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发明背景
腺病毒是双链DNA病毒，基因组大小约为36千碱基(kb)，由于能够在多 种靶组织中实现高效基因转移以及较大的转基因容量，它被广泛用于基因转移 应用。通常，腺病毒的E1基因缺失，被取代为由所选启动子、感兴趣基因cDNA 序列和聚A信号组成的转基因盒，产生复制缺陷型重组病毒。
腺病毒的形态特征是由三种主要蛋白和许多群体小蛋白VI、VIII、IX、IIIa 和Iva2组成的二十面体衣壳，这三种主要蛋白是六邻体(II)、五邻体基质(III) 和突结尾丝(knobbed fibre)(IV)[W.C.Russell，J.Gen Virol.，81：2573-3704(2000 年11月)]。病毒基因组为线性双链DNA，末端蛋白共价连接于含有末端反向 重复(ITR)的5’末端。病毒DNA与高碱性蛋白VII和小肽pX(之前称为mu)密 切相连。另一种蛋白V与此DNA-蛋白复合物包装在一起，并通过蛋白VI提 供与衣壳的结构连接。该病毒也含有病毒编码的蛋白酶，这种蛋白酶是加工某 些结构蛋白以产生成熟的感染性病毒所必需的。
已经开发了一种对包括人、猿猴、牛、马、猪、羊、犬和负鼠腺病毒在内 的哺乳动物腺病毒家族进行分类的方法。这种分类方法的开发基础是该家族内 的腺病毒序列凝集红血细胞的能力不同。结果得到了六个亚组，现在称为亚组 A、B、C、D、E和F。参见T.Shenk等，Adenoviridae：The Viruses and their Replication(腺病毒科：病毒及其复制)，第67章，选自FIELD′S VIROLOGY(菲 尔德病毒学)，第6版，B.N Fields等编，(LR出版社(Lippincott Raven Publishers)， 费城，1996)，第111-2112页。
已报道可使用重组腺病毒将异源分子递送至宿主细胞。参见美国专利 6,083,716，它描述了两种黑猩猩腺病毒的基因组。猿猴腺病毒C5、C6和C7 已经描述于美国专利7,247,472，它可用作疫苗载体。其他黑猩猩腺病毒描述于 WO 2005/1071093，可用于制造腺病毒疫苗载体。
本领域需要能有效递送分子到靶点并尽可能降低人群中已有的免疫力对所 选腺病毒血清型的影响的载体。
发明概述
本文提供了亚家族E中五种新型猿猴腺病毒的分离的核酸序列和氨基酸序 列以及含有这些序列的载体。还提供了许多使用本发明所述载体和细胞的方 法。这些腺病毒包括SAdV-39、SAdV-25.2、SAdV-26、SAdV-30、SAdV-37 和SAdV-38。
本文所述方法包括通过给予本发明所述载体将一种或多种所选异源基因递 送到哺乳动物患者。用本文所述组合物进行接种能够呈递所选抗原从而引发保 护性免疫反应。基于这些猿猴腺病毒的载体也可用于在体外制造异源基因产 物。这种基因产物本身可用于各种目的，例如本文所述的。
本文将更加详细地描述本发明的这些和其他实施方式以及优点。
具体实施方式
本发明提供了全部分离自黑猩猩排泄物的猿猴腺病毒39、SAdV-25.2、 SAdV-26、SAdV-30、SAdV-37和SAdV-38的新的核酸和氨基酸序列。
还提供了新型腺病毒载体和产生基于这些序列的载体的包装细胞系，用于 在体外产生重组蛋白质或片段或其它制剂。本发明还提供了用于递送治疗或疫 苗目的的异源分子的组合物。这些治疗性或疫苗组合物含有携带插入的异源分 子的腺病毒载体。此外，所述新型SAdV序列可用于提供产生重组腺相关病毒 (AAV)载体所必需的辅助功能。因此，提供了在此种产生方法中利用这些序列 的辅助构建物、方法和细胞系。
术语“基本上同源”或“基本上相似”指核酸或其片段时，表示当任选地将含 相应核苷酸插入或缺失的序列与另一核酸(或其互补链)排列对比时，对比的序 列至少约95-99％核苷酸序列相同。
术语“基本上同源”或“基本上相似”指氨基酸或其片段时，表示当任选地将 含相应氨基酸插入或缺失的序列与另一氨基酸(或其互补链)排列对比时，对比 的序列至少约95-99％的氨基酸序列相同。优选在全长序列，或其蛋白，或其 至少8个氨基酸、或更理想至少15个氨基酸长度的片段上具有上述同源性。 本文描述了合适片段的实例。
本文核酸序列所用术语“序列同一性百分率”或“相同”指当作最大排列对比 时两个序列中的残基相同。当将一个序列与另一个序列进行比对需要缺口时， 根据没有缺口罚分的较长序列计算评分程度。保留多核苷酸或由其编码的多肽 的功能的序列最相同。序列同一性比较的长度需要是基因组全长(例如，约 36kbp)、基因的开放读框的全长、蛋白、亚基、或酶[参见，例如提供腺病毒编 码区域的表]、或至少约500到5000个核苷酸的片段。然而，也可能要求较小 片段之间的同一性，例如至少约9个核苷酸、通常至少约20到24个核苷酸、 至少约28到32个核苷酸、至少约36或更多核苷酸的片段。类似地，蛋白全 长或其片段的氨基酸序列的“序列同一性百分比”可容易地确定。适宜的是，片 段长度至少为大约8个氨基酸，也可长达大约700个氨基酸。本文描述了合适 片段的实例。
同一性可使用文中所述用默认设置的算法和计算机程序来容易地确定。优 选在蛋白质、酶、亚基的全长或至少约8个氨基酸长度的片段上具有这种同一 性。然而，这种同一性可基于较短的区域，适合产生相同的基因产物的区域。
如本文所述，用各种从公共渠道获得或购得的多序列比对程序(Multiple Sequence Alignment Programs)进行比对，例如可通过互联网Web服务器获得的 “Clustal W[Thompson等，1994，Nucleic Acids Res，22，4673-4680]。或者，也可 使用载体NTI实用程序[英杰公司(InVitrogen)]。还有许多本领域已知的算法 也可用于测量核苷酸序列同一性，包括包含在上述程序中的算法。作为另一个 实例，可使用GCG 6.1版中的程序FastaTM来比较多核苷酸序列。FastaTM可 得出查询序列与检索序列之间最佳重叠区域的比对和序列同一性百分比。例 如，可使用GCG 6.1版提供的FastaTM及默认参数(字长为6和用于计分矩阵 的NOPAM系数)来确定核酸序列之间的序列同一性百分比，该程序此处引用 作为参考。可采用相似程序进行氨基酸比对。虽然本领域技术人员可视需要改 变设置，但通常这些程序都以默认设置使用。或者，本领域技术人员也可采用 能够象上述算法和程序一样得出同一性水平或进行比对的其他算法和计算机 程序。
“重组”用于多核苷酸时表示该多核苷酸是克隆、限制或连接步骤以及产生 不同于天然发现的多核苷酸的构建物的其他过程的不同组合的产物。重组病毒 是包含重组多核苷酸的病毒颗粒。该术语分别包括原始多核苷酸构建物的复制 物以及原始病毒构建物的子代。
“异源”表示衍生自一种与其所比较的实体的其余部分在基因型上不同的实 体。例如，通过遗传工程技术引入来源于不同物种的质粒或载体的多核苷酸是 异源多核苷酸。从其天然编码序列上取下并操作性连接于天然情况下不连接的 编码序列的启动子是异源启动子。已被克隆入病毒基因组或病毒载体中的位点 特异性重组位点是异源重组位点，其中所述病毒基因组在天然情况下不含该位 点。当具有重组酶编码序列的多核苷酸被用于遗传改变正常情况下不表达该重 组酶的细胞时，多核苷酸和重组酶对于该细胞而言都是异源的。 如本说明书和权利要求书中所用的术语“包含”和其变形形式，包括“含有”、“包 括”等其它形式指包含其它组分、元素、数值、步骤等。术语“由…组成”不包 括其它组分、元件、整数、步骤等。
I.猿猴腺病毒序列
本发明提供了分离自与腺病毒天然相关的其它材料的猿猴腺病毒39 (SAdV-39)、SAdV-25.2、-26、-30、-37或-38的核酸序列和氨基酸序列。
A.核酸序列
本发明的SAdV-39核酸序列包括SEQ ID NO：1的核苷酸1-36553。本发明 的SAdV-25.2核酸序列包括SEQ ID NO：130的核苷酸1-36629。本发明的 SAdV-26核酸序列包括SEQ ID NO：162的核苷酸1-36628。本发明的SAdV-30 核酸序列包括SEQ ID NO：98的核苷酸1-36621。本发明的SAdV-37核酸序列 包括SEQ ID NO：33的核苷酸1-36634。本发明的SAdV-38核酸序列包括SEQ ID NO：65的核苷酸1-36494。
见纳入本文参考文献中的序列表。一实施方式中，本发明的核酸序列还包 括分别与SEQ ID NO：1、130、162、98、130或65的序列互补的链，以及与 以下序列和它们的互补链的序列相对应的RNA和cDNA序列。在另一个实施 方式中，所述核酸序列还包括与序列表有98.5％以上，更优选约99％以上同一 性的序列。一个实施方式中还包括SEQ ID NO：1、130、162、98、130或65 中所提供序列以及它们互补链的天然变体和工程构建修饰物。例如，这种修饰 包括本领域已知的标记、甲基化、以及用简并核苷酸取代一个或多个天然产生 的核苷酸。
一实施方式中，提供了SAdV-39，SAdV-25.2、-26、-30、-37或-38的序列 以及它们的互补链、与其互补的cDNA和RNA的片段。合适的片段在长度上 至少有15个核苷酸，并包含功能性片段，即在生物学上感兴趣的片段。例如， 功能性片段可表达所需的腺病毒产物，或用于产生重组病毒载体。这种片段包 含下表所列的基因序列和片段。下表提供了SAdV-39、SAdV-25.2、-26、-30、 -37或-38序列的转录区和开放阅读框。对于某些基因，其转录区和开放阅读框 (ORF)位于与SEQ ID NO：1、130、162、98、130或65的互补链上。见例如 E2b、E4和E2a。还显示了其编码蛋白的分子量。注意，SAdV-39、SAdV-25.2、 -26、-30、-37或-38的E1a开放阅读框和E2b开放阅读框含有内部剪接位点。 这些剪接位点在下表中标出。
SAdV-39、SAdV-25.2、-26、-30、-37或-38腺病毒核酸序列可用于治疗制 剂和构建各种载体系统和宿主细胞。如本文所用，载体所包含的适合的核酸分 子包括，裸DNA、质粒、病毒、粘粒或游离体。这些序列和产物可单独应用， 或与其它腺病毒序列或片段联用，或与其它腺病毒或非腺病毒序列的元件联 用。所述SAdV-39、SAdV-25.2、-26、-30、-37或-38序列序列还可作为反义 递送载体、基因治疗载体或疫苗载体应用。因此，本发明还提供含有所述 SAdV-39、SAdV-25.2、-26、-30、-37或-38序列的核酸分子、基因递送载体和 宿主细胞。
例如，本发明包括含有本发明猿猴Ad ITR序列的核酸分子。另一实施方 式中，本发明提供含有编码所需Ad基因产物的本发明猿猴Ad序列的核酸分 子。本领域技术人员在阅读了本文提供的信息后不难明白采用本发明序列构建 其它核酸分子。
一实施方式中，本文鉴定的猿猴Ad基因区域可用于载体向细胞递送异源 分子。例如，为在包装宿主细胞中产生病毒载体的目的而产生表达腺病毒衣壳 蛋白(或其片段)的载体。可设计顺式表达的这类载体。或者，可设计这类载体 来提供稳定含有能表达所需腺病毒功能的序列，如E1a、E1b、末端重复序列、 E2a、E2b、E4、E4ORF6区域的细胞。
此外，所述腺病毒基因序列或其片段可用于提供产生辅助依赖性病毒(如缺 失了必须功能的腺病毒载体或腺相关病毒(AAV))所必须的辅助功能。对于这种 产生方法，本发明的SAdV-39、SAdV-25.2、-26、-30、-37或-38序列以类似 于人Ad所述的方式用于此方法中。然而，由于本发明的SAdV-39、SAdV-25.2、 -26、-30、-37或-38序列和人Ad序列之间的序列差异，采用SAdV-39、 SAdV-25.2、-26、-30、-37或-38序列大大降低或消除了在带有人Ad E1功能 的宿主细胞，如在rAAV产生时可产生传染性腺病毒污染物的293细胞中与辅 助功能同源重组的可能性。
在许多关于人腺病毒血清型的文献中已详细描述了利用腺病毒辅助功能 产生rAAV的方法。见例如美国专利6,258,595和其中引用的参考文献。也可 见美国专利5,871,982；WO 99/14354；WO 99/15685；WO 99/47691。这些方 法也可用于产生非人血清型AAV，包括非人灵长动物AAV血清型。提供必须 辅助功能(如E1a、E1b、E2a和/或E4ORF6)的SAdV-39、SAdV-25.2、-26、-30、 -37或-38序列尤其可用于提供必须的腺病毒功能，同时尽量减少或消除与人 类来源典型的rAAV-包装细胞中存在的任何其它腺病毒的重组可能性。因此， 这些rAAV产生方法中，可采用选出的SAdV-39、SAdV-25.2、-26、-30、-37 或-38序列的基因或开放阅读框。
或者，这些方法中可采用重组SAdV-39、SAdV-25.2、-26、-30、-37或-38 载体。这类重组猿猴腺病毒载体可包括，例如杂交的黑猩猩Ad/AAV，其中黑 猩猩Ad序列侧接由AAV 3′和/或5′ITR组成的rAAV表达盒，和在控制其表达 的调控序列控制下的转基因。本领域技术人员会懂得其它猿猴腺病毒载体和/ 或SAdV-39、SAdV-25.2、-26、-30、-37或-38基因序列还可用于产生依赖腺 病毒辅助的rAAV和其它病毒。
在另一实施方式中，设计了用于能在宿主细胞中递送和表达所选腺病毒基 因产物以实现所需生理效应的核酸分子。例如，可将含有编码SAdV-39、 SAdV-25.2、-26、-30、-37或-38E1a蛋白序列的核酸分子递送给患者，用于癌 症治疗。任选地，可用液体载体配制此分子，优选靶向癌细胞。这类制剂可与 其它癌症治疗剂(如顺铂、紫杉醇等)联用。本领域技术人员不难明白，本文提 供的腺病毒序列还有其它用途。
