 感受态细胞的制备 ： 0041 将 1mL 过夜培养的 E.coliDH5 培养液接于 50mL 液体 LB 培养基中， 37振荡培 养 2 小时至对数生长期 (OD600达到 0.3-0.5) 时取出。将菌液于 4离心 10 分钟。弃上清， 加入 1mL 0.1mol/L 预冷的 CaCl2重新悬浮细胞， 用枪头轻轻打匀。4离心 10 分钟。弃上 清， 加入预冷的甘油 /CaCl2混合物重新。

21、悬浮菌体， 用枪头打匀， -80保存。 0042 1.7 倒平板 ： 0043 将 LB 固体培养基完全融化， 冷却至 50左右， 配成 LB/Amp/X-Gal/IPTG 平板培养 基(比例为 ： LB固体培养基100mL ； 氨苄青霉素(Amp)100L ； 20异丙基-D-硫代半乳 糖苷 (IPTG)7L ； 2 5- 溴 -4- 氯 -3- 吲哚 -D- 半乳糖苷 (X-Gal)40L)， 混合均匀后 倒入一只培养皿里， 待培养基凝固后放入 37 烘箱， 晾干水蒸气。 0044 1.8 连接转化 ： 0045 取 1.5 工序所制的 PCR 富集后的纯化产物加入 pMD18-T 载体 。

22、( 购自 TaKaRa 公司 ) 于 16水浴连接 2 小时后， 放于 4冰箱过夜， 制成连接产物。 0046 取出 1.6 工序制成的感受态细胞， 冰上复苏至液态， 加入上述连接产物， 混匀。冰 浴 30 分钟后放入 42水浴锅， 热激 90 秒， 立即放入冰中冰浴 2 分钟， 加入新鲜的 LB 培养 基， 37振荡培养 1 小时。取 100L 培养液涂布于 LB/Amp/X-gal/IPTG 培养基上， 37倒 置培养过夜。 0047 2、 含微卫星序列的阳性克隆的筛选、 测序及微卫星引物的设计 ： 说 明 书 CN 101984055 B4/10 页 6 0048 2.1 菌落 PCR 。

23、： 0049 将平板上的白色单菌落分别放入事先装有 LB/Amp 培养基的 EP 管中。37振荡培 养至菌液浑浊。 12.5L PCR反应体系包括 ： Taq酶0.25U(购自TaKaRa公司)， 10Buffer 1.25L， dNTP 0.2M， MgCl22M， 引物 0.4M(SauL-F， primer-(CA)12、 (AAC)8、 (ACAG)6和 (GATA)6)， 菌液 0.5L， 加双蒸水补足体积。反应程序 ： 95预变性 5 分钟， 94变性 40 秒， 60退火 45 秒， 72延伸 1 分钟， 变性至退火三个步骤重复 35 次， 72充分延伸 10 分钟， 1.5琼脂。

24、糖凝胶电泳检测。 0050 2.2 阳性克隆测序及引物设计 ： 0051 阳性克隆送生物公司测序， 共得到 63 条含有微卫星 DNA 的序列。根据微卫星 DNA 侧翼序列， 利用软件 primerprimer5 设计 63 对微卫星引物。并对这 63 对引物进行 PCR 扩 增检测， 最终有 33 对引物能稳定扩增出目的条带。对这 33 对引物的上游引物 5 端分别用 FAM， HEX， TAMRA 进行荧光标记。 0052 3、 中华鳖多态性微卫星位点引物的筛选及结果分析 0053 3.1 筛选有多态性的引物 ： 0054 用 1.1 工序中 Sambrook 等提取基因组的方法提取 22。

25、 只中华鳖基因组。用 2.2 工 序设计所得的 33 对引物扩增基因组。反应程序 ： 95预变性 5 分钟， 94变性 40 秒， 60 退火 45 秒， 72延伸 1 分钟， 变性至退火三个步骤重复 35 次， 72充分延伸 10 分钟， 1.5 琼脂糖凝胶电泳检测。 PCR产物经ARI PRISM 3730遗传分析仪(Applied Biosystem公司) 进行基因分型(Genotyping)， 使用Genemarker1.6软件(Applied Biosystem公司)判读等 位基因片段的具体数值。共得到 15 个具有多态性的微卫星标记 ( 见表 1) ： PSW01、 PSW02、 。