此外，本领域技术人员不难理解，SAdV-39、SAdV-25.2、-26、-30、-37或 -38序列不难适用于各种病毒和非病毒载体系统以在体外、离体或体内递送治 疗性和免疫原性分子。例如，在各种rAd和非rAd载体系统中可采用SAdV-39、 SAdV-25.2、-26、-30、-37或-38猿猴Ad序列。这些载体系统可包括，如质粒、 慢病毒、逆转录病毒、痘病毒、痘苗病毒和腺相关病毒系统。这些载体系统的 选择不限制本发明。
本发明还提供用于产生本发明的猿猴和猿猴病毒衍生的蛋白质的分子。载 有包含本发明猿猴Ad DNA序列的多核苷酸的这种分子可包括裸DNA、质粒、 病毒或其它基因元件形式。
B.SAdV-39、SAdV-25.2、-26、-30、-37或-38腺病毒蛋白
本发明还提供上述SAdV-39、SAdV-25.2、-26、-30、-37或-38腺病毒的 基因产物，如本文所述腺病毒核酸编码的蛋白质、酶、及其片段。本发明还包 括具有用其它方法产生的这些核酸序列编码的氨基酸序列的SAdV-39、 SAdV-25.2、-26、-30、-37或-38蛋白、酶及其片段。这些蛋白包括上表所鉴 定的开放阅读框所编码的蛋白、下表中参照序列表中提供的SEQ ID NO鉴定 的蛋白以及所述蛋白质和多肽的片段。
因此，本发明一方面提供基本纯的，即没有其它病毒和蛋白质的独特猿猴 腺病毒蛋白质。优选这些蛋白质至少10％同源，更优选60％同源，最优选95％ 同源。
一实施方式中，本发明提供独特的猿猴衍生的衣壳蛋白。如本文所用，猿 猴衍生的衣壳蛋白包括上述含SAdV-39、SAdV-25.2、-26、-30、-37或-38衣 壳蛋白或其片段的任何腺病毒衣壳蛋白，包括但不限于，嵌合性衣壳蛋白、融 合蛋白、人工衣壳蛋白、合成的衣壳蛋白和重组衣壳蛋白，不限于产生这些蛋 白的方法。
这些猿猴腺病毒衍生的衣壳蛋白宜含有与本文所述不同腺病毒血清型衣 壳区或其片段，或修饰的猿猴衣壳蛋白或片段组合的一个或多个SAdV-39、 SAdV-25.2、-26、-30、-37或-38区域或及片段(如五邻体、六邻体、尾丝或其 片段)。“与嗜性改变相关的衣壳蛋白的修饰”在这里包括改变的衣壳蛋白，即五 邻体、六邻体或尾丝蛋白区域或其片段，如尾丝区的球形突出区，或编码它们 的多核苷酸，因此其特异性被改变。可用本发明的一个或多个猿猴Ad或人或 非人来源的另一Ad血清型来构建猿猴衍生的衣壳。这类Ad可获自各种来源， 包括ATCC、商业来源和学术来源，或此Ad序列可获自GenBank或其它合适 来源。
提供了SAdV-39[SEQ ID NO：6]、SAdV-25.2[SEQ ID NO：135]、-26[SEQ ID NO：167]、-30[SEQ ID NO：103]、-37[SEQ ID NO：38]或-38[SEQ ID NO：70] 的五邻体蛋白的氨基酸序列。这些五邻体蛋白或其特定片可适当地用于各种目 的。合适片段的例子包括根据以上和SEQ ID NO：6、103、135、38、70、167 或70中提供的氨基酸编号，具有N-端和/或C-端截短的约50、100、150或200 个氨基酸的五邻体。其它合适的片段包括较短的内部片段、C-端或N-端片段。 也可修饰该五邻体蛋白用于本领域技术人员已知的各种目的。
还提供了SAdV-39[SEQ ID NO：11]、SAdV-25.2[SEQ ID NO：140]、-26 [SEQ ID NO：172]、-30[SEQ ID NO：108]、-37[SEQ ID NO：43]或-38[SEQ ID NO：75]六邻体蛋白的氨基酸序列。这些六邻体邻体蛋白或其特定片可适当地 用于各种目的。合适片段的例子包括根据以上和SEQ ID NO：11、140、172、 108、43或75中提供的氨基酸编号，具有N-端和/或C-端截短的约50、100、 150、200、300、400或500个氨基酸的六邻体。其它合适的片段包括较短的内 部片段、C-端或N-端片段。例如，一个合适的片段是该六邻体蛋白的环区(结 构域)，命名为DE1和FG1，或其超变区。这些片段包括跨越该猿猴六邻体蛋 白的氨基酸残基约125-443；约138-441；或较小片段如跨越残基约138-163； 约170-176；约195-203；约223-246；约253-374；约287-297；和404-430的 区域，参见SEQ ID NO：11、140、172、108、43或75。本领域技术人员不难 鉴定其它合适的片段。也可修饰该六邻体蛋白用于本领域技术人员已知的各种 目的。因为该六邻体蛋白是腺病毒血清型的决定簇，这种人工六邻体蛋白可产 生具有人工血清型的腺病毒。其它人工衣壳蛋白也可用本发明的黑猩猩Ad五 邻体序列和/或尾丝序列和/或其片段构建。
一实施方式中，可能需要用SAdV-39、SAdV-25.2、-26、-30、-37或-38六 邻体蛋白序列产生具有改变的六邻体蛋白的腺病毒。改变六邻体蛋白的一种适 宜方法见美国专利5,922,315中所述，通过引用纳入本文。在这种方法中，腺 病毒六邻体的至少一个环区域被另一腺病毒血清型的至少一个环区域代替。因 此被改变的腺病毒六邻体蛋白的至少一个环区是SAdV-39的猿猴Ad六邻体环 区。一实施方式中，SAdV-39、SAdV-25.2、-26、-30、-37或-38六邻体蛋白的 一个环区被另一腺病毒血清型的一个环区所替代。另一实施方式中，用 SAdV-39、SAdV-25.2、-26、-30、-37或-38六邻体的该环区来替代另一腺病毒 血清型的环区。合适的腺病毒血清型如本文所述不难从人或非人血清型中选 择。选择合适的血清型不是要限制本发明。本领域技术人员不难明白SAdV-39、 SAdV-25.2、-26、-30、-37或-38六邻体蛋白还有其它用途。
提供了SAdV-39[SEQ ID NO：22]、SAdV-25.2[SEQ ID NO：151]、-26[SEQ ID NO：183]、-30[SEQ ID NO：118]、-37[SEQ ID NO：54]或-38[SEQ ID NO：85] 的尾丝蛋白的氨基酸序列。这些尾丝蛋白或其特定片可适当地用于各种目的。 一种合适的片段是位于SEQ ID NO：22、151、183、119、54或85内的尾丝结 (fiber knob)。其它合适的片段例子包括具有根据以上和SEQ ID NO：22、151、 183、119、54或85中提供的氨基酸编号的约50、100、150或200个氨基酸的 N-端和/或C-端截短的尾丝。其它合适的片段包括内部片段。也可用本领域技 术人员熟知的各种技术修饰此尾丝蛋白。
SAdV-39、SAdV-25.2、-26、-30、-37或-38的独特蛋白片段的长度至少为 8个氨基酸。然而，也可方便地使用其他所需长度的片段。此外，本发明提供 引入后能提高SAdV39、SAdV-25.2、-26、-30、-37或-38基因产物产量和/或 表达的此类修饰，如构建融合分子，其中SAdV39、SAdV-25.2、-26、-30、-37 或-38基因产物的全部或某片段融合(直接或通过接头)于融合伴侣而得到增强。 其它合适的修饰包括但不限于截短编码区(如蛋白或酶)以去除通常被切断的前 蛋白或原蛋白产生成熟的蛋白或酶和/或突变编码区以提供分泌性基因产物。本 领域技术人员不难明白还可进行其它修饰。本发明还包括与本文提供的 SAdV39、SAdV-25.2、-26、-30、-37或-38蛋白同一性至少约99％的蛋白质。
如本文所述，本发明的含SAdV-39、SAdV-25.2、-26、-30、-37或-38的 腺病毒衣壳蛋白的载体特别适合于以下应用，即用中和抗体来去除其它Ad血 清型载体以及其它病毒载体的作用。rAd载体在反复基因治疗或为加强免疫应 答(疫苗的效价)的重复给药中有特殊优点。
某些情况下可能需要采用SAdV39、SAdV-25.2、-26、-30、-37或-38基因 产物(如衣壳蛋白或其片段)的一种或多种来产生抗体。术语“抗体”本文用于指 能特异性结合某表位的免疫球蛋白分子。抗体可有各种形式，如高亲和力多克 隆抗体、单克隆抗体、合成抗体、嵌合型抗体、重组抗体和人源化抗体。这些 抗体有免疫球蛋白IgG、IgM、IgA、IgD和IgE类型。
这些抗体也可采用本领域已知许多方法这之一产生。可用熟知的常规技术 如Kohler和Milstein及其众多已知改进的技术来产生适合的抗体。可将已知的 重组技术应用于针对这些抗原开发的多克隆或单克隆抗体以产生类似的所需 高效价抗体[见例如PTC专利申请PTC/GB85/00392；英国专利申请公开号 GB2188638；Amit等，1986 Science，233：747-753；Queen等，1989 Proc.Nat′l. Acad.Sci.USA，86：10029-10033；PTC专利申请PTC/WO9007861；和Riechmann 等，Nature，332：323-327(1988)；Huse等，1988a Science，246：1275-1281]。或 者，通过操作针对本发明抗原的动物或人抗体的互补决定区产生这类抗体。见 例如，E Mark和Padlin的″Humanization of Monoclonal Antibodies″(单克隆抗体 的人源化)，第四章，The Handbook of Experimental Pharmacology(实验药物手 册)，第113卷，The Pharmacology of Monoclonal Antibodies(单克隆抗体的药理 学)，SV出版社(Springer-Verlag)(1994年6月)；Harlow等，Using Antibodies：A Laboratory Manual(抗体使用实验室手册)，冷泉港实验室出版社，纽约；Harlow 等，1989，Antibodies：A Laboratory Manual(抗体实验室手册)，冷泉港，纽约； Harlow等，1988，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85：5879-5883；和Bird等，1988， Science 242：423-437。本发明还提供抗独特型抗体(Ab2)和抗-抗-独特型抗体 (Ab3)。例如参见M.Wettendorff等，″Modulation of anti-tumor immunity by anti-idiotypic antibodies″(用抗独特型抗体调节抗肿瘤免疫力)，选自Idiotypic Network and Diseases(独特型网络和疾病)，J.Cemy和J.Hiernaux编，1990，J.Am. Soc.Microbiol.，华盛顿特区：203-229页]。可用本邻域技术人员所熟知的技术生 产这些抗独特型和抗-抗-独特型抗体。这些抗体可用于各种目的，包括诊断和 临床方法及试剂盒。
在某些情况下可能需要在本发明的SAdV39、SAdV-25.2、-26、-30、-37或 -38基因产物、抗体或其它构建物上引入可检测标记或标签。本文所用的可检 测标记是单独或与另一分子相互作用时能提供可检测信号的分子。最理想的是 该标记可肉眼检测，如通过荧光，便于在免疫组化分析或免疫荧光显微镜中使 用。例如，合适的标记包括：异硫氰基荧光系(FITC)、藻红蛋白(PE)、别藻兰蛋 白(APC)、科里膦-O(CPO)或串联染料，PE-花青-5(PC5)和PE-得克萨斯红(ECD)。 所有这些荧光染料可商品化获得，它们的用途是本领域知道的。其它有用的标 记是胶体金标记。其它有用的标记还包括放射活性化合物或元素。此外，标记 还包括各种酶系统，它们能在试验中产生比色信号，如葡萄糖氧化酶(利用葡 萄糖作底物)可释放过氧化氢，存在过氧化物酶和氢供体如四甲基联苯胺(TMB) 时，此产物可产生呈兰色的氧化TMB。其它例子包括辣根过氧化物酶(HRP)、 碱性磷酸酶(AP)、己糖激酶和能与葡萄糖-6-磷酸脱氢酶的结合，后者能与ATP、 葡萄糖和NAD+反应，在其它产物中产生NADH，其因340nm波长吸光值增 加而可检测。
本发明方法所用的其它标记系统可通过其它方法，如利用包埋有染料的着 色乳胶微粒(Bangs实验室，印第安纳州)来代替酶与靶序列形成偶联物，从而 提供可视信号，表明应用试验中存在得到的复合物。
将标记与所需分子偶联或结合的方法是类似的常规方法，为本领域技术人 员所知道。标记物结合的已知方法已有描述[见例如，Handbook of Fluorescent probes and Research Chemicals(荧光探针和研究用化学制剂手册)，第六版， R.P.M.Haugland，分子探针有限公司(Molecular Probes，Inc.)，尤金，俄勒冈州， 1996；Pierce Catalog and Handbook，Life Science and Analytical Research Products (皮尔斯目录和手册之生活科学和分析研究产品)，皮尔斯化学品公司(Pierce Chemical Company)，罗克福德，伊利诺斯州，1994/1995]。因此，标记和偶联 方法的选择不限制本发明的范围。