26、PSW03、 PSW04、 PSW05、 PSW06、 PSW07、 PSW08、 PSW09、 PSW10、 PSW11、 PSW12、 PSW13、 PSW14、 PSW15 ； PSW01为472个核苷酸、 PSW02为375个核苷酸、 PSW03为368个核苷酸、 PSW04为416 个核苷酸、 PSW05 为 346 个核苷酸、 PSW06 为 423 个核苷酸、 PSW07 为 337 个核苷酸、 PSW08 为 379 个核苷酸、 PSW09 为 291 个核苷酸、 PSW10 为 336 个核苷酸、 PSW11 为 345 个核苷酸、 PSW12 为 367 个核苷酸、 PSW。

27、13 为 356 个核苷酸、 PSW14 为 371 个核苷酸、 PSW15 为 396 个核 苷酸。 0055 3.2 结果分析 ： 0056 使用 Cervus3.0 软件计算期望杂合度和观察杂合度。使用 Genepop4.0 软件计算 哈代一温伯格以及连锁不平衡的值， 以此来描述15个中华鳖微卫星DNA多态位点的特征。 0057 由附图 1-15 可看出， 本发明的 15 个微卫星序列的长度在供试的 22 只中华鳖中都 出现的多样性， 由此可见， 本发明的这 15 个微卫星标记能用于研究中华鳖的品种分类和遗 传关系分析。 0058 本发明提供了15个中华鳖的新的微卫星位点及扩增这15个微。

28、卫星位点的引物序 列和扩增方法， 可应用于中华鳖不同地理种群的遗传多样性研究以及亲权 鉴定的研究， 重 复性好， 是一种可靠有效的分子标记。 0059 表 1 引物特性表 ： 位点， 重复基序， 引物序列， 退火温度 0060 说 明 书 CN 101984055 B5/10 页 7 0061 序列表 0062 安徽师范大学 0063 中华鳖微卫星 DNA 标记 0064 1 0065 15 说 明 书 CN 101984055 B6/10 页 8 0066 PatentIn Version 3.3 0067 1 0068 472 0069 DNA 0070 中华鳖 (Pelodiscus s。

29、inensis) 0071 1 0072 ctctctcacc cacatattcc cccatccatc caagaaacat gctgttgttt tgtatgatga 60 0073 gaatagaaca gattaaaagg agaggattaa ctttcaagga gggtttagct agctatactt 120 0074 acgggtgata ctttgaaatc atcacaaaca tttacgtcaa tcacatgttc catttaacga 180 0075 tagatagata gatagataga tagatagata gatagataga tagataggta 。

30、gatagataga 240 0076 tagatagata gatagataga tagataggta gatagccact attacagcaa atttaaaatg 300 0077 ctgtataaaa gacaggtatt atataaaaga caggtattat cccagattta tagacacatg 360 0078 atttgcagga aacaagtata ggatgttaaa atcccaattc agcaaaacac ttaagcacat 420 0079 gcttaaatca cactgaagtg atcaggattt aagtgctttg ctgaactgtt 。

31、ta 472 0080 2 0081 375 0082 DNA 0083 中华鳖 (Pelodiscus sinensis) 0084 2 0085 tgccaatata gtctcagtag tatagacttg ccctaaaaga ttaaaatggc agatatgagg 60 0086 tcttctccta gaagcactgt gtgcaaaatt gtacactttc atatgcgcta tgtttgtcaa 120 0087 tgtcaaaaca aaacaaaaca aaacaaaaca aaacaacaac aacaacaaca aaaacctgct 180 0088 g。