SAdV-39、SAdV-25.2、-26、-30、-37或-38的序列、蛋白和片段可用任何 适当的方法产生，包括重组产生、化学合成或其它合成方法。合适的生产技术 是本领域技术人员报熟知的。见例如，Sambrook等，Molecular Cloning：A Laboratory Manual(分子克隆实验室手册)，冷泉港出版社(纽约，冷泉港)。或者 也可用熟知的固相肽合成法(Merrifield，J.Am.Chem.Soc.，85：2149(1962)； Stewart和Young，Solid Phase Peptide Synthesis(固相肽合成)(自由人(Freeman)， 旧金山，1969)，27-62页)来合成肽。这些及其他适当的生产方法是本领域技术 人员已知的，并且不构成对本发明的限定。
此外，本领域技术人员不难理解，SAdV-39、SAdV-25.2、-26、-30、-37 或-38序列不难适用于各种病毒和非病毒载体系统以在体外、离体或体内递送 治疗性和免疫原性分子。例如，一实施方式中，可将本文所述猿猴Ad衣壳蛋 白和其它猿猴腺病毒蛋白用于基因、蛋白质和其它所需的诊断性、治疗性和免 疫原性分子的基于非病毒性蛋白的递送。一个这样的实施方式中，将本发明的 蛋白质直接或间接连接于能靶向带有腺病毒受体的细胞的分子。对于这种靶 向，优选，例如具有细胞表面受体的配体的六邻体、五邻体、尾丝或其片段等 衣壳蛋白。适合于传递的分子选自文中所述治疗性分子及其基因产物。各种接 头，包括脂质、聚赖氨酸等可用作接头。例如，猿猴五邻体蛋白可通过使用猿 五邻体序列生产融合蛋白来容易地用于这种目的，所述生产方式类似于 Medina-Kauwe LK等，Gene Ther.2001年5月；8(10)：795-803和Medina-Kauwe LK等，Gene Ther.2001年12月；8(23)：1753-1761所述。此外，如美国专利申 请20010047081所述，猿猴Ad蛋白IX的氨基酸序列可用于靶向载体至细胞表 面受体。合适的配体包括CD40抗原，含有RGD或聚赖氨酸的序列等。还有 其它猿猴Ad蛋白，包括例如六邻体蛋白和/或尾丝蛋白可用于这些或类似的目 的。
其它SAdV-39、SAdV-25.2、-26、-30、-37或-38腺病毒蛋白可单独或与 其它腺病毒蛋白联用于各种目的，本领域技术人员不难明白这一点。此外，本 领域技术人员不难理解SAdV腺病毒蛋白还有其它用途。
II.重组腺病毒载体
本发明的组合物包括用于治疗或疫苗目的的能向细胞递送异源分子的载 体。如本文所用，载体可包含任何遗传元件，包括但不限于裸DNA、噬菌体、 转座子、粘粒、游离体、质粒或病毒。这些载体含有SAdV39、SAdV-25.2、-26、 -30、-37或-38的猿猴腺病毒DNA和小基因。“小基因”或“表达盒”指所选异源 基因和在宿主细胞中驱动翻译、转录和/或基因产物表达所需的其它调控元件的 组合。
通常设计SAdV-39、SAdV-25.2、-26、-30、-37或-38衍生的腺病毒载体， 以使该小基因位于核酸分子中，而该核酸分子在所选腺病毒基因的天然区域中 含有其它腺病毒序列。如果需要，可将该小基因插入现有基因区域中，以破坏 该区域的功能。或者，可将该小基因插入部分或完全缺失的腺病毒基因的位点 内。例如，可使该小基因位于可选择的位点，如功能性E1缺失位点或功能性 E3缺失位点等中。术语“功能性缺失”指通过突变或修饰去除或损伤足够量的基 因区域，以使该基因区域不再能够通过基因表达产生功能性产物。如果需要， 可去除整个基因区域。在本申请的其它地方讨论用于破坏或缺失基因的其它合 适位点。
例如，为了产生用于产生重组病毒的载体，该载体可含有该小基因和腺病 毒基因组的5’端或腺病毒基因组的3’端，或同时含有腺病毒基因组的5’和3’ 端。腺病毒基因组的5’端含有包装和复制所必需的5’顺式元件；即5’末端反向 重复(ITR)序列(用作复制起点)和天然5’包装增强子结构域(含有包装线性Ad基 因组所需序列和E1启动子的增强子元件)。腺病毒基因组的3’端包含包装和衣 壳化所必需的3’顺式元件(含有ITR)。重组腺病毒适合含有5’和3’腺病毒顺式 元件，小基因位于5’和3’腺病毒序列之间。基于SAdV-39、SAdV-25.2、-26、 -30、-37或-38的腺病毒载体也可含其它腺病毒序列。
这些基于SAdV-39、SAdV-25.2、-26、-30、-37或-38的腺病毒载体宜含衍 生自本发明腺病毒基因组的一种或多种腺病毒元件。一实施方式中，该载体含 SAdV39、SAdV-25.2、-26、-30、-37或-38的腺病毒ITR和同一腺病毒血清型 的其它腺病毒序列。另一实施方式中，该载体含不同腺病毒血清型而非提供此 ITR腺病毒衍生的腺病毒序列。
如本文所述，假型腺病毒指该腺病毒的衣壳蛋白来自与提供ITR的腺病毒 不同的腺病毒。
此外，可使用本领域技术人员已知技术用本文所述腺病毒构建嵌合或杂交 腺病毒。见例如美国专利7,291,498。
选择载体中存在的ITR的腺病毒来源和其它腺病毒序列的来源不限制本发 明。各种腺病毒株可从美国模式培养物保藏所(马纳萨斯，弗吉尼亚)获得，或 通过咨询各种商业和学术来源而获得。此外，许多菌株的序列可从各种数据库， 包括例如，PubMed和GenBank获得。发表的文献中已描述了从其它猿猴或人 腺病毒制备的同源腺病毒载体[见例如，美国专利5,240,846]。许多类型腺病毒 的DNA序列可获自GenBank，包括Ad5[GenBank登录号M73260]。可获得任 何已知腺病毒血清型，如血清型2、3、4、7、12和40的腺病毒序列，还包括 目前已鉴定的人类型。在本发明的载体构建物中也可采用已知能感染非人动物 (如猿猴)的相似腺病毒。参见例如，美国专利6,083,716。
如上所述获得用于构建本文所述载体的病毒序列、辅助病毒(如果需要)和 重组病毒颗粒，以及其它载体组分和序列。本发明的SAdV39、SAdV-25.2、-26、 -30、-37或-38猿猴腺病毒序列的DNA序列可用于构建此类载体和用于制备此 载体的细胞系。
可用标准分子生物学技术产生形成本发明载体的核酸序列的修饰，包括序 列缺失、插入和其它突变，这些修饰并包含在该实施方式的范围内。
A.“小基因”
根据本文提供的教导，本领域技术人员能够了解用于选择转基因、克隆和 构建“小基因”，并将其插入病毒载体的方法。
1.转基因
转基因是编码感兴趣的多肽、蛋白质或其他产物，并与其侧接的载体序列 异源的核酸序列。核酸编码序列以允许转基因在宿主细胞中转录、翻译和/或表 达的方式操作性地与调节组分相连。
转基因序列的组成取决于所得到的载体的用途。例如：一类转基因序列包 含报道序列，该序列在表达后产生可检测的信号。这种报道序列包括但不限于 编码以下物质的DNA序列：β-内酰胺酶、β-半乳糖苷酶(LacZ)、碱性磷酸酶、 胸腺激酶、绿色荧光蛋白(GFP)、氯霉素乙酰转移酶(CAT)、萤光素酶、膜结合 蛋白(如CD2、CD4、CD8)、流感血凝素蛋白和本领域熟知的存在高亲和力抗 体或可通过常规方法产生所述抗体的其他物质，以及含有膜结合蛋白的融合蛋 白，该膜结合蛋白适当地与血凝素或Myc等物质的抗原标记区融合。当这些 编码序列与驱动其表达的调节元件相关联时，可提供由常规方法检测的信号， 所述常规方法包括酶法、放射显影法、比色法、荧光法或其他光谱测定、荧光 激活细胞分选测定与免疫测定，包括酶联免疫吸附测定(ELISA)、放射性免疫 测定(RIA)和免疫组织化学。例如，当标记序列是LacZ基因时，通过测定β- 半乳糖苷酶的活性来检测携带信号的载体的存在。当转基因是GFP或萤光素 酶时，携带信号的载体可用光度计通过颜色或光的产生来观测。
一实施方式中，转基因是编码具有生物或医药用途的产物的非标记序列， 所述产物例如蛋白质、肽、RNA、酶或催化性RNA。所需RNA分子包括tRNA、 dsRNA、核糖体RNA、催化性RNA和反义RNA。有用的RNA序列的一个例 子是消除靶核酸序列在经处理的动物中表达的序列。
可将转基因用于治疗，例如治疗遗传缺陷，作为癌症治疗剂或疫苗，用于 诱导免疫应答，和/或达到预防性疫苗目的。本文所用的诱导免疫应答指分子(如 基因产物)诱导针对该分子的T细胞和/或体液免疫应答的能力。本发明还包括 使用多个转基因，例如用来纠正或减轻多亚基蛋白质所致疾病。在某些情况下， 可采用不同的转基因编码蛋白质的各亚基，或编码不同肽或蛋白质。当编码蛋 白质亚基的DNA很大时这尤其适合，所述蛋白质例如免疫球蛋白、血小板衍 生的生长因子或抗肌萎缩蛋白。为使细胞产生多亚基蛋白质，用含有各自不同 亚基的重组病毒感染细胞。或者，蛋白质的不同亚基可由同一转基因编码。在 这种情况下，单个转基因包含编码各亚基的DNA，而各亚基的DNA由内部核 糖体进入位点(IRES)隔开。当编码各亚基的DNA较小时，例如编码亚基的DNA 与IRES的总体积小于5千碱基对时，这尤其适合。作为IRES的替代，DNA 可用编码在翻译后阶段自我切割的2A肽的序列隔开。参见，例如：M.L. Donnelly等，J.Gen.Virol.，78(第一部分)：13-21(1997年1月)；Furler，S.等 人，Gene Ther.，8(11)：864-873(2001年6月)；Klump H.等人，Gene Ther.，8(10)： 811-817(2001年5月)。该2A肽明显小于IRES，使得其非常适合用于空间成 为制约因素之时。然而，选定的转基因可编码任何生物活性产物或其他产物， 例如研究所需的产物。
本领域技术人员可容易地选择适当的转基因。转基因的选择不限制该实施 方式。
2.调节元件
除了以上就小基因而言的主要元件以外，载体还包含必需的常规控制元件， 所述常规控制元件以允许转基因在以下所述细胞中转录、翻译和/或表达的方 式操作性地与转基因相连，所述细胞为本发明产生的质粒载体转染或病毒所感 染。本文所用的“操作性相连接的”序列包括与感兴趣基因毗连的表达调控序列 和反式作用或远距离调控感兴趣基因的表达调控序列。
表达控制序列包括适宜的转录起始、终止、启动子和增强子序列；有效的 RNA加工信号，例如剪接和聚腺苷酸化(polyA)信号；稳定细胞质mRNA的序 列；增强翻译效率的序列(即：Kozak共有序列)；增强蛋白质稳定性的序列； 以及在需要时增强编码产物分泌的序列。
许多表达控制序列，包括天然的、组成型的、诱导型的和/或组织特异性 的启动子是本领域已知并可利用的。组成型启动子的例子包括但不限于：逆转 录病毒罗斯肉瘤病毒(RSV)LTR启动子(任选连有RSV增强子)、巨细胞病毒 (CMV)启动子(任选连有CMV增强子)[参见，例如：Boshart等，Cell，41： 521-530(1985)]、SV40启动子、二氢叶酸还原酶启动子、β-肌动蛋白启动子、 磷酸甘油激酶(PGK)启动子和EF1α启动子(英杰公司)。
诱导型启动子可调节基因的表达，并受外源提供的化合物、环境因素如温 度或存在细胞的特定生理状态如急性期、特定分化阶段的调控，或只在复制性 细胞中受调节。诱导型启动子和可诱导系统可从多种商业来源获得，包括但不 限于英杰公司、克隆技术公司(Clontech)和阿里阿德公司(Ariad)。已知的还有许 多本领域技术人员易于选择的其他系统。例如，诱导型启动子包括锌诱导型绵 羊金属硫蛋白(MT)启动子和地塞米松(Dex)-诱导型小鼠乳房肿瘤病毒(MMTV) 启动子。其它诱导型系统包括T7聚合酶启动子系统[WO 98/10088]；蜕皮激素 昆虫启动子[No等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，93：3346-3351(1996)]，四环素- 抑制性系统[Gossen等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，89：5547-5551(1992)]，四环 素-诱导型系统[Gossen等，Science，378：1766-1769(1995)，也参见Harvey等， Curr.Opin.Chem.Biol.，2：512-518(1998)]。其它系统包括FK506二聚体、采 用甘珀二醇(castradiol)的VP16或p65、联苯酚米勒甾酮(murislerone)、RU486- 诱导型系统[Wang等，Nat.Biotech.，15：239-243(1997)和Wang等，Gene Ther.， 4：432-441(1997)]和雷帕霉素-诱导型系统[Magrosei等，J.Clin.Invest.，100： 2865-2872(1997)]。一些诱导型启动子的有效性随时间提高。在这种情况下， 可通过将多个阻抑物以串联形式插入，如通过IRES将TetR与TetR连接，来 提高这种系统的有效性。或者，可以在筛选所需功能之前等待至少3天。可通 过已知方式提高所需蛋白的表达，以提高该系统的有效性。例如，使用土拨鼠 肝炎病毒转录后调控元件(WPRE)。
在另一个实施方案中使用了转基因的天然启动子。当需要转基因的表达模 拟天然表达时，可优选天然启动子。当转基因的表达必须瞬时或发育调节、或 以组织特异性的方式或响应特定转录刺激而调节时，可使用天然启动子。在另 外的实施方案中，也可使用其他天然表达控制元件，例如增强子元件、聚腺苷 酸化位点或Kozak共有序列以模拟天然表达。
转基因的另一实施方案包含操作性连接于组织特异性启动子的转基因。例 如，如果需要在骨骼肌中表达，应该使用在肌肉中有活性的启动子。这包括编 码以下产物的基因的启动子：骨骼β-肌动蛋白、肌球蛋白轻链2A、抗肌萎缩 蛋白、肌肉肌酸激酶以及活性高于天然启动子的合成肌肉启动子(参见：Li等， Nat.Biotech.，17：241-245(1999))。已知的组织特异性启动子的实例有肝特异 性的(白蛋白，Miyatake等，J.Virol.，71：5124-32(1997)；乙肝病毒核心启动 子，Sandig等，Gene Ther.，3：1002-9(1996)：甲胎蛋白(AFP)，Arbuthnot等， Hum.Gene Ther.，7：1503-14(1996))、骨的骨钙蛋白(Stein等，Mol. Biol. Rep.， 24：185-96(1997))；骨唾液蛋白(Chen等，J.Bone Miner.Res.，11：654-64(1996))、 淋巴细胞特异性的(CD2，Hansal等，J.Immunol.161：1063-8(1998)；免疫球蛋 白重链；T细胞受体链)、神经元特异性的(例如神经元-特异性烯醇酶(NSE)启 动子(Andersen等，Cell.Mol.Neurobiol.，13：503-15(1993))、神经丝轻链基因 (Piccioli等，Proc.Natl.Acad.Sci.，美国，88：5611-5(1991))，以及神经元-特 异性vgf基因(Piccioli等，Neuron，15：373-84(1995)))等。
任选地，携带编码有治疗用途或免疫原性产物的转基因的载体还可含有可 选择标记基因，或报道基因可包含编码遗传霉素、潮霉素或嘌呤霉素(purimycin) 抗性等的序列。这种可选择的报道基因或标记基因(优选位于有待包装到病毒 颗粒中的病毒基因组之外)，可用来传导细菌细胞中存在质粒的信号，例如氨 苄青霉素抗性。载体的其他成分可包括复制起点。可通过常规方法选择这些和 其他启动子与载体元件，许多这种序列可获得[参见例如：Sambrook等人，以 及本文引用的参考文献]。
利用本文提供的技术和序列，结合本领域技术人员已知技术产生这些载体。 这些技术包括如教科书中所述的常规cDNA克隆技术[Sambrook等，Molecular Cloning：A Laboratory Manual(分子克隆：实验室手册)，Cold Spring Harbor Press (冷泉港出版社)，Cold Spring Harbor(冷泉港)，纽约]、使用腺病毒基因组的重叠 寡核苷酸序列、聚合酶链反应和提供所需核苷酸序列的任何合适方法。
III.病毒载体的制造
一实施方式中，用猿猴腺病毒质粒(或其它载体)来产生腺病毒载体。一实 施方式中，所述腺病毒载体是复制缺陷型腺病毒颗粒。一实施方式中，所述腺 病毒颗粒由于缺失E1a和/或E1b基因而变得复制缺陷。或者，所述腺病毒通 过其他方式变得复制缺陷，任选仍旧保留E1a和/或E1b基因。所述腺病毒载 体的腺病毒基因组中也可包含其他突变，如温度敏感性突变或其它基因缺失。 其它实施方式中，需要在腺病毒载体中保持完整的E1a和/或E1b区。这种完 整的E1区可位于腺病毒基因组的天然位置中，或置于天然腺病毒基因组的缺 失位点(如E3区)中。
在用于将基因递送给人(或其它哺乳动物)细胞的猿猴腺病毒载体的构建 中，可将一系列腺病毒核酸序列用于该载体。例如，可由形成一部分重组病毒 的猿猴腺病毒序列中清除全部或一部分腺病毒延迟早期基因E3。相信猿猴E3 的功能与重组病毒颗粒的功能和产生无关。也可构建至少E4基因的ORF6区 域缺失，更需要整个E4区缺失(因为该区域的功能冗余)的猿猴腺病毒载体。本 发明另一种载体的延迟早期基因E2a中含有缺失。也可在猿猴腺病毒基因组的 晚期基因L1-L5中产生缺失。相似地，中间基因IX和IVa2中的缺失可用于一 些目的。可以在其它结构或非结构腺病毒基因组中产生其它缺失。上述缺失可 单独使用，即本文所述使用的腺病毒序列可仅在一个区域中含有缺失。或者， 可以任何组合形式使用能有效破坏其生物学活性的整个基因或其部分的缺失。 例如，在一种示范性载体中，腺病毒序列可缺失E1基因和E4基因，或E1、 E2a和E3基因，或E1和E3基因，或E1、E2a和E4基因，缺失或不缺失E3， 等等。如上所述，这类缺失可与其它突变，如温敏型突变联用，以实现所需结 果。
可以在腺病毒颗粒的病毒感染力和繁殖所需的缺失腺病毒基因产物存在下 培养缺少任何必需腺病毒序列(如E1a、E1b、E2a、E2b、E4 ORF6、L1、L2、 L3、L4和L5)的腺病毒载体。可以在一种或多种辅助构建物(如质粒或病毒)或 包装宿主细胞的存在下培养腺病毒载体，从而提供这些辅助功能。参见例如， 纳入本文作参考的1996年5月9日公布的国际专利申请WO96/13597中描述 的″最小″人Ad载体的制备技术。
1.辅助病毒
因此，根据用于携带小基因的病毒载体的猿猴腺病毒基因含量，可能需要 辅助腺病毒或非复制型病毒片段来提供足够的猿腺病毒基因序列，以便产生含 有该小基因的感染性重组病毒颗粒。有用的辅助病毒含有腺病毒载体构建物中 不存在和/或转染了载体的包装细胞系不表达的所选腺病毒基因序列。在一个实 施方式中，该辅助病毒是复制缺陷型病毒，除上述序列外还含有各种腺病毒基 因。这种辅助病毒宜与E1表达细胞系联用。
辅助病毒也可形成聚阳离子偶联物，如Wu等，J.Biol.Chem.，374：16985- 16987(1989)；K.J.Fisher和J.M.Wilson，Biochem.J.，299：49(1994年4月1日) 所述。辅助病毒可任选地含有第二种报道小基因。本领域已知许多这类报道基 因。辅助病毒上存在不同于腺病毒载体上的转基因的报道基因能独立监测Ad 载体和辅助病毒用第二种报道物区分纯化后得到的重组病毒和辅助病毒。
2.补充细胞系
为了产生任一上述基因中发生缺失的重组猿猴腺病毒(Ad)，如果缺失基因 区域的功能是病毒复制或感染所必需的，必须通过辅助病毒或细胞系，即补充 或包装细胞系向该重组病毒提供该功能。在许多情况下，可利用表达人E1的 细胞系反式补充黑猩猩Ad载体。这特别有利，因为，由于本发明黑猩猩Ad 序列和目前可得的包装细胞中发现的人Ad E1序列之间的差异，使用现有含人 E1的细胞能防止在复制和产生过程中产生能够复制的腺病毒。然而，在某些 情况下，可能需要利用表达E1基因产物的细胞系产生E1缺失的猿猴腺病毒。 已经描述过这类细胞系。参见例如，美国专利6,083,716。
如果需要，可利用本文提供的序列产生至少在所选母体细胞系表达所用的 启动子转录控制下表达来自SAdV39的腺病毒E1基因的包装细胞或细胞系。 诱导型或组成型启动子可用于此目的。本说明书中其它地方详细描述了这类启 动子的例子。选择亲本细胞以产生表达任何所需的SAdV39基因的新细胞系。 如果不受限制，这类母体细胞系可以是HeLa[ATCC登录号CCL 2]、A549 [ATCC登录号CCL 185]、HEK 293、KB[CCL 17]、底特律(Detroit)[如底特律 510，CCL 72]和WI-38[CCL 75]细胞等。这些细胞系均可获自位于弗吉尼亚州 玛纳萨斯(Manassas，Virginia)20110-2209大学大道10801号的美国典型培养物 保藏中心(American Type Culture Collection)。其它合适的亲本细胞系可获自其 它来源。
这类表达E1的细胞系可用于产生重组猿猴腺病毒E1缺失型载体。此外或 或者，可利用与产生重组猿病毒载体所用方法基本相同的方法构建表达一种或 多种猿腺病毒基因产物，如E1a、E1b、E2a和/或E4 ORF6的细胞系。这类细 胞系可用于反式补充编码这些产物的必需基因中缺失的腺病毒载体，或提供包 装辅助依赖性病毒(如腺伴随病毒)所必需的辅助功能。本发明制备宿主细胞涉 及诸如装配选定的DNA序列等技术。可使用常规技术实现这种装配。这种技 术包括公知的且描述于前文引用的Sambrook等的著作中的cDNA和基因组克 隆、使用腺病毒基因组的重叠寡核苷酸序列，结合聚合酶链式反应、合成方法 以及提供所需核苷酸序列的其他合适方法。
在另一个替代方式中，通过腺病毒载体和/或辅助病毒反式提供必需腺病毒 基因产物。在这种情况下，合适的宿主细胞可选自各种生物体，包括原核(例 如：细菌)细胞和真核细胞，包括昆虫细胞、酵母细胞和哺乳动物细胞。特别 适合的宿主细胞选自任何哺乳动物物种，包括但不限于，A549、WEHI、3T3、 10T1/2、HEK 293细胞或PERC6(这二者均表达功能性腺病毒E1)[Fallaux，FJ 等，(1998)，Hum Gene Ther，9：1909-1917]、Saos、C2C12、L细胞、HT1080、 HepG2以及衍生自哺乳动物，包括人、猴、小鼠、大鼠、兔和仓鼠的原代成纤 维细胞、肝细胞和成肌细胞细胞。选择细胞的哺乳动物来源和哺乳动物细胞的 类型(即成纤维细胞、肝细胞、肿瘤细胞等)不限制本发明。
3.病毒颗粒的组装和细胞系的转染
当通过转染递送含有小基因的载体时，通常将约5μg-100μg DNA、优选约 10μg-50μg DNA递送给约1×104-1×1013个细胞、优选约1×105个细胞。然而， 可根据诸如所选载体、递送方法和所选宿主细胞等因素调整宿主细胞与载体 DNA的相对量。
该载体可以是本领域已知或上述任何载体，包括裸DNA、质粒、噬菌体、 转座子、粘粒、附加体、病毒等。可通过本领域已知或上述任何方式，包括转 染和感染将载体引入宿主细胞中。一个或多个腺病毒基因可稳定地整合入宿主 细胞基因组，作为附加体稳定表达，或者瞬时表达。基因产物可全部瞬时表达， 在附加体上或稳定整合；或者，一些基因产物可稳定地表达，而另一些瞬时表 达。此外，各腺病毒基因的启动子可彼此独立地选自组成型启动子、诱导型启 动子或天然腺病毒启动子。启动子可由生物体或细胞的特定生理状态调节(即 分化状态或复制或静息细胞)或由(例如)外源添加因子调节。
也可使用技术人员已知和本说明书中讨论的技术将这些分子(如质粒或病 毒)引入宿主细胞。在优选实施方式中，采用标准转染技术，如CaPO4转染或 电穿孔。
用常规技术将所选腺病毒的DNA序列(以及转基因和其它载体元件)组装到 各种中间质粒中，并用该质粒和载体产生重组病毒颗粒。这些技术包括如教科 书中所述的常规cDNA克隆技术[Sambrook等，同上]、使用腺病毒基因组的重 叠寡核苷酸序列、聚合酶链反应和提供所需核苷酸序列的任何合适方法。采用 标准的转染和共转染技术，例如CaPO4沉淀技术。所用的其它常规方法包括病 毒基因组的同源重组、测定琼脂覆盖层中的病毒空斑、测定信号产生的方法等。
例如，在构建和组装含所需小基因的病毒载体后，在辅助病毒的存在下将 该载体体外转染到包装细胞系中。在辅助和载体序列之间发生同源重组，这使 得载体中的腺病毒转基因序列能够被复制并包装到病毒颗粒衣壳中，产生重组 病毒载体颗粒。目前产生这类病毒颗粒的方法是基于转染的方法。然而，本发 明不限于这类方法。
得到的重组猿猴腺病毒可用于将所选转基因转移到所选细胞中。重组病毒 在包装细胞系中增殖的体内实验中，本发明E1缺失重组猿猴腺病毒载体证明 可用于将转基因转移到非猿猴，优选人的细胞中。
IV.使用重组腺病毒载体
可用基于重组猿猴腺病毒-39、SAdV-25.2、-26、-30、-37或-38的载体将基 因体外、离体和体内递送给病人或非猿猴病兽。
本文所述的重组腺病毒载体可用作体外产生异源基因编码产物的表达载 体。例如，可将含插入到E1缺失部位某基因的重组腺病毒载体转染入上述E1 表达细胞系中。或者，在另一所选细胞系中采用复制活性腺病毒。然后以常规 方法培养转染细胞，使该重组腺病毒从启动子表达基因产物。然后，用已知的 常规蛋白质分离和回收方法回收培养物中的基因产物。
SAdV39、SAdV-25.2、-26、-30、-37或-38衍生的重组猿猴腺病毒载体提 供了有效的基因转移载体，可在体外或离体情况下将所选转基因递送给所选宿 主细胞，甚至在该生物已有一种或多种AAV血清型的中和抗体时。在一个实 施方案中，rAAV与细胞离体混合，使用常规方法培养被感染的细胞，并将被 转导的细胞回输给患者。这些组合物尤其适用于治疗目的和免疫接种目的的基 因递送，所述免疫接种包括诱导保护性免疫。
更通常的情况是，SAdV39、SAdV-25.2、-26、-30、-37或-38重组腺病毒 载体可用于递送治疗性或免疫原性分子，如上所述。不难理解这两种用途，即 本发明的重组腺病毒特别适合反复递送重组腺病毒载体的治疗方案。这类方案 一般包括递送病毒衣壳不同的一系列病毒载体。可改变每次后续给药的病毒衣 壳，或者在预先选择的特定血清型衣壳给药次数(如一次、两次、三次、四次 或更多次)后改变。因此，方案可包括递送rAd与第一猿猴衣壳、递送rAd与 第二猿猴衣壳和递送第三猿猴衣壳。本领域技术人员明白，有各种单独采用本 发明Ad衣壳，联合采用，或与其它腺病毒(优选无免疫交叉反应性的腺病毒) 联用的方案。任选地，这类方案可包括给予rAd与其他非人灵长动物腺病毒、 人腺病毒或人工序列的衣壳。该方案的各阶段可包括用一种Ad衣壳进行一系 列注射(或其它递送途径)，然后用另一种不同Ad来源的衣壳进行一系列注射。 或者，所述SAdV-39、SAdV-25.2、-26、-30、-37或-38载体可用于涉及其它 非腺病毒介导的递送系统，包括其它病毒系统、非病毒递送系统、蛋白质、肽 和其它生物活性分子的方案。
以下章节关注于可通过本发明的腺病毒载体递送的示范性分子。
A.Ad-介导的治疗分子的递送
在一个实施方式中，按照已公开的基因治疗方法将上述重组载体给予人。 可将携带所选转基因的猿猴病毒载体给予患者，优选悬浮于生物相容性溶液或 药学上可接受的递送载体。合适的载体包括无菌盐水。已知是药学上可接受的 载体且为本领域技术人员熟知的其它水性和非水性等渗无菌注射溶液以及水 性和非水性无菌混悬液均可用于此目的。
猿猴腺病毒载体的给予量应足以转染靶细胞并应提供足够的基因传送和表 达水平以提供疗效而无副作用，或有医学上可接受的生理作用，这可由医学领 域技术人员确定。常规和药学上可接受的给药途径包括但不限于：直接递送至 视网膜和其它眼内递送方法、直接递送至肝、吸入、鼻内、静脉内、肌肉内、 气管内、皮下、皮内、直肠、口服、和其它胃肠道外给药途径。如果需要，可 根据转基因或病症来组合或调节给药途径。给药途径主要取决于所治疗疾病的 特性。