32、tttttccct aagtgagatg ttctaacaac ttccttctag gacaaggtgg aaagtagcaa 240 0089 ttgctacctc cactagtatt agctgttttt ggtccaattc attacacttt gttcccaaac 300 0090 accaagaaaa gtgtattgct ctgatagcac ttactgtaga agagttttca gaagagagaa 360 0091 tccaatgtcc tcaca 375 0092 3 0093 368 0094 DNA 0095 中华鳖 (Pelodiscus sinensis)。

33、 0096 3 0097 gctataatgt ttgctaagtt ttcctatttt tccatgtatt ttgcagttag taagtgtttt 60 0098 aatgaaaatt acaattgctt tgaactggcc attctccttg gggccgtacc ggacgtttca 120 0099 cttgtatgca ttaatattga catataattg ctagacatag aattgcaaga tatctacaca 180 0100 tctttcgata gatagataga tagatagata gatagataga tagatagata gatagatt。

34、tg 240 0101 tgcatctgtc tgtctgtccc tgagtccatc tattccatct gtctgtctgg gagtccattt 300 0102 gtttaagaac tcctcctaaa ctgtaagaac aaggaccata caactcgaaa tttctcttgt 360 0103 cctaactt 368 0104 4 说 明 书 CN 101984055 B7/10 页 9 0105 416 0106 DNA 0107 中华鳖 (Pelodiscus sinensis) 0108 4 0109 tgagccaatt tccagatcgc cttgac。

35、tgat tttcaaatca cctgaccatc tgtttcaaat 60 0110 ttaagcatcc caaagtgcac aaagtctaaa tagataaggc aagtcttaaa ttatgtacag 120 0111 agtgatactt taaatgatag atagatagat agatagatag atagatagat agatagatag 180 0112 atagatagat agatagatag atagaattcc atccgcaggg ctatcgttaa ctttaaggca 240 0113 tataactgta tttgtatctg agagaaa。

36、aaa tcattgttga gataatatat ctgaagataa 300 0114 ctcacaaatg aatgcacaaa gtaagatggc agagagaaag tccaagggga ctcactaata 360 0115 atacttcaca cagaattgtt aagattgtca ttctgagata ttccagctag aattat 416 0116 5 0117 346 0118 DNA 0119 中华鳖 (Pelodiscus sinensis) 0120 5 0121 aatgatgcaa agagacaaat taagtgtttg atgcatattt t。

37、attcccctt gaacgcactc 60 0122 tgtctaaaaa taatagtgct attatttttg gacagccact ggcttagtgg ccaactgttt 120 0123 gattgctaga atgcaagttc ttaagtatag atagatagat agatagatag atagatagat 180 0124 agatagatag atagatagat agatagatag atagatagat agatagatag agttatgtga 240 0125 ttaaatgcca ttaccattat gcattccctg tttttgtgta at。

38、gcctgcat aagattttta 300 0126 gatggcataa agggaaacac tatgagcaaa atgttcctgt ttgatc 346 0127 6 0128 423 0129 DNA 0130 中华鳖 (Pelodiscus sinensis) 0131 6 0132 ggttggccac tttaagtgaa gcaggttcag ctcgctgatg ttagaggcaa atgtcccccc 60 0133 atttggccct gaggagagtc aggatgacac tgaattagag gtagtggaag acagaagata 120 0134。

39、 tagaagggta gctccagaaa agaagtgggg aaaggaggat gtggggaaat gctgaagaaa 180 0135 gcttcaggca gggaatgaac atccgtagtg gttaccccgg gatgggggta aaaacaacaa 240 0136 caacaacaac aacaacaaca acaaaacaac ctaggaagct gcttgaaacc ctttggaatg 300 0137 aagttaaatc ctgggagaag agatatggca tgtgaaagac tctcgttttc ctggaatgga 360 0138。

40、 agatatcctt attggctaac taatatatga aataccacta aggccttgca cccacctgct 420 0139 ccc 423 0140 7 0141 337 0142 DNA 0143 中华鳖 (Pelodiscus sinensis) 说 明 书 CN 101984055 B8/10 页 10 0144 7 0145 cttctccccc gaatcttttc caagccccac acatatcttc tttattactg tcaagtgctg 60 0146 tccccctctt ttgattccca acaatagatt tggactatcc 。