病毒载体的剂量主要取决于以下因素，例如治疗的病症、患者的年龄、体 重和健康状况，因此可依患者而改变。例如，治疗有效的病毒载体的成人或兽 用剂量通常为约100μL-100mL载体，其中病毒颗粒的浓度为约1x106-1x1015个颗粒，约1x1011-1x1013个颗粒，或约1x109-1x1012个颗粒。剂量范围取 决于动物大小和给药途径。例如，适用于肌肉内注射的人用或兽用剂量(约80kg 动物)约为一个部位1x109-5x1012个颗粒/毫升。任选地，可递送至多个给药 部位。在另一个例子中，适用于口服制剂的人用或兽用剂量可以约为1x1011-1 x1015个颗粒。本领域技术人员可根据给药途径、利用该重组载体的治疗或疫 苗应用调节这些剂量。可监测转基因或免疫原的表达水平，或循环抗体水平以 确定给药频率。本领域技术人员不难了解测定给药频率时间选择的其它方法。
任选的方法步骤包括给予该病毒载体的同时、之前、之后给予合适量的短 时作用免疫调节剂。所选的免疫调节剂本文定义为能抑制针对本发明重组载体 的中和抗体产生的制剂，或能抑制可消除该载体的溶细胞性T淋巴细胞(CTL) 的制剂。此免疫调节剂可干扰T辅助细胞亚组(TH1或TH2)和B细胞之间的相互 作用，从而抑制中和抗体形成。或者，该免疫调节剂可抑制TH1细胞和CTL之 间的相互作用从而降低载体的CTL消除作用。各种有用的免疫调节剂和其使 用剂量已公开，见例如，Yang等，J.Virol.，70(9)(1996/9)；1996/5/2公开的国际 专利申请WO96/12406；和国际专利申请PCT/US96/03035，均纳入本文作参考。
1.治疗性转基因 转基因编码的有用的治疗性产物包括激素与生长因子和分化因子，包括但 不限于：胰岛素、胰高血糖素、生长激素(GH)、甲状旁腺激素(PTH)、生长激 素释放因子(GRF)、卵泡刺激素(FSH)、黄体激素(LH)、人绒毛膜促性腺激素 (hCG)、血管内皮生长因子(VEGF)、促血管生成素、血管抑制素、粒细胞集落 刺激因子(GCSF)、促红细胞生产素(EPO)、结缔组织生长因子(CTGF)、碱性成 纤维细胞生长因子(bFGF)、酸性成纤维细胞生长因子(aFGF)、表皮生长因子 (EGF)、转化生长因子(TGF)、血小板衍生的生长因子(PDGF)、胰岛素生长因 子I和II(IGF-I和IGF-II)、转化生长因子超家族中的任一个(包括TGF、活化 素、抑制素)、或骨形态发生蛋白(BMP)BMP1-15中的任一个、生长因子中 的调蛋白/神经调节蛋白/ARIA/neu分化因子(NDF)家族的任一个、神经 生长因子(NGF)、脑源性神经营养因子(BDNF)、神经营养蛋白NT-3和NT-4 /5、睫状神经营养因子(CNTF)、胶质细胞系衍生神经营养因子(GDNF)、 神养蛋白(neurturin)、聚集蛋白、脑信号蛋白/瓦解蛋白家族的任一个、导 蛋白-1和导蛋白-2、肝细胞生长因子(HGF)、肝配蛋白、头蛋白、sonic hedgehog蛋白和酪氨酸羟化酶。
其他有用的转基因产物包括调节免疫系统的蛋白质，包括但不限于：细胞 因子和淋巴因子，例如血小板生成素(TPO)、白介素(IL)IL-1到IL-25(包括，例 如：IL-2、IL-4、IL-12和IL-18)、单核细胞化学诱导蛋白、白血病抑制因子、 粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子、Fas配体、肿瘤坏死因子和干扰素、干细胞因 子、flk-2/flt3配体。免疫系统产生的基因产物也可用于本发明。这些产物包 括但不限于：免疫球蛋白IgG、IgM、IgA、IgD和IgE、嵌合免疫球蛋白、人 源化抗体、单链抗体、T细胞受体、嵌合T细胞受体、单链T细胞受体、I类 和II类MHC分子，以及经改造的免疫球蛋白和MHC分子。有用的基因产物 还包括补体调节蛋白质，例如补体调节蛋白、膜辅因子蛋白(MCP)、衰变加速 因子(DAF)、CR1、CF2和CD59。
其他有用的基因产物包括激素受体、生长因子、细胞因子、淋巴因子、调 节蛋白质和免疫系统蛋白质的任一种。本发明包括胆固醇调节的受体，包括低 密度脂蛋白(LDL)受体、高密度脂蛋白(HDL)受体、极低密度脂蛋白(VLDL)受 体和清除受体。本发明也包括以下基因产物：例如类固醇激素受体超家族的成 员，包括糖皮质激素受体和雌激素受体、维生素D受体和其他核受体。此外， 有用的基因产物包括转录因子，例如jun、fos、max、mad、血清应答因子(SRF)、 AP-1、AP2、myb、MyoD和肌细胞生成蛋白、含ETS-盒的蛋白质、TFE3、E2F、 ATF1、ATF2、ATF3、ATF4、ZF5、NFAT、CREB、HNF-4、C/EBP、SP1、 CCAAT-盒结合蛋白、干扰素调节因子(IRF-1)、维尔姆斯肿瘤蛋白、ETS-结合 蛋白、STAT、GATA-盒结合蛋白，例如GATA-3和翼状螺旋蛋白的叉头蛋白家 族。
其他有用的基因产物包括氨甲酰合成酶I、鸟氨酸转氨甲酰酶、精氨基琥珀 酸合成酶、精氨基琥珀酸裂合酶、精氨酸酶、延胡索酰乙酰乙酸水解酶、苯丙 氨酸羟化酶、α-1抗胰蛋白酶、葡萄糖-6-磷酸酶、胆色素原脱氨酶、因子VIII、 因子IX、胱硫醚β-合成酶、支链酮酸脱羧酶、白蛋白、异戊酰-CoA脱氢酶、 丙酰-CoA羧化酶、甲基丙二酰CoA变位酶、戊二酰-CoA脱氢酶、胰岛素、β- 葡糖苷酶、丙酮酸羧酸盐、肝磷酸化酶、磷酸化酶激酶、甘氨酸脱羧酶、H- 蛋白、T-蛋白、囊性纤维化跨膜传导调节蛋白(CFTR)序列和抗肌萎缩蛋白cDNA 序列。
其他有用的基因产物包括非天然产生的多肽，例如具有非天然产生的氨基 酸序列的嵌合或杂交多肽，所述非天然产生的氨基酸序列含有插入、缺失或氨 基酸取代。例如，经单链改造的免疫球蛋白可用在某些免疫低下患者中。其他 类型的非天然产生的基因序列包括反义分子和催化性核酸，例如核酶，可用于 降低靶标的过表达。
降低和/或调节基因表达对治疗以细胞过度增殖为特征的过度增殖性疾 病，例如癌症和银屑病，尤其理想。靶多肽包括，与正常细胞相比，仅在过度 增殖细胞中产生或在过度增殖细胞中以更高水平产生的多肽。靶抗原包括癌基 因，例如myb、myc、fyn和易位基因如bcr/abl、ras、src、P53、neu、trk和 EGRF编码的多肽。除了作为靶抗原的癌基因产物，用于抗癌治疗和保护性治 疗方案的靶多肽包括B细胞淋巴瘤产生的抗体的可变区和T细胞淋巴瘤的T 细胞受体的可变区，在某些些实施方案中，它们也用作自身免疫疾病的靶抗原。 其他肿瘤相关多肽也可用作靶多肽，例如肿瘤细胞中水平较高的多肽，包括单 克隆抗体17-1A所识别的多肽和叶酸结合多肽。
其他合适的治疗性多肽和蛋白质包括通过赋予抗自身免疫相关靶标的广谱 基础保护性免疫应答来治疗患自身免疫疾病和紊乱的个体的多肽和蛋白，所述 自身免疫相关靶标包括细胞受体和产生“自我”定向抗体的细胞。T细胞介导的 自身免疫疾病包括类风湿性关节炎(RA)、多发性硬化症(MS)、斯耶格伦综合征、 结节病、胰岛素依赖型糖尿病(IDDM)、自身免疫甲状腺炎、反应性关节炎、 强直性脊柱炎、硬皮病、多肌炎、皮肌炎、银屑病、脉管炎、韦格纳肉芽肿病、 克罗恩病和溃疡性结肠炎。这些疾病均以结合内源性抗原并引发自身免疫疾病 相关炎性级联反应的T细胞受体(TCR)为特征。
本发明的猿猴腺病毒载体特别适合需要多种腺病毒介导的转基因递送的治 疗方案，例如，包括再次递送相同转基因的方案或包括递送其它转基因的组合 方案。这类方案可包括给予SAdV39、SAdV-25.2、-26、-30、-37或-38腺病毒 载体，然后再次给予来自相同血清型腺病毒的载体。特别理想的方案包括给予 SAdV39、SAdV-25.2、-26、-30、-37或-38猿猴腺病毒载体，其中第一次给予 的载体的腺病毒衣壳序列的来源不同于后续一次或多次所用病毒载体的腺病 毒衣壳序列的来源。例如，治疗方案包括给予SAdV39、SAdV-25.2、-26、-30、 -37或-38载体和重复给予一种或多种血清型相同或不同的腺病毒载体。另一实 施方式中，治疗方案包括给予一种腺病毒载体，随后反复给予SAdV39、 SAdV-25.2、-26，-30、-37或-38载体，所述载体的衣壳来源不同于第一次递 送的腺病毒载体的衣壳，并任选还给予另一种来源相同，或优选不同于前一次 给药步骤中载体腺病毒衣壳的载体。这些方案不限于用递送用SAdV39、 SAdV-25.2、-26、-30、-37或-38猿猴序列构建的腺病毒载体。而且，这些方 案可容易地采用其它腺病毒序列，包括但不限于其它猿猴腺病毒序列(如Pan9 或C68、C1等)，其它非人灵长动物腺病毒序列或人腺病毒序列，与SAdV39、 SAdV-25.2，、-26、-30、-37或-38载体中的一种或多种联用。此说明书中讨论 了这种猿猴、其它非人灵长动物和人腺病毒血清型的例子。另外，这些治疗方 案包括同时或依次递送SAdV39、SAdV-25.2、-26、-30、-37或-38腺病毒载体， 联用非腺病毒载体、非病毒载体和/或各种其它有用的治疗化合物或分子。本发 明不限于这些治疗方案，本领域技术人员不难明白这些方案。
B.Ad-介导的免疫原性转基因的递送
所述重组SAdV-39、SAdV-25.2、-26、-30、-37或-38载体也可用作免疫 原性组合物。本文的免疫原性组合物是这样一种组合物，将其递送给哺乳动物， 优选灵长动物后，能针对其所递送的转基因产物产生体液(如抗体)或细胞(如细 胞毒T细胞)免疫应答的。重组猿猴Ad在其任意腺病毒序列中可含有编码所需 免疫原的基因缺失。与人来源的腺病毒相比，这种猿猴腺病毒可能更适合作为 不同种动物的重组活病毒疫苗，但不仅限于此用途。重组腺病毒可用作任何病 原体的预防性或治疗性疫苗，对于该病原体，已鉴定到对诱导免疫应答至关重 要且能够限制其传播的抗原，并可获得其cDNA。
这类疫苗(或其它免疫原性)组合物配制在合适的递送载体中，如上所述。 通常，免疫原性组合物的剂量在上述治疗组合物的剂量范围内。可监测所选基 因的免疫水平，以确定对加强免疫的需求(如果有的话)。评估血清中的抗体效 价后，可能需要任选的加强免疫。
可任选将本发明疫苗组合物配制成含有其它组分，包括例如佐剂、稳定剂、 pH调节剂、防腐剂等。疫苗领域技术人员熟知这类组分。合适佐剂的例子包 括但不限于脂质体、明矾、单磷酰脂质A和任何生物学活性因子，如细胞因子、 白介素、趋化因子、配体和其优化组合。可通过(例如)质粒或病毒载体在体内 表达所述的某些生物活性因子。例如，这类佐剂可与编码抗原的初免DNA疫 苗一起给药，以便相对于只用编码该抗原的DNA疫苗初免后产生的免疫应答 提高抗原特异性免疫应答。
以″免疫原性量″给予重组腺病毒，即，在给药途径中能够有效转染所需细 胞并提供足以诱导免疫应答的所选基因表达水平的重组腺病毒用量。提供保护 性免疫时，认为该重组腺病毒是用于防止感染和/或疾病复发的疫苗组合物。
或者，或此外，本发明的载体可含有编码能引发对所选免疫原产生免疫应 答的肽、多肽或蛋白质的转基因。预计本文所述的重组SadV载体能高度有效 低诱导针对插入的该载体表达的异源抗原蛋白的溶细胞性T细胞和抗体。
例如，免疫原可选自各种病毒科。需要免疫应答来抵御的病毒科的实例包 括：小RNA病毒科，其包括导致约50％普通感冒病例的鼻病毒属；肠病毒属， 其包括脊髓灰质炎病毒、柯萨奇病毒、艾柯病毒和人肠病毒(例如甲肝病毒)； 以及口疮病毒属，其主要在非人动物中导致口蹄疫。在小RNA病毒科内，靶 抗原包括VP1、VP2、VP3、VP4和VPG。另一病毒科包括杯状病毒科，其包 括诺沃克病毒群体，它是流行性胃肠炎的重要病原体。另一种对于用于靶向抗 原从而在人或非人动物中诱导免疫应答的理想病毒科是披膜病毒科，该科包括 甲型病毒属，该甲型病毒属包括辛德毕斯病毒、罗斯河病毒、和委内瑞拉、东 部和西部马脑炎病毒和风疹病毒属，包括风疹病毒。黄病毒科包括登革热、黄 热、日本脑炎、圣路易斯脑炎和蜱媒性脑炎病毒。其他靶抗原可从丙型肝炎或 冠状病毒科产生，其中包括许多非人病毒，例如感染性支气管炎病毒(家禽)、 猪传染性胃肠病毒(猪)、猪凝血性脑脊髓炎病毒(猪)、猫感染性腹膜炎病毒(猫)、 猫肠冠状病毒(猫)、狗冠状病毒(狗)和可导致普通感冒和/或非-甲型、乙型或 丙型肝炎的人呼吸冠状病毒。在冠状病毒科内，靶抗原包括E1(也称为M或基 质蛋白)、E2(也称为S或突起蛋白)、E3(也称为HE或血凝素-依尔替糖)、糖蛋 白(并非所有冠状病毒中都有)或N(核衣壳)。其它抗原可靶向弹状病毒科，包 括水疱病毒属(例如：疱疹口炎病毒)和狂犬病病毒属(例如：狂犬病)。
在弹状病毒科内，适当的抗原可源于G蛋白或N蛋白。包括出血热病毒例 如马尔堡和埃博拉病毒的丝状病毒科可能是合适的抗原来源。副黏病毒科包括 1型副流感病毒、3型副流感病毒、3型牛副流感病毒、腮腺炎病毒(流行性腮 腺炎病毒)、2型副流感病毒、4型副流感病毒、新城疫病毒(鸡)、牛瘟病毒、 麻疹病毒(其包括麻疹和犬瘟热)，以及肺病毒(其包括呼吸道合胞病毒)。流感 病毒被分在正黏病毒科内，并且是抗原(例如：HA蛋白、N1蛋白)的合适来源。 布尼亚病毒科包括布尼亚病毒属(加利福尼亚脑炎，拉克罗斯脑炎)、白蛉热病 毒属(裂谷热)、汉坦病毒属(普马拉是hemahagin热病毒)、内罗毕病毒属(内罗 毕绵羊病)和各种未命名的银环蛇病毒(bungavirus)。沙粒病毒科提供抗LCM和 拉沙热病毒的抗原来源。呼肠孤病毒科包括呼肠孤病毒属、轮状病毒属(其导 致儿童急性肠胃炎)、环状病毒属和科罗拉多蜱热病毒属(科罗拉多蜱热病毒属、 Lebombo病毒属(人)、马变性脑病病毒属、蓝舌病病毒属)。
逆转录病毒科包括致肿瘤RNA病毒亚科，该亚科包括人和兽医疾病，例如 猫白血病病毒、HTLVI和HTLVII、慢病毒亚科(包括HIV、猿免疫缺陷病毒、 猫免疫缺陷病毒、犬感染性贫血病毒和泡沫病毒亚科)。在慢病毒中，已经描 述且不难选择许多合适抗原。合适的HIV和SIV抗原的实例包括但不限于gag、 pol、Vif、Vpx、VPR、Env、Tat、Nef和Rev蛋白，及其各种片段。例如，Env 蛋白的合适片段可包括其任何亚基，如gp120、gp160、gp41或其较小片段， 如，长度至少约为8个氨基酸的片段。相似地，可选择tat蛋白的片段。[参见 美国专利5,891,994和美国专利6,193,981。]还参见，在D.H.Barouch等，J.Virol.， 75(5)：2462-2467(2001年3月)和R.R.Amara等，Science，292：69-74(2001年4 月6日)中所描述的HIV和SIV蛋白。在另一个例子中，可利用HIV和/或SIV 免疫原性蛋白质或肽形成融合蛋白或其它免疫原性分子。参见例如，2001年8 月2日公开的WO 01/54719和1999年4月8日公开的WO 99/16884所述的 HIV-1 Tat和/或Nef融合蛋白和免疫方案。本发明不限于本文所述的HIV和/ 或SIV免疫原性蛋白或肽。此外，已经描述过对这些蛋白的各种修饰，本领域 技术人员不难进行这些修饰。参见，例如：在美国专利5,972,596中描述了修 饰的gag蛋白。另外，任何所需的HIV和/或SIV免疫原均可单独或联合递送。 这类组合可包括由一种载体或多种载体表达。任选地，另一种联合递送可包括 递送一种或多种表达的免疫原与递送一种或多种蛋白质形式的免疫原。下面更 详细地讨论这种联合。
乳多空病毒科包括多瘤病毒亚科(BKU和JCU病毒)和乳头瘤病毒亚科(与 癌症或乳头瘤的恶性进展有关)。腺病毒科包括导致呼吸疾病和/或肠炎的病 毒(EX、AD7、ARD、O.B.)。细小病毒科包括猫细小病毒(猫肠炎)、猫全白细 胞减少病病毒、狗细小病毒和猪细小病毒科。疱疹病毒科包括α-疱疹病毒亚科， 其中包括单纯疱疹病毒属(HSVI，HSVII)、水痘病毒属(假性狂犬病、水痘带状 疱疹)和β-疱疹病毒亚科巨细胞病毒属(HCMV，鼠巨细胞病毒)和γ-疱疹病毒亚 科淋巴隐病毒属、EBV(伯基特淋巴瘤)、传染性鼻气管炎、马雷克病病毒和鼻 病毒。痘病毒科包括脊椎动物痘病毒亚科，包括正痘病毒属(天花和牛痘病毒)、 副痘病毒属、禽痘病毒属、山羊痘病毒属、兔痘病毒属、猪痘病毒属和昆虫痘 病毒亚科。嗜肝DNA病毒科包括乙肝病毒。可能是合适抗原来源的一种未分 类病毒是丁型肝炎病毒。其他的病毒来源包括鸟感染性粘液囊病病毒和猪呼吸 和生殖综合征病毒。甲型病毒科包括马动脉炎病毒和各种脑炎病毒。
用于免疫人或非人动物的抗其他病原体的免疫原包括，例如，感染人和非 人脊椎动物的细菌、真菌、寄生微生物或多细胞寄生虫，或来自癌细胞或肿瘤 细胞的病原体。细菌病原体的例子包括致病性革兰阳性球菌，包括肺炎双球菌； 葡萄球菌；和链球菌。致病性革兰阴性球菌包括脑膜炎球菌、淋球菌。致病性 肠革兰氏阴性杆菌包括肠杆菌科；假单胞菌属、不动杆菌属和埃肯菌属；类鼻 疽假单孢菌属；沙门菌属；志贺菌属；嗜血杆菌属：莫拉菌属；杜克雷嗜血杆 菌(H.ducreyi)(其导致软下疳)；布鲁杆菌；野兔热弗朗西丝菌(Franisella tularensis)(其导致兔热病)；耶尔森菌属(巴斯德菌属)；念珠状链杆菌和螺菌属； 革兰阳性杆菌，其包括单核细胞增多李斯特菌；红斑丹毒丝菌；白喉棒状杆菌 (Corynebacterium diphtheria)(白喉)；霍乱；炭疽杆菌(B.anthracis)(炭疽)；多诺 万病(腹股沟肉芽肿)和巴尔通体病。致病性厌氧菌引起的疾病包括破伤风；肉 毒中毒；其它梭菌病；结核病；麻风病；和其它分枝杆菌病。致病性螺旋体疾 病包括梅毒；密螺旋体病：雅司病、品他病和地方性梅毒；以及钩端螺旋体病。 较高致病性细菌和致病性真菌导致的其他感染包括放线菌病；诺卡菌病；隐球 菌病、芽生菌病、组织胞浆菌病和球孢子菌病；念珠菌病、曲霉病和毛霉病； 孢子丝菌病；副球孢子菌病、石样真菌病、球拟酵母病、足分枝菌病和着色真 菌病；以及皮真菌病。立克次体感染包括斑疹伤寒热、落矶山斑疹热、Q热和 立克次氏体痘。支原体和衣原体感染的实例包括：支原体肺炎、性病性淋巴肉 芽肿、鹦鹉热和围产期衣原体感染。致病性真核细胞包括致病性原生动物和蠕 虫，并且由其产生的感染包括：阿米巴病、疟疾、利什曼病、锥虫病、弓形体 病、卡氏肺囊虫(Pneumocystis carinii)、Trichans、鼠弓形体(Toxoplasma gondii)、 巴贝虫病、贾第虫病、旋毛虫病、丝虫病、血吸虫病、线虫、吸虫(trematode) 或吸虫(fluke)感染和绦虫(绦虫)感染。
这些生物体和/或其产生的毒素中有许多已被疾病控制中心[(CDC)，健康 与人类服务部(Department of Heath and Human Services)，美国]认定为是可用于 生物攻击的物质。例如，某些此类生物物质包括目前分类为A类物质的炭疽杆 菌(Bacillus anthracis)(炭疽)、肉毒梭菌(Clostridium botulinum)及其毒素(肉毒杆 菌毒素)、鼠疫耶尔森菌(Yersinia pestis)(鼠疫)、大天花(天花)、野兔热弗朗西丝 菌(Franisella tularensis)(兔热病)和病毒性出血热[丝状病毒(例如：埃博拉病毒、 马尔堡病毒)和沙粒病毒[例如：拉沙病毒、马丘博病毒]；目前分类为B类物质 的伯内特科克斯立克次体(Coxiella burnetti)(Q热)、布鲁杆菌(布鲁杆菌病)、鼻 疽伯克霍尔德氏菌(Burkholderia mallei)(鼻疽)、假鼻疽伯克霍尔德氏菌 (Burkholderia pseudomallei)(类鼻疽)、蓖麻(Ricinus communis)及其毒素(蓖麻蛋 白毒素)、产气荚膜梭菌(Clostridium perfringen)及其毒素(ε毒素)、葡萄球菌 (Staphylococcus)及其毒素(肠毒素B)、鹦鹉热衣原体(Chlamydia psittaci)(鹦鹉 热)、水安全性威胁(如霍乱弧菌(Vibrio cholerae)、细小隐孢子菌(Cryptosporidium parvum))、斑疹伤寒(普氏立克氏体(Richettsia powazekii))和病毒性脑炎(如α-病 毒如委内端拉马脑炎、东方马脑炎、西方马脑炎；所有这些目前分类为B类病 原；和日本病毒与汉坦病毒，其目前分类为C类病毒。此外，其他如此分类或 不同分类的生物体也可能在将来可被鉴定和/或用于这种目的。容易理解的 是，本文所述的病毒载体和其他构建体可用于传递来自这些生物体的抗原、病 毒、其毒素或其他副产物，这可预防和/或治疗这些生物物质引起的感染或其 他不良反应。
预计施用SAdV-39、SAdV-25.2、-26、-30、-37或-38载体来递送抗T细胞 可变区的免疫原能引发包括CTL在内的免疫应答来消除T细胞。在RA中， 已鉴定了参与该疾病的数种特定TCR可变区。这些TCR包括V-3、V-14、V-17 和Vα-17。因此，递送编码这些多肽中至少一种的核酸序列将引发以参与RA 的T细胞为目标的免疫应答。在MS中，已鉴定了参与该疾病的数种特定TCR 可变区。这些TCR包括V-7和Vα-10。因此，递送编码这些多肽中至少一种 的核酸序列将引发以参与MS的T细胞为靶点的免疫应答。在硬皮病中，已鉴 定了参与该疾病的数种特定TCR可变区。这些TCR包括V-6、V-8、V-14和 Vα-16、Vα-3C、Vα-7、Vα-14、Vα-15、Vα-16、Vα-28和Vα-12。因此，递送 编码这些多肽中至少一种的重组猿猴腺病毒将引发以参与硬皮病的T细胞为 目标的免疫应答。
C.Ad-介导的递送方法
可监测所选基因的治疗水平或免疫力水平，以确定对加强免疫的需求(如果 有的话)。评估血清中的CD8+T细胞应答，或任选评估血清中的抗体效价后， 可能需要任选的加强免疫。任选地，可以单独给药或各种联合给药方案来递送 重组SAdV-39、SAdV-25.2、-26、-30、-37或-38载体，例如，与包括其它活 性成分的方案或疗程联用或在初免-加强方案中递送。本领域已经描述过各种 方案，不难进行选择。
例如，初免-加强方案可包括给予DNA(如质粒)载体，以使免疫系统对第二 次加强给予传统抗原，如蛋白质或携带编码这种抗原的序列的重组病毒产生免 疫力。参见例如，纳入作参考的2000年3月2日公开的WO 00/11140。或者， 免疫方案可包括给予重组SAdV-39、SAdV-25.2、-30、-37或-38载体以加强对 携带抗原或蛋白质载体(病毒或DNA载体)的免疫应答。在另一个替换方式中， 免疫方案包括给予蛋白质后用编码抗原的载体加强。
一实施方式中，描述的对所选抗原的初次和加强免疫应答的方法是通过递 送载有所述抗原的质粒DNA载体，然后用重组SAdV-39、SAdV-25.2、-26、 -30、-37或-38载体加强。一实施方式中，该初免-加强方案包括表达初免和/ 或加强载体携带的多种蛋白质。见例如，R.R.Amara，Science，292：69-74 (2001/4/6)，其描述了表达用于对HIV和SIV产生免疫应答的蛋白亚单位的多 蛋白方案。例如，DNA初免时通过一种转录物递送Gag、Pol、Vif、VPX和 Vpr和Env、Tat和Rev。或者，可在重组SAdV-39、SAdV-25.2、-26、-30、-37 或-38腺病毒构建物中递送SIV Gag、Pol和HIV-1 Env。其它方案见WO 99/16884和WO 01/54719。
然而，初免-加强方案不限于HIV的免疫或递送这些抗原。例如，初免可包 括递送第一SAdV-39、SAdV-25.2、-26、-30、-37或-38载体，然后用第二Ad 载体或含有蛋白质形式的该抗原的组合物加强。在一个实例中，初免-加强方 案可提供针对产生该抗原的病毒、细菌或其它生物体的保护性免疫应答。在另 一实施方式中，初免-加强方案提供可用检测所治疗病症的存在的常规试验测 定的疗效。
初免组合物可以剂量依赖性方式给予身体的不同部位，这取决于所需免疫 应答靶向的抗原。本发明不受注射量或部位，或药物载体的限制。另外，该方 案可包括初免和/或加强步骤，各步骤可包括每小时、每天、每周、每月或每年 给予的单次给药或剂量。例如，该哺乳动物可接受载体中含有约10μg-50μg 质粒的一个或两个剂量。DNA组合物的所需用量约为1μg-10,000μg DNA载 体。剂量可以在约1-1000μg DNA/kg对象体重的范围中变化。宜根据哺乳动 物的种类和条件选择递送量或递送部位。
本文描述了适合将该抗原递送给哺乳动物的载体的剂量单位。可通过悬浮 或溶解于药学或生理学上可接受的运载体如等渗盐水；等渗盐溶液或本领域技 术人员已知用于这类给药中的其它制剂中，制备给药载体。本领域技术人员了 解合适的载体，载体的种类主要取决于给药途径。可按照上述途径将本文所述 组合物给予哺乳动物，例如在采用可生物降解的生物相容性聚合物的缓释制剂 中递送，或用胶束、凝胶和脂质体原位(on-site)递送。任选地，初免步骤也包 括给予初免组合物、合适量的佐剂，如本文所述。
优选地，将初免组合物给予哺乳动物对象约2-27周后，给予加强组合物。 用有效量的含有或能够递送与初免DNA疫苗所给抗原相同的抗原的加强组合 物给予该加强组合物。该加强组合物由衍生自同一病毒来源(如本发明腺病毒 序列)或另一来源的重组病毒载体组成。或者，该“加强组合物”可以是含有初免 DNA疫苗编码的相同但是蛋白或多肽形式的抗原的组合物，此组合物可在宿 主中诱导免疫应答。在另一实施方式中，该加强组合物含有编码抗原的DNA 序列，例如载体，如熟知的细菌或病毒载体，所述DNA序列受指导其在哺乳 动物细胞中表达的调节序列的控制。对加强组合物的主要要求是：该组合物的 抗原是与初免组合物编码抗原相同的或能交叉反应的抗原。
在另一实施方式中，所述SAdV-39、SAdV-25.2、-26、-30、-37或-38载体 也适合用于各种免疫和治疗方案。这类方案可包括与不同血清型衣壳的Ad载 体同时或依次递送SAdV-39、SAdV-25.2、-26、-30、-37或-38载体的方案， 与非Ad载体同时或依次递送SAdV-39、SAdV-25.2、-26、-30、-37或-38载体 的方案，与蛋白质、肽和/或其它有生物活性的治疗或免疫原性化合物同时或依 次递送SAdV-39、SAdV-25.2、-26、-30、-37或-38载体的方案。本领域技术 人员不难理解这些应用。
再在另一个实施方式中，本发明提供这些病毒衣壳(任选是完整或重组病 毒颗粒或空衣壳)的应用，即通过递送腺病毒SAdV-39、SAdV-25.2、-26、-30、 -37或-38给对象来诱导免疫调节效应应答，或者增强或辅助另一活性剂的细胞 毒T细胞应答。SAdV-39、SAdV-25.2、-26、-30、-37或-38衣壳可单独递送或 与活性剂组合递送以增强其免疫应答。有利地，可实现所需效应同时使宿主不 受血清型E腺病毒的影响。