41、aagcttccga caagaaggtg 120 0147 agatagatag atagatagat agatagatag atagatagat agatagatag atagatagat 180 0148 agatagatag atagatagat agatagatag aggaattact tggggatact tctgtctgct 240 0149 cacaggacca tggacaaaca ggattatgga ttcgcttcaa cacagagtct aatagggata 300 0150 atttgtttta ttagtctcac tgcgtcactg ctactac 337。

42、 0151 8 0152 379 0153 DNA 0154 中华鳖 (Pelodiscus sinensis) 0155 8 0156 acttttggag aacaatcaaa ccccaaaata ttttgcttta gaaatgtcac cacactacct 60 0157 atttccccaa gaaggaagac tattgtgcat catggtgcat gcactatgta cagcctgcag 120 0158 gagagaccag accatgaggc atcatagctg tatttccaaa tcaatagata gatagataga 180 0159 tagatag。

43、ata gatagataga tagatagata gatagataga tagatagata gatagataga 240 0160 tagatagata gatagataga tagatatctt gcttaaaagt tccaagtatt agaggagtgg 300 0161 actaagaaca ctttccaaga aatgcctcca ctaacacaat aacactgtgc ttcctctcaa 360 0162 atttcagttt gtcagagaa 379 0163 9 0164 291 0165 DNA 0166 中华鳖 (Pelodiscus sinensis) 0。

44、167 9 0168 ctagaaatct agctctgcta tgatgttggt cgaaggtgaa aaaaggtgtt aaaatgcagt 60 0169 aatgcttgga tgaatgattt ataacaaaat aatgtaggca cataatttga gaaagtgtgt 120 0170 gtgtgtgtgt gtgtgtgtgt gtgtgtgtgt gtaaaagagg gggtggggga agagagagat 180 0171 tgtcactcat tacattattt cccttcccag caaacaaaca tattatagaa gcatttcaaa。

45、 240 0172 tcatgtttcc taagctgtgg agcatacgaa tgaaagctta attgtttgtc t 291 0173 10 0174 336 0175 DNA 0176 中华鳖 (Pelodiscus sinensis) 0177 10 0178 attattaccg tggtacctag gagccctcgt tatagaccag gaccccctta tttagatacc 60 0179 tccgcctttt aatggatttc ctgccctagg aatctgccat tttagataga tagatagata 120 0180 gatagataga。

46、 tagatagata gatagataga tagatagata gatagataga ttccatctca 180 0181 ttcactctgt gaggtaacta attcctgcta tggaagaacc ttccctccca atacccaaat 240 0182 ctgagactgc taccacatcc catcagggta actccagtgg gacacaccag ctcttctgtt 300 说 明 书 CN 101984055 B9/10 页 11 0183 ttcagcgact gtgaggattt ctctcagcta tgtgca 336 0184 11 018。

47、5 345 0186 DNA 0187 中华鳖 (Pelodiscus sinensis) 0188 11 0189 tacaaaaaat cattcaatag taattatggg ataatctgct ccagagaaag tttcttctta 60 0190 atccttaata ggtagaggtt gtcttattct ctgcagcagg agagtttata tctctttcaa 120 0191 aactcatttt tggtattgtt tgtttgtagg gatttatttt aaatcctcac tgttatatgt 180 0192 ccagagtgta gataga。

48、taga tagatagata gatagataga tagatagata gatagataga 240 0193 tagatagata gatagataga tagatagata gatagataga tagatagata tccaactctc 300 0194 taagtctaaa ttggttcatt tgtttttagt aaggcttgtg agatc 345 0195 12 0196 367 0197 DNA 0198 中华鳖 (Pelodiscus sinensis) 0199 12 0200 tagggtcctt ctcccatgaa ggatttttat tcttttatct ggttgatttc tcttaacgta 60 0201 atccagcaaa ggataccatc accaagcaca cacacacaca cacacacaca cacacacaca 120 0202 ctgccttgaa tcaggtgacc tcaaagggtt tgtctaca。