在另一方面，提供了在有此需要的对象中诱导产生干扰素α的方法，包括 递送SAdV-39、SAdV-25.2、-26、-30、-37或-38衣壳到对象。再在另一个方 面，提供了在培养物中产生一种或多种细胞因子(如INF-α)/趋化因子的方法。 该方法包括在适合产生包括干扰素α等在内的细胞因子/趋化因子的条件下培 养含有树突细胞和本文所述SAdV-39、SAdV-25.2、-26、-30、-37或-38衣壳 的培养物。
如此产生的细胞因子可用于各种应用。例如，就IFNα而言，本文所述的产 品特别理想，因为认为该产品将优于市售重组制造的IFNα，市售IFNα仅含一种 或两种细菌中产生的IFNα亚型。相反，估计该方法能够制造多种亚型的天然人 IFNα，预计能得到更广谱的作用。据信，每种亚型具有特定的生物活性。此外， 预计通过本文提供方法制造的天然干扰素在免疫方面与患者天然产生的干扰 素相同，从而降低通常由于形成针对重组产生的干扰素的中和抗体而造成药物 被对象的免疫系统排斥的风险。
以下实施方式将阐明SAdV-39、SAdV-25.2、-26、-30、-37或-38的克隆和 示范性重组SAdV-39、SAdV-25.2、-26、-30、-37或-38载体的构建。这些实 施方式只是为了说明而非限制本发明的范围。
实施例1-猿猴腺病毒的分离
从美国路易斯安那大学伊比利亚研究中心(University of Louisiana New Iberia Research Center，4401W.Admiral Doyle Drive，New Iberia，Louisiana，USA) 的黑猩猩群以及美国德州大学安德森癌症中心(Michael E.Keeling Center for Comparative Medicine and Research，University of Texas M.D.Anderson Cancer Center，Bastrop，Texas，USA)的黑猩猩群体获得粪便样品。将黑猩猩粪便样品悬 浮于汉克斯平衡盐溶液，取上清液通过0.2微米注射滤器无菌过滤。将100μl 过滤的各样品接种到人细胞系A549培养物上。将这些细胞培养在含10％FBS、 1％青霉素-链霉素和50μg/ml庆大霉素的Ham F12上。培养大约1-2周后，在 含有若干接种物的细胞培养物中出现明显的肉眼可见的细胞病变效应(CPE)。 采用已经公开的标准的腺病毒纯化氯化铯梯度技术从A549细胞培养物中纯化 腺病毒。由德国恰根基因组服务部分(Qiagen Genomic services，Hilden，Germany) 完成纯化腺病毒DNA的分离和测序。
基于病毒DNA序列的系统进化分析法，被称为猿猴腺病毒25.2 (SAdV-25.2)、猿猴腺病毒26(SAdV-26)、猿猴腺病毒30(SAdV-30)、猿猴腺病 毒37(SAdV-37)、猿猴腺病毒38(SAdV-38)和猿猴腺病毒39(SAdV-39)的腺病 毒测定为与人亚组E处于同一亚组。
序列分析显示，与SAdV-26的六邻体具有最接近的六邻体匹配的是黑猩猩 腺病毒6(98.4％同一性)，具有最接近的尾丝匹配的是人腺病毒4(93％同一 性)。
序列分析显示，与SAdV25.2病毒具有最接近的基因组匹配的是猿猴(黑猩 猩)腺病毒25[Genbank登录号AC000011]。SAdV25之前被称为C68或Pan9[美 国专利No 6083716]。在核酸水平上，通过载体NTI-AlignX测得SAdV25.2和 SAdV25之间的同一性为94％。在六邻体(氨基酸)水平上，SAdV-25.2与具有 两种保守性氨基酸改变和两种非保守性改变的猿猴腺病毒25有99％同一性。 下表比较了SAdV25.2和SAdV25六邻体序列的氨基酸改变，以SAdV25.2六 邻体(SEQ ID NO：140)为参考。两个序列的编号是相同的。
氨基酸残基
用来产生载体的方法是先产生完整的E1-缺失腺病毒载体的细菌质粒分子 克隆，然后将质粒DNA转染入E1补充细胞系HEK293以拯救病毒载体。
为产生E1-缺失腺病毒载体的分子克隆，首先产生已在其中插入罕见切割 限制酶I-CeuI和PI-SceI的识别位点以代替E1缺失的E1-缺失腺病毒的质粒分 子克隆。表达盒的两侧为I-CeuI和PI-SceI，用这些限制性酶切割，并将表达 盒连接入E1-缺失腺病毒质粒克隆。将包含所需表达盒以代替E1缺失的质粒 腺病毒分子克隆转染入HEK293细胞以拯救重组腺病毒载体。发现先用限制性 酶消化从质粒释放线形腺病毒基因组将有助于转染后的拯救。
实施例2-用标准分子生物学技术构建基于SAdV-39、SAdV-25.2、SAdV-26、 SAdV-30、SAdV-37或SAdV-38的E1-缺失的质粒分子克隆
A.SAdV-39的载体构建
按照描述制备采用SAdV-39(亚组E)的E1缺失载体。
1.构建pSR3：
如下所述将侧接SwaI位点的含有SmaI、HindII、EcoRV位点的接头克隆入 用EcoRI和NdeI切割的pBR322。
将寡聚体SEQ ID NO：196：SV25顶部：
AATTATTTAAATCCCGGGTATCAA-GCTTGATAGATATCATTTAAAT和
SEQ ID NO：197：SV25底部：
TAATTTAAATGATATCTATCAAGCTTGATACCCGGGATTTAAAT一起退 火形成接头。
2.SAdV-39病毒左端到HindIII位点(7152)的克隆
用HindIII消化病毒DNA并将7152bp的左端片段克隆入用SmaI和HindIII 消化的pSR3以产生pSR3 C39LE。
3.E1功能缺失以及I-CeuI和PI-SceI位点的插入：
将质粒pC39LE的SnaBI和NdeI(Klenow填入)之间切除以删除E1a和大部 分E1b编码区；在其位置连接入一DNA片段(从带有I-CeuI和PI-SceI位点的 pBleuSK I-PI获得的EcoRV片段)以产生pC39LEIP。
4.从NheI位点到SAdV-39病毒右端(35779)的克隆
用NheI消化SAdV-39病毒DNA并将775bp的右端片段克隆入pC39LEIP 的EcoRV和NheI之间以产生pC39LE IP RE。
5.SAdV-39病毒NheI片段(3033-35779)的克隆
用HindIII消化质粒pC37-LE-IP-RE并连接入32746bp的病毒NheI片段。 具有正确取向的克隆称为pC39IP。
B.采用标准分子生物学技术构建基于SAdV-25.2的E1-缺失质粒分子克隆
按照描述制备采用SAdV-25.2(亚组E)的E1缺失载体。
1.构建pSR6：
如下所述将侧接PacI位点的含有SmaI、AscI、AvrII、EcoRV位点的接头克 隆入用EcoRI和NdeI切割的pBR322。
将寡聚体SEQ ID NO：198：pSR6顶部：
AATTTTAATTAACCCGGGTATCGGC-GCGCCTTAACCTAGGGATAGATA TCTTAATTAA和
SEQ ID NO：199：pSR6底部：
TATTAATTAAGATATCTATCCCTAGGTTAAGGCGCGCCGATACCCGGGT TAA-TTAA一起退火形成接头。
2.病毒左端到AscI位点(7959)的克隆
用AscI消化病毒DNA并将7959bp的左端片段克隆入用SmaI和AscI消 化的pSR6以产生pSR5C25.2LE。
3.E1功能缺失以及I-CeuI和PI-SceI位点的插入：
用SnaBI+NdeI消化质粒pSR5 C25.2LE；用Klenow填入NdeI位点。连 接入pBleuSK I-PI的EcoRV片段以产生pSR5C25.2LE IP。
4.从XbaI位点克隆病毒右端(30071)
用XbaI+EcoRV消化质粒pSR5 C25.2LE IP。连接入SAdV-25.2DNA的 6559bp的右端(XbaI消化)片段以产生pAdC12-LE-IP-RE。
5.病毒中部XbaI片段(6037-30071)的克隆
用XbaI消化质粒pAdC12-LE-IP-RE。连接入SAdV-25.2DNA的24034bp 的片段以产生pAdC25.2IP。
C.采用标准分子生物学技术构建基于SAdV-26的E1-缺失质粒分子克隆
按照描述制备采用SAdV-26(亚组E)的E1缺失载体。
1.构建pSR5：
将侧接SwaI位点的含有SmaI、ClaI、XbaI、SpeI、EcoRV位点的接头克隆 入用EcoRI和NdeI切割的pBR322。
将合成的寡核苷酸SV39T，SEQ ID NO：194 AATTATTTAAATCCCGGGGATCATCGATGATCTCTAGAGATCACTAGTCTA GGATATCATTTAAA和SV39B，SEQ ID NO：195 TATTTAAATGATATCCTAGACTAGT-GATCTCTAGAGATCATCGATGATCCC CGGGATTTAAAT退火产生接头。
2.病毒左端到XbaI位点(6029)的克隆
用XbaI消化病毒DNA并将6kb片段(左端和右端)凝胶纯化并连接入用 SmaI和XbaI消化的pSR5。
3.E1功能缺失以及I-CeuI和PI-SceI位点的插入：
用SnaBI+NdeI消化质粒pSR5-C12-LE；用Klenow填入NdeI位点。连接 入pBleuSK I-PI的EcoRV片段以产生pAdC12-LE-IP。
4.从XbaI位点克隆病毒右端(30158)
用XbaI+EcoRV消化质粒pAdC12-LE-IP。连接入SAdV-26DNA的6471bp 的右端(XbaI消化)片段以产生pAdC12-LE-IP-RE。
5.病毒中部XbaI片段(6029-30158)的克隆
用XbaI+EcoRV消化质粒pAdC12-LE-IP-RE。连接入SAdV-26DNA的 24129bp的片段以产生pC26IP。
D.SAdV-30的载体构建
按照描述制备采用SAdV-30(亚组E)的E1缺失载体。
1.构建pSR3：
如下所述将侧接SwaI位点的含有SmaI、HindII、EcoRV位点的接头克隆入 用EcoRI和NdeI切割的pBR322。
将寡聚体SEQ ID NO：196：SV25顶部：
AATTATTTAAATCCCGGGTATCAAGCTTGATAGATATCATTTAAAT和
SEQ ID NO：197：SV25底部：
TAATTTAAATGATATCTATCAAGCTTGATACCCGG-GATTTAAAT一起退 火形成接头。
2.病毒左端到HindIII位点(7146)的克隆
用HindIII消化病毒DNA并将7146bp的左端片段克隆入用SmaI和HindIII 消化的pSR3以产生pSR3C30LE。
3.E1功能缺失以及I-CeuI和PI-SceI位点的插入：
用SnaBI+NdeI消化质粒pSR3C30LE；用Klenow填入NdeI位点。连接 入pBleuSK I-PI的EcoRV片段以产生pC30LE IP。用EcoRI消化pC30LE IP 以破坏内部EcoRI位点(从左ITR开始1040bp的位置上)，用Klenow聚合酶填 入突出端并重连接。如此产生了质粒pC30LE IP(EcoRI缺失)。
4.从HindIII位点克隆病毒右端(33048)
用HindIII+EcoRV消化质粒pC30 LE IP(EcoRI缺失)。连接入SAdV-30 DNA的3574bp的右端(HindIII消化)片段以产生pC30-LE-IP-RE。
5.病毒中部XbaI(6035)到EcoRI(33631)片段的克隆
用XbaI+HindIII消化质粒pC30-LE-IP-RE。连接入SAdV-30DNA的27596 bp的片段以产生pC30IP。
E.SAdV-37的载体构建
按照描述制备采用SAdV-37(亚组E)的E1缺失载体。
1.构建pSR3：
如下所述将侧接SwaI位点的含有SmaI、HindII、EcoRV位点的接头克隆入 用EcoRI和NdeI切割的pBR322。将寡聚物：SEQ ID NO：196：SV25顶部： AATTATTTAAATCCCGGGTATCAAGCTTGATAGAT-ATCATTTAAAT和SEQ ID NO：197：SV25底部：
TAATTTAAATGATATCTATCAAGCTTGATACCCGGGATTTAAAT一起退火形 成接头。
2.SAdV-37病毒左端到HindIII位点(7147)的克隆
用HindIII消化病毒DNA并将7147bp的左端片段克隆入用SmaI和HindIII 消化的pSR3以产生pSR3C37LE。
3.E1功能缺失以及I-CeuI和PI-SceI位点的插入：
将pSR3 C37LE质粒的SnaBI和NdeI(Klenow填入)之间切除以删除E1a和 大部分E1b编码区；在其位置连接入一DNA片段(从带有I-CeuI和PI-SceI位 点的pBleuSK I-PI获得的EcoRV片段)以产生pSR3 C37LEIP。
4.从HindIII位点克隆SAdV-37病毒右端(33048)
用HindIII+EcoRV消化质粒pC37LE IP。连接入SAdV-37DNA的3575bp 的右端(HindIII消化)片段以产生pC37-LE-IP-RE。
5.SAdV-37病毒HindIII片段(23522-33060)的克隆
用HindIII消化质粒pC37-LE-IP-RE并连接入9538bp的病毒HindIII片段。 具有正确取向的克隆称为pC37del Xba Pac。
6.SAdV-37病毒XbaI(6036)PacI(30181)的克隆
用XbaI和PacI消化质粒pC37del Xba Pac并连接入24145bp的病毒XbaI- PacI片段从而产生pC37IP。
F.构建E1-缺失腺病毒载体
为插入用I-CeuI和PI-SceI识别位点代替E1缺失的DNA区段，使用了质 粒pBleuSK I-PI。质粒pBleuSK I-PI含有插入pBluescript II SK(+)(斯图特基因 公司(Stratagene))的EcoRV位点的654bp片段。该654bp片段带有罕见切割限 制酶I-CeuI和PI-SceI的识别位点。为插入用I-CeuI和PI-SceI识别位点代替 E1缺失的DNA区段，用EcoRV消化pBleuSK I-PI并将654bp的片段连接入 腺病毒基因组E1缺失的位置。插入的DNA的序列显示在下面，其侧接EcoRV 识别位点。下划线表示I-CeuI和PI-SceI的识别序列。
SEQ ID NO：200：
GATATCATTTCCCCGAAAAGTGCCACCTGACGTAACTATAACGGTCCTAAGGTAGCGAAAGCTCAGATCTCCCGATCCCCTATGGTGCACTCTCAGTA CAATCTGCTCTGATGCCGCATAGTTAAGCCAGTATCTGCTCCCTGCTTGTG TGTTGGAGGTCGCTGAGTAGTGCGCGAGCAAAATTTAAGCTACAACAAG GCAAGGCTTGACCGACAATTGCATGAAGAATCTGCTTAGGGTTAGGCGTT TTGCGCTGCTTCGCGATGTACGGGCCAGATATACGCGGTACGAAACCGCT GATCAGCCTCGACTGTGCCTTCTAGTTGCCAGCCATCTGTTGTTTGCCCCT CCCCCGTGCCTTCCTTGACCCTGGAAGGTGCCACTCCCACTGTCCTTTCC TAATAAAATGAGGAAATTGCATCGCATTGTCTGAGTAGGTGTCATTCTATT CTGGGGGGTGGGGTGGGGCAGGACAGCAAGGGGGAGGATTGGGAAGAC AATAGCAGGCATGCTGGGGATGCGGTGGGCTCTATGGCTTCTGAGGCGGA AAGAACCAGCAGATCTGCAGATCTGAATTCATCTATGTCGGGTGCGGAGAAAGAGGTAATGAAATGGCATTATGGGTATTATGGGTCTGCATTAATGAATC GGCCAGATATC
为构建表达流感病毒核蛋白的E1-缺失腺病毒载体，将编码H1N1甲型流感 病毒NP的核苷酸序列(A/Puerto Rico/8/34/Mount Sinai，GenBank登录号 AF389119.1)密码子优化并完整合成(CG公司(Celtek Genes)，纳什维尔，田纳 西州)。构建由人巨细胞病毒早期启动子、合成内含子(获自质粒pCI(普洛麦格 公司(Promega)，麦迪逊，威斯康星州)、密码子优化的甲型流感NP编码序列 和牛生长激素聚酰苷酸化信号构成的表达盒。在含有上述表达盒的质粒 pShuttle CMV PI FluA NP上分别侧接罕见切割限制酶I-CeuI和PI-SceI(NEB公 司(New England Biolabs))的识别位点。为产生E1-缺失腺病毒载体的分子克隆， 如本实施例之前部分的描述产生已在其中插入罕见切割限制酶I-CeuI和 PI-SceI的识别位点以代替E1缺失的E1-缺失腺病毒的质粒分子克隆。然后用 I-CeuI和PI-SceI消化E1-缺失腺病毒质粒并连接入表达盒(用相同的酶消化)。 将所得腺病毒质粒分子克隆转染入HEK 293细胞以拯救重组腺病毒载体。发 现先用限制性酶消化从质粒释放线形腺病毒基因组将有助于转染后的拯救。
实施例3-交叉中和抗体的评价
用通过直接免疫荧光监测的感染抑制中和抗体试验评价野生型SAdV-39、 SAdV-25.2、SAdV-26、SAdV-30、SAdV-37和SAdV-38的交叉中和活性，并与 人腺病毒5(亚种C)和黑猩猩腺病毒7(SAdV-24)以及人混合IgG进行比较。人 混合IgG是市售的并被批准用于免疫削弱患者，它含有能抵抗正常人群会接触 到的许多抗原的抗体。人混合IgG中猿猴腺病毒中和抗体的存在与否反映了常 规人群中这些腺病毒的抗体的流行率。
如下进行试验。将从注射过HAdV-5或SAdV-24的兔子获得的血清样品在 56℃加热灭活35分钟。将野生型腺病毒(108颗/孔)稀释于无血清的Dulbecco 改进的Eagle培养基(DMEM)，并与用DMEM作2倍连续稀释的热灭活血清样 品一起37℃温育1小时。随后在载玻片含105单层A549细胞的孔中加入血清 -腺病毒混合物。1小时后在各孔的细胞中添加100μl 20％胎牛血清 (FBS)-DMEM并在5％CO2下37℃培育22小时。然后，用PBS将细胞冲洗两 次并用DAPI和抗HAdV-5的山羊FITC标记的广谱交叉反应性抗体(Virostat) 染色，随后用低聚甲醛固定(4％，30分钟)并用0.2％Triton透化(4℃，20分钟)。 在显微镜下对FITC阳性细胞计数以确定感染水平。NAB效价反映了与天然血 清对照相比以50％或更高水平抑制腺病毒感染的最高血清稀释度。当效价值 ＜1/20时，中和抗体浓度低于检出限，即低于1/20。
种类 病毒 抗-HAdV-5 抗-SAdV-24 人混合IgG
C HAdV-5 1/81,920 ＜1/20 1/640
E SAdV-24(C7) ＜1/20 1/655,360 1/20
SAdV-25.2 ＜1/20 1/655,360 1/40
SAdV-26 1/20 1/40,960 1/20
E SAdV-30 ＜1/20 1/1,280 1/20
SAdV-37 ＜1/20 1/320 1/20
SAdV-39 ＜1/20 1/320 1/20
这些数据表明，常规人群对这些腺病毒的免疫反应性极低。这些数据还表 明，上表中不与HAdV-5和SAdV-24交叉反应的猿猴腺病毒可用于涉及连续递 送腺病毒的方法，例如初免-加强方案或癌症治疗。
实施例4-细胞因子诱导
从人外周血单核的细胞(PBMC)分离类浆细胞样树突细胞，在96孔板的培 养基内培养并用腺病毒感染。48小时后将细胞离心，收集上清并分析干扰素α 的存在。
更具体地说，从宾西法尼亚大学(University of Pennsylvania)AIDS研究中心 (CFAR)免疫学中心获得PBMC。然后采用MB公司(Miltenyi Biotec)的“人类浆 细胞样树突细胞分离试剂盒”，按照试剂盒上提供的说明用300,000,000个 这些细胞来分离类浆细胞样树突细胞(pDC)。使用该试剂盒分离基于除去 PBMC中除pDC外的所有其他细胞类型。
最终的细胞数通常随供体而不同，但范围在400,000-700,000个细胞。 如此便通过分析众多供者产生了数据(如下文所讨论)。尽管出乎意料，但当分 析众多供体的细胞时，基于干扰素或其他其他细胞因子释放的亚组分离维持。
将细胞培养在添加了L-谷氨酰胺、10％胎牛血清(梅地亚技术公司 (Mediatech))、10mM Hepes缓冲液(英杰公司)、抗生素(青霉素、链霉素和庆大 霉素-来自梅地亚技术公司)和人白细胞介素3(20ng/mL-R&D)的 RPMI-1640培养基(梅地亚技术公司)中。以10,000的感染复数(MOI)(每个细胞 10,000个病毒，浓度为106细胞/ml)在细胞中直接加入野生型腺病毒。48小时 后将细胞离心，测定上清中干扰素α的存在。用PBL生物医疗实验室(PBL Biomedical Laboratories)的酶联免疫吸附试验(ELISA)试剂盒采用制造商推荐的 试验方法测量细胞因子。
研究显示，亚组C腺病毒产生无法检出量的IFNα(该试验的检出限为1250 pg/mL)。相反，亚组E腺病毒的所有检测成员产生IFNα，且产生的IFNα通常 远高于亚组B腺病毒。
在腺病毒的筛选中同时检测了许多其他细胞因子。然而，通常，相比亚组 C腺病毒，亚组E腺病毒产生显著较高水平的IL-6、RANTES、MIP-1α、TNF-α、 IL-8和IP-10。亚组B腺病毒在诱导IFNα、IL-6、RANTES和MIP1α方面的性 能也优于亚组C腺病毒。
由于在该研究中没有观察到显著的细胞裂解，说明细胞因子是通过细胞与 亚组E腺病毒接触而产生的，与感染以及缺少任何显著量的病毒复制无关。
在另一项研究中(未显示)，如上所述将细胞与空C7衣壳蛋白(AD亚组E) 或UV-灭活的腺病毒C7病毒载体(UV灭活造成交联，消除腺病毒基因表达)一 起培育。在这些研究中，与完整C7相比，在空衣壳和灭活病毒载体中都观察 到相同或更高水平的IFNα。
发明人发现，使产生细胞因子的细胞或产生趋化因子的细胞，如PBMC、 PBL和树突细胞，接触亚组E腺病毒成员的衣壳会诱导细胞因子，尤其是IFNα， 或趋化因子，其诱导量远高于其他腺病毒亚组。因此，该亚组成员可用于在培 养物中诱导干扰素α以及较少量的许多其他细胞因子/趋化因子。
对IFNα而言，这种制造方法特别理想，因为据信它比重组制造的IFNα好。 相反，估计本文提供的方法能够制造多种亚型的天然人IFNα，预计能产生广 谱作用。据信，每种亚型具有特定的生物活性。此外，预计通过本文提供方法 制造的天然干扰素在免疫方面与患者天然产生的干扰素相同，从而降低通常由 于形成针对重组产生的干扰素的中和抗体而造成药物被对象的免疫系统排斥 的风险。
亚组E腺病毒产生的其他细胞因子包括白细胞介素(IL)-6、IL-8、IP-10、巨 噬细胞炎性蛋白-1α(MIP-1α)、RANTES和肿瘤坏死因子α。从培养物中纯化这 些细胞因子/趋化因子的方法以及这些细胞因子/趋化因子的治疗或佐剂用途已 在文献中描述过。此外，市售的柱或试剂盒可用来纯化按照本发明制备的细胞 因子/趋化因子。采用本发明制造的细胞因子/趋化因子可用于许多适应症。
例如，本文所述的细胞因子包括，干扰素α(IFNα)、肿瘤坏死因子α(TNFα)、 IP-10(干扰素γ诱导蛋白)、白细胞介素-6(IL-6)和IL-8。已经描述过IFNα可用 于治疗流感、肝炎(例如，包括乙肝和丙肝)和许多赘生性疾病，如肾癌(肾细胞 癌)、黑色素瘤、恶性肿瘤、多发性骨髓瘤、类癌瘤、淋巴瘤和白血病(如慢性 髓细胞性白血病和毛细胞白血病)。按照本文的描述制造的IFNα亚型的混合物 可采用已知技术纯化。参见例如WO 2006/085092，其描述了单克隆抗体和柱 纯化的应用。其他技术已在文献中描述。
按照本文的描述制造的IFNα可采用已知方法纯化。参见，例如，美国专利 4,680,260，美国专利4,732,683和G.Allen，Biochem J.，207：397-408(1982)。已 经描述IFNα可用于治疗包括例如银屑病和类风湿性关节炎在内的自身免疫性 疾病。干扰素γ诱导蛋白IP-10可用作血管发生的有力抑制剂并且具有很强的 胸腺依赖性抗肿瘤效应。
因此，再在另一方面，提供了在适合产生细胞因子的条件下培育含树突细 胞的培养物和亚组E腺病毒衣壳来制造IFNα的方法。
在一个实施方式中，从健康供体(优选人)抽取血液并采用已知技术制备外 周血粒细胞(PBL)或外周血单核的细胞(PBMC)。在一个实施方式中，按照本发 明所述方法，PBL被用作产生细胞因子的细胞。在另一实施方式中，PBMC被 用作产生细胞因子的细胞。在另一个实施方式中，采用已知技术从PBL或PBMC 分离类浆细胞样树突细胞，例如采用市售的德国MB公司的“人类浆细胞样树突 细胞分离试剂盒”。将选出的细胞与合适的培养基和腺病毒亚组E衣壳蛋白一起 悬浮培养。本领域技术人员可容易地确定合适的培养基。然而，在一个实施方 式中，所述培养基是RPMI-1640培养基。或者，可方便地选择其他培养基。
细胞可培养在合适容器内，如微滴定孔、烧瓶或较大容器。一实施方式中， 细胞浓度为每毫升培养基约1,000,000细胞。然而，本领域技术人员可容易 地确定其他合适的细胞浓度。
有利地，本发明不要求使用干扰素作为引物。然而，如果需要，培养基中 可含有合适的细胞因子，IL-3，以刺激细胞生长。一种合适的浓度为约20ng/mL。 然而，也可使用其他浓度。
一实施方案中，在含有细胞的培养物中引入腺病毒衣壳蛋白。可采用本文 所述任何形式(例如，病毒颗粒，包括空衣壳蛋白，含Ad亚组E衣壳的病毒载体， 等等)将腺病毒衣壳蛋白递送到培养物。通常将衣壳蛋白悬浮于合适载体，如 培养基、盐水等。
以每个细胞约100到100,000个腺病毒亚组E颗粒的量在培养物中加入腺病 毒亚组E衣壳是合适的。然后培育混合物，例如在约28-40℃下培育，在约35-37℃ 下培育，或在约37℃时培育。
通常，大约12-96小时后，或约48小时后将细胞离心并收集上清。在避免细 胞裂解的条件下进行离心是合适的，这样可减少或消除上清液中存在的细胞碎 片。离心能够将细胞因子与细胞分离，从而得到粗分离的细胞因子。可利用排 阻柱以及其他已知的柱和方法从腺病毒和腺病毒衣壳等中进一步纯化细胞因 子。
如此纯化的这些细胞因子可用于制剂中以及用于各种应用。
如上所述且不限于理论，腺病毒亚组E的免疫增强和/或产生细胞因子的能 力似乎是基于细胞和腺病毒衣壳之间的接触，而与腺病毒颗粒的感染或复制能 力无关。因此，一实施方式中，空腺病毒亚组E颗粒(即其中未包装表达任何腺 病毒或转基因产物的DNA的腺病毒衣壳)被递送到细胞。在另一个实施方式中， 使用了非感染性野生型亚组E颗粒或包装入腺病毒亚组E衣壳的重组腺病毒载 体(颗粒)。将这些病毒颗粒灭活的合适技术是本领域已知的，其中包括但不限 于，例如，UV照射(能有效交联基因组DNA从而阻止表达)。
上面引用的所有文献通过参考结合于本文。许多修饰和变化包含在上面定 义的说明书范围内，并且估计是本领域技术人员显而易见的。对组合物和方法 的这种修饰和改变，如对不同小基因或载体剂量或免疫调节物的选择被认为在 附加权利要求书的范围内。